CN113897344A - 一种具有抗炎效果的溶菌酶组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种具有抗炎效果的溶菌酶组合物,其中的活性成分溶菌酶选用白色链霉菌和/或枯草芽孢杆菌的菌体种子采用发酵工艺制备而成。本发明的溶菌酶来源天然,无毒副作用,且溶菌酶组合物制备方法可工业化,具有推广应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及药物领域,具体涉及一种溶菌酶组合物。
背景技术
溶菌酶也称为细胞壁溶解酶,是一种可以使细胞壁水解稳定碱性蛋白水解酶。它主要作用于细菌细胞壁,即作用于其肽聚糖中的N-乙酰葡萄糖胺及N-乙酰胞壁酸之间的β-1,4糖苷键,通过对其进行水解促进细菌细胞壁中的多糖分解成糖肽,降低细菌细胞壁稳定性,破坏其结构,最后导致细胞壁裂解细胞中的内容物流出胞外,致使细菌溶解。由于溶菌酶是有着上述溶菌作用的蛋白质,且对人体无毒副作用,因此还可用于食品业来制作防腐剂材料。溶菌酶是存在于人体体液或者组织中的非特异性免疫因子,有着抗菌、抗病毒和多种药理作用。
溶菌酶作为单核、中性粒细胞和巨噬细胞产物,对革兰氏阳性菌有着很显著抗菌性。此外,溶菌酶是一种存在于生物体内的碱性蛋白酶,其也是一种非特异性免疫因子,在抑制和杀死病原体时一般不会有抗药性的情况发生。溶菌酶的这种与抗生素不同的抑菌机制己经得到重视,并应用于食品及药品当中。也有文献证明溶菌酶可作为免疫调节和免疫激活剂在免疫系统中起着重要作用。
溶菌酶能结合诱导炎症反应发生的各种酸性物质,且能作为抗菌增效剂增强抗生素和其他药物的疗效,改善组织基质的黏多糖代谢,增强机体抗感染的能力,有效缓解机体炎症反应。此外血小板在溶菌酶作用下被激活,组织局部循环障碍被解除,脓液得以分解,加快了组织再生和血液凝固速度,瘢痕形成,因炎症反应导致的组织损伤得以较快修复。内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁中一种成分,只有当细菌死亡溶解或用人工方法破坏菌细胞后才释放出来,其毒性成分主要为类脂质A。内毒素位于细胞壁的最外层,覆盖于细胞壁的黏肽上。研究人员发现,氨苄西林等抗生素单独使用可导致埃希氏大肠杆菌溶解释放大量内毒素,诱导巨噬细胞释放大量白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子TNF-α。而将β-内酰胺类抗生素与溶菌酶配合使用后,细菌内毒素释放量大幅减少,TNF-α和IL-6等促炎因子的释放量随之减少。有研究报道,患有结肠炎的仔猪在饲喂蛋源溶菌酶后,IL-6、干扰素-γ(IFN-γ)和TNF-α等基因表达量显著下调,相应炎症因子分泌量显著降低。
目前,采用发酵工艺制备的溶菌酶的抗炎作用有待提升,亟需一种具有良好抗炎效果的发酵工艺制备的溶菌酶组合物。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种具有显著抗炎作用,毒副作用小,采用发酵工艺制备的溶菌酶组合物。
本发明解决上述问题所采用的技术方案是,提供一种具有抗炎效果的溶菌酶的发酵制备方法,其包括以下步骤:
(1)取液体培养基A置于锥形瓶中,灭菌冷却至30℃后,按2-6%v/v的接种量接入白色链霉菌和/或枯草芽孢杆菌的菌体种子;
(2)在25-45℃,200-300r/min的恒温振荡器中连续培养20-30h;
(3)取步骤(2)培养的种子液接种于装有灭菌液体培养基B的锥形瓶中,在25-45℃,200-300r/min的恒温振荡器中连续培养20-30h;
(4)将步骤(3)培养的发酵液通过陶瓷膜微滤,滤液通过超滤浓缩截流分子量10-30kDa的组分获得浓缩液,将浓缩液置于层析柱中,再用pH值为6.0-7.0的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液以0.1-0.3ml/min的流速对层析柱进行洗脱,收集洗脱液,冷冻干燥后获得溶菌酶产品。
优选的,所述步骤(1)中取30mL液体培养基A置于锥形瓶中。
优选的,所述步骤(1)中液体培养基A为含有1%酵母浸粉,2%胰蛋白胨和2%葡萄糖的水溶液。
优选的,所述步骤(1)中的白色链霉菌为白色链霉菌LA-7。
优选的,所述步骤(1)中的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌YT-25。
优选的,所述步骤(1)中按5%v/v的接种量接入白色链霉菌和/或枯草芽孢杆菌的菌体种子。
优选的,所述步骤(1)中按2.5%v/v的接种量接入白色链霉菌的菌体种子,同时按2.5%v/v的接种量接入枯草芽孢杆菌的菌体种子。
更优选的,所述步骤(1)中按2.5%v/v的接种量接入白色链霉菌LA-7的菌体种子,同时按2.5%v/v的接种量接入枯草芽孢杆菌YT-25的菌体种子。
优选的,所述步骤(2)中在30℃,250r/min的恒温振荡器中连续培养24h。
优选的,所述步骤(3)中液体培养基B为含有1%酵母浸粉,2%胰蛋白胨,1%无氨基酵母氮源,0.00004%生物素和1%甘油的水溶液。
优选的,所述步骤(3)中取1mL步骤(2)培养的种子液接种于装有100mL灭菌液体培养基B的锥形瓶中。
优选的,所述步骤(3)中在30℃,250r/min的恒温振荡器中连续培养24h。
优选的,所述步骤(4)中使用的层析柱为Sephedex G-50。
优选的,所述步骤(4)中使用pH值为6.5的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液以0.2ml/min的流速对层析柱进行洗脱。
本发明的第二方面提供一种溶菌酶组合物,其包括上述发酵制备方法得到的溶菌酶。
优选的,所述溶菌酶组合物中进一步包括药学上可接受的辅料。
优选的,所述溶菌酶组合物的剂型为口服制剂或注射剂。
本发明的第三方面还提供一种上述溶菌酶组合物在制备抗炎药物中的应用。
本发明具有积极有益的效果:令人惊奇的是,经过反复多次试验,本发明意外发现使用白色链霉菌LA-7和/或枯草芽孢杆菌YT-25发酵制备得到的溶菌酶产物具有优异的抗炎性能,其抗炎效果远优于现有技术已知的其它菌种发酵得到的溶菌酶以及蛋清溶菌酶。另外,本发明的溶菌酶来源天然,无毒副作用,且溶菌酶组合物制备方法可工业化,具有推广应用价值。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作更进一步的说明,但本发明的实施方式不限于此。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
实施例1、发酵工艺制备溶菌酶L1(白色链霉菌LA-7)
取30mL液体培养基A(含有1%酵母浸粉,2%胰蛋白胨和2%葡萄糖的水溶液)置于锥形瓶中,灭菌冷却至30℃后,按5%v/v的接种量接入白色链霉菌LA-7的菌体种子;在30℃,250r/min的恒温振荡器中连续培养24h;取1mL上述步骤培养的种子液接种于装有100mL灭菌液体培养基B(含有1%酵母浸粉,2%胰蛋白胨,1%无氨基酵母氮源,0.00004%生物素和1%甘油的水溶液)的锥形瓶中,在30℃,250r/min的恒温振荡器中连续培养24h;将上述步骤培养的发酵液通过陶瓷膜微滤,滤液通过超滤浓缩截流分子量10-30kDa的组分获得浓缩液,将浓缩液置于Sephedex G-50层析柱中,再用pH值为6.5的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液以0.2ml/min的流速对层析柱进行洗脱,收集洗脱液,冷冻干燥后获得溶菌酶产品L1。
实施例2、发酵工艺制备溶菌酶L2(枯草芽孢杆菌YT-25)
取30mL液体培养基A(含有1%酵母浸粉,2%胰蛋白胨和2%葡萄糖的水溶液)置于锥形瓶中,灭菌冷却至30℃后,按5%v/v的接种量接入枯草芽孢杆菌YT-25的菌体种子;在30℃,250r/min的恒温振荡器中连续培养24h;取1mL上述步骤培养的种子液接种于装有100mL灭菌液体培养基B(含有1%酵母浸粉,2%胰蛋白胨,1%无氨基酵母氮源,0.00004%生物素和1%甘油的水溶液)的锥形瓶中,在30℃,250r/min的恒温振荡器中连续培养24h;将上述步骤培养的发酵液通过陶瓷膜微滤,滤液通过超滤浓缩截流分子量10-30kDa的组分获得浓缩液,将浓缩液置于Sephedex G-50层析柱中,再用pH值为6.5的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液以0.2ml/min的流速对层析柱进行洗脱,收集洗脱液,冷冻干燥后获得溶菌酶产品L2。
实施例3、发酵工艺制备溶菌酶L3(白色链霉菌LA-7+枯草芽孢杆菌YT-25)
取30mL液体培养基A(含有1%酵母浸粉,2%胰蛋白胨和2%葡萄糖的水溶液)置于锥形瓶中,灭菌冷却至30℃后,按2.5%v/v的接种量接入枯草芽孢杆菌YT-25的菌体种子,同时按2.5%v/v的接种量接入白色链霉菌LA-7的菌体种子;在30℃,250r/min的恒温振荡器中连续培养24h;取1mL上述步骤培养的种子液接种于装有100mL灭菌液体培养基B(含有1%酵母浸粉,2%胰蛋白胨,1%无氨基酵母氮源,0.00004%生物素和1%甘油的水溶液)的锥形瓶中,在30℃,250r/min的恒温振荡器中连续培养24h;将上述步骤培养的发酵液通过陶瓷膜微滤,滤液通过超滤浓缩截流分子量10-30kDa的组分获得浓缩液,将浓缩液置于Sephedex G-50层析柱中,再用pH值为6.5的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液以0.2ml/min的流速对层析柱进行洗脱,收集洗脱液,冷冻干燥后获得溶菌酶产品L3。
对比例1、发酵工艺制备溶菌酶L4(溶杆菌S2-6b)
取30mL液体培养基A(含有1%酵母浸粉,2%胰蛋白胨和2%葡萄糖的水溶液)置于锥形瓶中,灭菌冷却至30℃后,按5%v/v的接种量接入溶杆菌S2-6b的菌体种子;在30℃,250r/min的恒温振荡器中连续培养24h;取1mL上述步骤培养的种子液接种于装有100mL灭菌液体培养基B(含有1%酵母浸粉,2%胰蛋白胨,1%无氨基酵母氮源,0.00004%生物素和1%甘油的水溶液)的锥形瓶中,在30℃,250r/min的恒温振荡器中连续培养24h;将上述步骤培养的发酵液通过陶瓷膜微滤,滤液通过超滤浓缩截流分子量10-30kDa的组分获得浓缩液,将浓缩液置于Sephedex G-50层析柱中,再用pH值为6.5的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液以0.2ml/min的流速对层析柱进行洗脱,收集洗脱液,冷冻干燥后获得溶菌酶产品L4。
对比例2、发酵工艺制备溶菌酶L5(灰色链霉菌S-35)
取30mL液体培养基A(含有1%酵母浸粉,2%胰蛋白胨和2%葡萄糖的水溶液)置于锥形瓶中,灭菌冷却至30℃后,按5%v/v的接种量接入灰色链霉菌S-35的菌体种子;在30℃,250r/min的恒温振荡器中连续培养24h;取1mL上述步骤培养的种子液接种于装有100mL灭菌液体培养基B(含有1%酵母浸粉,2%胰蛋白胨,1%无氨基酵母氮源,0.00004%生物素和1%甘油的水溶液)的锥形瓶中,在30℃,250r/min的恒温振荡器中连续培养24h;将上述步骤培养的发酵液通过陶瓷膜微滤,滤液通过超滤浓缩截流分子量10-30kDa的组分获得浓缩液,将浓缩液置于Sephedex G-50层析柱中,再用pH值为6.5的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液以0.2ml/min的流速对层析柱进行洗脱,收集洗脱液,冷冻干燥后获得溶菌酶产品L5。
试验例1、本发明发酵工艺制备的溶菌酶抗炎效果试验
1、细胞炎症模型建立
实验分组:配制LPS浓度分别为0.25mg/L、0.5mg/L、1mg/L、2mg/L和4mg/L的DMEM细胞培养液。在24孔板中加入充分混匀的细胞悬浮液1mL(每孔1×105个细胞),培养24h后移去培养基,按上述分组加入1mL样品溶液,培养24h,每组设置3个复孔。采用Griess试剂盒测定上述细胞上清液的NO含量,选择NO释放量与对照组有显著性差异的LPS浓度进行后续实验。
2、NO含量测定
在24孔板中加入充分混匀的细胞悬浮液1mL(每孔1×105个细胞),培养24h,弃去培养基,进行分组实验,每组设3个复孔。实验分组如下:正常对照组(不加药物和LPS)、LPS模型组(1mg/L LPS)、试验组1(1mg/L LPS+1mg/mL实施例1的溶菌酶L1溶液)、试验组2(1mg/L LPS+1mg/mL实施例2的溶菌酶L2溶液)、试验组3(1mg/L LPS+1mg/mL实施例3的溶菌酶L3溶液)、试验组4(1mg/L LPS+1mg/mL对比例1的溶菌酶L4溶液)、试验组5(1mg/L LPS+1mg/mL对比例2的溶菌酶L5溶液)和试验组6(1mg/L LPS+1mg/mL蛋清溶菌酶L6溶液)。除正常对照组以外,其余各组先加入1ml含1mg/L LPS的DMEM细胞培养液(即LPS加入量均为1mg),培养24h,弃去培养液,再按上述分组加入总计1ml的含溶菌酶的各组样品DMEM细胞培养液(即溶菌酶溶解于DMEM细胞培养液,每个试验组中活性成分溶菌酶的总加入量均为1mg),培养24h,收集细胞上清液,采用Griess试剂盒测定不同样品对RAW264.7细胞释放NO的含量,具体试验结果如下表1所示。
表1本发明发酵溶菌酶对RAW264.7细胞释放NO含量的影响
试验组 | NO含量(μmol/L) |
正常对照组 | 5.8 |
LPS模型组 | 37.2 |
试验组1(实施例1溶菌酶L1) | 17.9 |
试验组2(实施例2溶菌酶L2) | 16.2 |
试验组3(实施例3溶菌酶L3) | 10.4 |
试验组4(对比例1溶菌酶L4) | 24.9 |
试验组5(对比例2溶菌酶L5) | 25.8 |
试验组6(蛋清溶菌酶L6) | 27.4 |
如上表1试验结果所示,本发明采用特定发酵用菌种(白色链霉菌LA-7和/或枯草芽孢杆菌YT-25),通过发酵工艺制备的试验组1-3的溶菌酶(L1-L3)可以显著降低RAW264.7细胞的NO释放量,其对RAW264.7细胞炎症改善作用明显优于其他发酵用菌种(例如试验组4-5中对比例1-2制备的溶菌酶L4-L5)。特别是在菌体种子的接种总量不变的基础上,使用白色链霉菌LA-7和枯草芽孢杆菌YT-25复合菌种发酵制备的溶菌酶L3较单独使用白色链霉菌LA-7或枯草芽孢杆菌YT-25菌种发酵制备的溶菌酶L1或L2,对RAW264.7细胞的NO释放量进一步降低,证明上述特定复合菌体发酵制备得到的溶菌酶产生了难以预期的优异抗炎效果,有望在产业上推广应用。
Claims (10)
1.一种具有抗炎效果的溶菌酶的发酵制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)取液体培养基A置于锥形瓶中,灭菌冷却至30℃后,按2-6%v/v的接种量接入白色链霉菌和/或枯草芽孢杆菌的菌体种子;
(2)在25-45℃,200-300r/min的恒温振荡器中连续培养20-30h;
(3)取步骤(2)培养的种子液接种于装有灭菌液体培养基B的锥形瓶中,在25-45℃,200-300r/min的恒温振荡器中连续培养20-30h;
(4)将步骤(3)培养的发酵液通过陶瓷膜微滤,滤液通过超滤浓缩截流分子量10-30kDa的组分获得浓缩液,将浓缩液置于层析柱中,再用pH值为6.0-7.0的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液以0.1-0.3ml/min的流速对层析柱进行洗脱,收集洗脱液,冷冻干燥后获得溶菌酶产品。
2.根据权利要求1所述的发酵制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中的白色链霉菌为白色链霉菌LA-7,枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌YT-25。
3.根据权利要求1所述的发酵制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中按2.5%v/v的接种量接入白色链霉菌的菌体种子,同时按2.5%v/v的接种量接入枯草芽孢杆菌的菌体种子。
4.根据权利要求1所述的发酵制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中按2.5%v/v的接种量接入白色链霉菌LA-7的菌体种子,同时按2.5%v/v的接种量接入枯草芽孢杆菌YT-25的菌体种子。
5.根据权利要求1所述的发酵制备方法,其特征在于,所述步骤(2)中在30℃,250r/min的恒温振荡器中连续培养24h。
6.根据权利要求1所述的发酵制备方法,其特征在于,所述步骤(3)中在30℃,250r/min的恒温振荡器中连续培养24h。
7.根据权利要求1所述的发酵制备方法,其特征在于,所述步骤(4)中使用的层析柱为Sephedex G-50。
8.根据权利要求1所述的发酵制备方法,其特征在于,所述步骤(4)中使用pH值为6.5的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液以0.2ml/min的流速对层析柱进行洗脱。
9.一种溶菌酶组合物,其特征在于,包含权利要求1-8任一项所述发酵制备方法得到的溶菌酶。
10.权利要求9所述的溶菌酶组合物在制备抗炎药物中的应用。
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