CN1693445A - 一种高活性α－半乳糖苷酶的黑曲霉变种及其在固态基质上的发酵工艺 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高活性α－半乳糖苷酶的黑曲霉变种，孢子黄褐色，于2004年6月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会，其保藏号为CGMCC No.1182。该菌种的生物学特性为：菌落在查氏培养基上生长适度，25℃，7天，直径45－70mm；质地绒毛状或稍带颗粒状；分生孢子结构大量，浅褐色，无渗出液；菌落反面略带黄色。本发明有益的效果是：利用本发明提供的高活性α－半乳糖苷酶黑曲霉变种，采用固体发酵法可产生高活性的α－半乳糖苷酶，其发酵产物(干曲)的酶活平均可达286IU/g，最高可达345IU/g，比国际上同类产品酶活44－56IU/g，高出5倍，比国内报导的同类技术生产的产品酶活126IU/g，高出2.26倍。

Description

一种高活性α-半乳糖苷酶的黑曲霉变种 及其在固态基质上的发酵工艺

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种高活性α-半乳糖苷酶的黑曲霉变种及其在固态基质上的发酵工艺。

背景技术

α-半乳糖苷酶是一种催化α-半乳糖苷类物质分解成低聚寡糖、蔗糖及果糖等单糖的酶类，广泛存在于微生物、植物、动物中。α-半乳糖苷酶在食品、医药工业各方面都具有很重要的应用价值。在甜菜制糖工业中，糖蜜中的棉子糖经α-半乳糖苷酶分解，不仅能提高产率，还能提高提高效率。此外，在医药上和多糖树胶的改性上也有着广泛的应用。近年来研究表明，该酶作为一种特异性外源饲用酶，在饲料工业中也有着广泛的应用前景。在豆类籽实和饼粕饲料中有较高的α-半乳糖苷类物质的存在，这类物质不仅降低了饲料的营养价值，而且在动物后肠中易引起食糜滞留，导致肠道胀气，消化紊乱，引发胰腺增大、下痢等疾病。在以豆饼、杂粕等为日粮的饲料中添加α-半乳糖苷酶和其他酶协同作用，可有效提高饲料的利用率，消除由α-半乳糖苷类物质引起的抗营养作用。具有高活性的α-半乳糖苷酶生产菌的选育及高效能的发酵工艺是提供廉价α-半乳糖苷酶制剂，使该产品实行产业化生产的关键前提。

发明内容

本发明要解决上述现有技术的缺陷，提供一种高活性α-半乳糖苷酶的黑曲霉变种及其在固态基质上的发酵工艺。

本发明解决其技术问题采用的技术方案。本发明所述的为一种高活性α-半乳糖苷酶的黑曲霉变种(Aspergillus nuger v.Tiegh)，孢子黄褐色。

本发明提供的高活性α-半乳糖苷酶的黑曲霉变种的生物学特性为，菌落在查氏培养基上生长适度，25℃，7天，直径45-70mm；质地绒毛状或稍带颗粒状；分生孢子结构大量，浅褐色，无渗出液；菌落反面略带黄色。分生孢子头球形至辐射形，直径150-450微米；分生孢子梗发生于基质，孢梗茎1000-3000×12-20微米，黄色或黄褐色，壁平滑；顶囊球形或近球形，直径40-70微米，全部表面可育；产孢结构双层，梗基10-20×4.5-7.0微米，瓶梗6-9×2.5-3.0微米，分生孢子球形或近球形，直径3-4.5微米，壁粗糙。

本发明提供的黑曲霉变种，采用固态发酵工艺，可产生高活性的α-半乳糖苷酶。该发酵工艺具有原材料易得，工艺简单，酶活性高、单位酶活生产成本低廉的特点。可有效分解富含饼粕饲料中的α-半乳糖苷类物质，提高畜禽生产性能。

本发明的高活性α-半乳糖苷酶的黑曲霉变种的诱变选育过程为：

1.出发菌株的选择

本单位保存若干黑曲霉菌种以及从中科院微生物所、中科院土壤所、上海工业微生物所引进的若干分枝犁头霉、蝇卷霉等菌种及从土壤样本中分离获得的不同菌属的菌种，在选择性培养基上经初筛、复筛，获得一株代号为R15#的黑曲霉菌株产α-半乳糖苷酶活性最高，达83U/g干基。选定该菌株作为进一步诱变选育的出发菌株。

2.菌株的复合诱变选育

将在马铃茹葡萄糖琼脂(PDA)斜面上生长成熟的R15#菌株的新鲜孢子，用无菌水洗下，并制成单孢子悬浮液(孢子浓度在10⁷-10⁸个/ml)。分别取2ml单孢子悬浮液于试管，置钴源室进行辐照处理。处理剂量为0(ck)，3Mraed，5Mraed，7Mraedt 10Mraed。经Co⁶⁰辐照处理后，吸取各处理的悬浮液，逐步稀释10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷倍，涂布于PDA平板培养基上，每个稀释度3个平板，28-30℃下培养72-96小时后，挑取不同形状的单孢菌落于PDA斜面，在28-30℃下培养72-96小时后，进行诱变菌种的三角瓶固体发酵的初筛、复筛，获得目的菌株RC32#，酶活达125U/g干基。

进一步将RC32#菌进行多次紫外线照射和亚硝基胍复合诱变，获得一株高活性α-半乳糖苷酶的黑曲霉变种RM45#，产酶活性达175U/g干基。

所述的斜面保藏培养基：为马铃茹葡萄糖琼脂(PDA)：去皮马铃茹20克切成小块后加水100ml煮沸30min，四层纱布过滤后，加入葡萄糖2克，琼脂2克，并补足水分至100ml。

所述的筛选用固体发酵培养基为：麸皮85％，豆粕13％，无机盐2％。加水使含水率达到55％-60％。

本发明的高活性α-半乳糖苷酶黑曲霉变种可运用固体发酵工艺，制备出高效能的α-半乳糖苷酶制剂应用于饲料工业或制糖工业。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案。利用本发明提供的高活性α-半乳糖苷酶黑曲霉变种，其固体发酵生产α-半乳糖苷酶的制备工艺流程为：

1.将本发明的黑曲霉变种RM45#接种在PDA斜面上，于28-30℃下恒温培养72-96小时，成熟(长出丰满孢子)后，用无菌水制成孢子悬浮液，待用。

所述PDA斜面为马铃茹葡萄糖琼脂培养基，其组成为：去皮马铃茹20克切成小块，加水100ml煮沸30min，四层纱布过滤后，加入葡萄糖2克，琼脂2克，并补足水分至100ml。

2.将产酶种子培养基经121℃，30min灭菌。冷却后，按1-5％量接入斜面菌种孢子悬浮液，最后接种后的固体种子培养基，于28-30℃下恒温培养72-96小时。成熟(长出丰满孢子)后，注入冷却的无菌水充分搅拌，用四层纱布在无菌条件下过滤，得到产酶菌种孢子悬浮液，待用。

所述的产酶种子培养基为：麸皮99％，(NH₄)₂SO₄ 1％，加水使培养基含水率达55％-60％。

3.发酵培养基经121℃，30min灭菌，冷却后，按1-5％(V/W)接种量接入产酶种孢子悬浮液，充分搅拌混匀后，装入500ml三角瓶(每瓶20g)，于30℃培养3d；发酵培养过程中，于培养10h起，每隔10h振荡一次，连续3-4次，50h后静止培养，直至发酵结束。

所述的后处理是：1)、发酵结束后的产物，置40℃，鼓风条件下，经15-24h烘干。2)、烘干后的发酵产物，粉碎，过80目筛，得酶干曲。并按所述酶活性试验方法检测。

所述的发酵培养基为：麸皮75％，豆粕粉15％，鱼粉3％，(NH₄)₂SO₄ 3％，产酶诱导剂4％，加水使培养基含水率达55％-60％。

本发明有益的效果是：利用本发明提供的高活性α-半乳糖苷酶黑曲霉变种，采用上述固体发酵法生产α-半乳糖苷酶，其发酵产物(干曲)的酶活平均可达286IU/g，最高可达345IU/g，比国际上同类产品酶活44-56IU/g，高出5倍，比国内报导的同类技术生产的产品酶活126IU/g，高出2.26倍。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步介绍：

实施例1：

一、菌种培养：

1、斜面菌种培养：将本发明的黑曲霉变种RM45#接种在马铃茹葡萄糖琼脂培养基(PDA)斜面上，于28-30℃下恒温培养72-96小时，待长出丰满黄褐色孢子后，用无菌水制成孢子悬浮液(浓度为10⁷-10⁸个/ml)，待用。

2.固体种子培养：将1.5kg麸皮以1∶1.2-1.5的比例加入1％的(NH₄)₂SO₄溶液，充分混匀后，制成固体种子培养基。该培养基经121℃，30min灭菌，冷却后，按1-5％量接入斜面菌种孢子悬浮液，充分搅拌均匀，按每瓶500ml三角瓶装入30克含水且接种的培养基。

3.接种后的固体种子培养基，于28-30℃下恒温培养72小时。待培养基表层和内部长出丰满黄褐色孢子后，取出，置4℃冰箱，待用。

二、产酶发酵培养：

1、取培养成熟待用的固体种子三角瓶，注入冷却的无菌水充分搅拌，用四层纱布在无菌条件下过滤，得到菌种孢子悬浮液。再用无菌水稀释成孢子浓度为10⁷-10⁸个/ml的产酶菌种孢子悬浮液。

2.将发酵培养基按麸皮75％，豆粕粉15％，鱼粉3％，(NH₄)₂SO₄ 3％，产酶诱导剂4％的比例充分混合，加水使培养基含水率达55％-60％，配制成产酶发酵培养基，装入由二层棉布缝制的布袋。该产酶发酵培养基经121℃，30min灭菌，冷却后，按1-5％(V/W)接种量接入产酶种孢子悬浮液，充分搅拌混匀后，装入无菌透气方盘(60cm×40cm×10cm)，并用保湿透气半装置盖于方盘上，以控制培养过程的温、湿度。

3.将接种后的方盘置于30℃培养恒温条件下培养65-72小时。发酵培养过程中，于培养10h起，每隔10h翻曲一次，连续3-4次，50h后静止培养，直至发酵结束。

三、后处理：

1.发酵结束后的产物，置40℃，鼓风条件下，经15-24h烘干。

2.烘干后的发酵产物，粉碎，过80目筛，得酶干曲。并按所述酶活性试验方法检测。

四、结果：

每批发酵产物按四分法取样，共取样品三批次，按本发明所述α-半乳糖苷酶活性测定方法，测定三批次的酶活，结果如下：

批次        酶活(IU/g)

No1         263

No2         251

No3         284

平均        266

实施例2：

一、菌种培养：

1、斜面菌种培养：将本发明的黑曲霉变种RM45#接种在马铃茹葡萄糖琼脂培养基(PDA)斜面上，于28-30℃下恒温培养96小时，待长出丰满黄褐色孢子后，用无菌水制成孢子悬浮液(浓度为10⁷-10⁸个/ml)，待用。

2.固体种子培养：将1.5kg麸皮以1∶1.2-1.5的比例加入1％的(NH₄)₂SO₄溶液，充分混匀后，制成固体种子培养基。该培养基经121℃，30min灭菌，冷却后，按1-5％量接入斜面菌种孢子悬浮液，充分搅拌均匀，按每瓶500ml三角瓶装入30克含水且接种的培养基。

3.接种后的固体种子培养基，于28-30℃下恒温培养72小时。待培养基表层和内部长出丰满黄褐色孢子后，取出，置4℃冰箱，待用。

二、产酶发酵培养：

1、取培养成熟待用的固体种子三角瓶，注入冷却的无菌水充分搅拌，用四层纱布在无菌条件下过滤，得到菌种孢子悬浮液。再用无菌水稀释成孢子浓度为10⁷-10⁸个/ml的产酶菌种孢子悬浮液。

2.将发酵培养基按麸皮75％，豆粕粉15％，鱼粉3％，(NH₄)₂SO₄ 3％，产酶诱导剂4％的比例充分混合，加水使培养基含水率达55％-60％，配制成产酶发酵培养基，装入由二层棉布缝制的布袋。该产酶发酵培养基经121℃，30min灭菌，冷却后，按1-5％(V/W)接种量接入产酶种孢子悬浮液，充分搅拌混匀后，装入无菌透气方盘(60cm×40cm×10cm)，并用保湿透气装置盖于方盘上，以控制培养过程的温、湿度。

3.将接种后的方盘置于30℃培养恒温条件下培养65-72小时。发酵培养过程中，于培养10h起，每隔10h翻曲-次，连续3-4次，50h后静止培养，直至发酵结束。

三、后处理：

1.发酵结束后的产物，置40℃，鼓风条件下，经15-24h烘干。

2.烘干后的发酵产物，粉碎，过80目筛，得酶干曲。并按所述酶活性试验方法检测。

四、结果：

每批发酵产物按四分法取样，共取样品三批次，按本发明所述α-半乳糖苷酶活性测定方法，测定三批次的酶活，结果如下：

批次        酶活(IU/g)

No1         285

No2         345

No3         312

平均        314

实施例3：

一、菌种培养：

1、斜面菌种培养：将本发明的黑曲霉变种RM45#接种在马铃茹葡萄糖琼脂培养基(PDA)斜面上，于28-30℃下恒温培养72-96小时，待长出丰满黄褐色孢子后，用无菌水制成孢子悬浮液(浓度为10⁷-10⁸个/ml)，待用。

2.固体种子培养：将1.5kg麸皮以1∶1.2-1.5的比例加入1％的(NH₄)₂SO₄溶液，充分混匀后，制成固体种子培养基。该培养基经121℃，30min灭菌，冷却后，按1-5％量接入斜面菌种孢子悬浮液，充分搅拌均匀，按每瓶500ml三角瓶装入30克含水且接种的培养基。

3.接种后的固体种子培养基，于28-30℃下恒温培养72小时。待培养基表层和内部长出丰满黄褐色孢子后，取出，置4℃冰箱，待用。

二、产酶发酵培养：

1、取培养成熟待用的固体种子三角瓶，注入冷却的无菌水充分搅拌，用四层纱布在无菌条件下过滤，得到菌种孢子悬浮液。再用无菌水稀释成孢子浓度为10⁷-10⁸个/ml的产酶菌种孢子悬浮液。

2.将发酵培养基按麸皮75％，豆粕粉15％，鱼粉3％，(NH₄)₂SO₄ 3％，产酶诱导剂4％的比例充分混合，加水使培养基含水率达55％-60％，配制成产酶发酵培养基，装入由二层棉布缝制的布袋。该产酶发酵培养基经121℃，30min灭菌，冷却后，按1-5％(V/W)接种量接入产酶种孢子悬浮液，充分搅拌混匀后，装入无菌透气方盘(60cm×40cm×10cm)，并用保湿透气半装置盖于方盘上，以控制培养过程的温、湿度。

3.将接种后的方盘置于30℃培养恒温条件下培养65-72小时。发酵培养过程中，于培养10h起，每隔10h翻曲一次，连续3-4次，50h后静止培养，直至发酵结束。

三、后处理：

1.发酵结束后的产物，置40℃，鼓风条件下，经15-24h烘干。

2.烘干后的发酵产物，粉碎，过80目筛，得酶干曲。并按所述酶活性试验方法检测。

四、结果：

每批发酵产物按四分法取样，共取样品三批次，按本发明所述α-半乳糖苷酶活性测定方法，测定三批次的酶活，结果如下：

批次         酶活(IU/g)

No1          279

No2          265

No3          296

平均         280

采用对硝基苯酚法测定所得α-半乳糖苷酶制剂中的α-半乳糖苷酶活性的方法如下：

一、酶活单位定义：

在pH4.0、40℃条件下，每分钟降解对硝基酚α-D-吡喃半乳糖苷释放出1μmol对硝基酚的酶量为1个α-半乳糖苷酶活单位，简称为IU。

二、仪器设备：

UV1100紫外-可见分光光度计(北京瑞利分析仪器厂)、恒温水浴锅、酸度计(精度±0.01pH)、分析天平(感量0.1mg)、秒表或定时钟。

三、试剂：

1、对硝基酚(p-NPH)标准溶液：

精确称取对硝基酚(简称p-NPH，Sigma公司出品，批号：117H5057)100mg，用蒸馏水溶解，并定容至100ml。然后配制成浓度分别为0，10μg.mL^-1，20μg.mL^-1，30μg.mL^-1，40μg.mL^-1，50μg.mL^-1的对硝基酚标准溶液以制成标准曲线。

2、对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖(p-NPG)溶液(Fluka公司出品，批号WA13251)：

精确称取对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖150.5mg，用蒸馏水溶解，定容至100ml。冷冻保藏。

3、0.5M Na₂CO₃溶液：精确称取无水碳酸钠53克，用蒸馏水溶解，定容至1000ml。

4、pH4.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液：

甲液：称取磷酸氢二钠(Na₂HPO₄.2H₂O)35.61g，用蒸馏水溶解，并定容至1000ml。

乙液：称取柠檬酸(C₆H₈O₇.H₂O)21.01g，用蒸馏水溶解，并定容至1000ml。

使用溶液：取甲液385.5ml，加乙液614.5ml混合均匀，用pH计校正至pH为(4.0±0.05)，备用。

5、酶液制备

称取酶干曲2.000克，加蒸馏水40ml，于40℃浸泡30min，期间搅拌3-4次。然后用蒸馏水定容至100ml，用新华1号滤纸过滤，取滤液用于测定酶活。

四、测定方法：

1、对硝基酚标准曲线绘制：

分别吸取不同浓度的对硝基酚标准溶液0.5ml(每号作3支平行管)，加pH4.0缓冲液1.5ml，0.5M Na₂CO₃溶液2.0ml。充分发摇匀后，以0.5Ma蒸馏水代替对硝基酚标准溶液的试管为空白，于分光光度计在吸光度为400nm处，用5mm比色皿比色。以吸光度(OD值)为横座标，以对硝基酚浓度为纵坐标，绘制标准曲线，或计算K值。

2、测定步骤

吸取经适当稀释的待测酶液0.5ml加pH4.0缓冲液1.0ml，于40℃水浴预热5min，底物也同时预热。加入5m mol/L的p-NPG底物0.5ml于各试管中，立即计时。精确反应10min，立即加入0.5M Na₂CO₃溶液2.0ml中止反应。取出，于分光光度计400nm处比色(用5mm比色皿)。空白管在加入酶液和缓冲液后，即加入2ml 0.5M Na₂CO₃，反应结束后再加入0.5ml底物。

1.3.2.3计算：由比色测获得的ABS(OD)值，以回归计算法，(或用K值)按下式计算α-半乳糖苷酶活力A2(IU.g^-1)

$A=\frac{[(A_x-A_0)\×K+C_0]\×N}{t\×W\×139}$

式中：A_x----样品吸光度OD值，A₀----空白管吸光度OD值，

K----对硝基酚标准曲线斜率， C₀---对硝基酚标准曲线截距，

N---样品总稀释倍数，        t----反应时间，

W：称取酶制剂的重量(g)，    139----对硝基酚分子量。

Claims (4)

1、一种高活性α-半乳糖苷酶的黑曲霉变种，其特征在于，为一种高活性α-半乳糖苷酶的黑曲霉变种(Aspergillus nuger v.Tiegh)，孢子黄褐色，于2004年6月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会，其保藏号为CGMCC No.1182。

2、根据权利要求1所述的高活性α-半乳糖苷酶黑曲霉变种，其特征在于，该高活性α-半乳糖苷酶黑曲霉变种的生物学特性为：菌落在查氏培养基上生长适度，25℃，7天，直径45-70mm；质地绒毛状或稍带颗粒状；分生孢子结构大量，浅褐色，无渗出液；菌落反面略带黄色。分生孢子头球形至辐射形，直径150-450微米；分生孢子梗发生于基质，孢梗茎1000-3000×12-20微米，黄色或黄褐色，壁平滑；顶囊球形或近球形，直径40-70微米，全部表面可育；产孢结构双层，梗基10-20×4.5-7.0微米，瓶梗6-9×2.5-3.0微米，分生孢子球形或近球形，直径3-4.5微米，壁粗糙。

3、一种根据权利要求1所述高活性α-半乳糖苷酶的黑曲霉变种在固态基质上的发酵工艺，其特征在于：

1)、将上述的黑曲霉变种接种在PDA斜面上，于28-30℃下恒温培养72-96小时，长出丰满孢子即成熟后，用无菌水制成孢子悬浮液，待用；其中PDA斜面为马铃茹葡萄糖琼脂培养基，其组成为：去皮马铃茹20克切成小块，加水100ml煮沸30min，四层纱布过滤后，加入葡萄糖2克，琼脂2克，并补足水分至100ml；

2)、将产酶种子培养基经121℃，30min灭菌；冷却后，按1-5％量接入斜面菌种孢子悬浮液，最后接种后的固体种子培养基，于28-30℃下恒温培养72-96小时；长出丰满孢子即成熟后，注入冷却的无菌水充分搅拌，用四层纱布在无菌条件下过滤，得到产酶菌种孢子悬浮液，待用；所述的产酶种子培养基为：麸皮99％，(NH₄)₂SO₄1％，加水使培养基含水率达55％-60％；

3)、发酵培养基经121℃，30min灭菌，冷却后，按1-5％(V/W)接种量接入产酶种孢子悬浮液，充分搅拌混匀后，装入500ml三角瓶，于30℃培养3d；发酵培养过程中，于培养10h起，每隔10h振荡一次，连续3-4次，50h后静止培养，直至发酵结束；其中的发酵培养基为：麸皮75％，豆粕粉15％，鱼粉3％，(NH₄)₂SO₄3％，产酶诱导剂4％，加水使培养基含水率达55％-60％。

4、根据权利要求3所述高活性α-半乳糖苷酶的黑曲霉变种在固态基质上的发酵工艺，其特征是：进行后处理工序，具体为：1)、发酵结束后的产物，置40℃，鼓风条件下，经15-24h烘干；2)、烘干后的发酵产物，粉碎，过80目筛，得酶干曲；并按所述酶活性试验方法检测。