CN1498865A - 一种渔用微生态养水剂及其制备方法 - Google Patents

一种渔用微生态养水剂及其制备方法 Download PDF

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施庆珊
李良秋
吴家俊
许虹
林小平
邱玉棠
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Abstract

本发明涉及一种用于淡、海水水产养殖系统内水质调控和病害防治微生态养水剂及其制备方法。以具有一些特殊功能的微生物包括凝结芽孢杆菌1.949(Bcillus coagulans)、产朊假丝酵母AS2.1180(Candida utilis)、类球红假单胞菌1.1737(Rhodospseudomonas sphaerioide)等，这些菌株经无菌发酵后取得的培养液并添加适量的维生素B和维生素C浓缩液制备而成。产品适合在淡、海水水产养殖过程中进行水质调节，促进藻类生长，改善水色，同时可以提高养殖体的抗病能力，是一种高效的渔用微生态养水剂，兼有养水和抗病的功效，在淡、海水养殖全过程均可使用。

Description

一种渔用微生态养水剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种用于淡、海水水产养殖系统内水质调控和病害防治的微生态养水剂及其制备方法。
技术背景：
随着水产养殖业的不断发展，养殖规模的不断扩大，集约化程度的不断提高以及池塘老化、水质环境污染、管理与技术措施滞后等诸多原因，水产动植物病害时有发生，新的病害不断涌现，有的已呈暴发性趋势。以中国为例：初步统计，目前人工养殖的鱼、虾、贝、藻、蟹、鳖、蛙等水产动植物的主要病害就有200余种以上，每年我国因病害所造成的产量损失就达15-30％，全国约有10-15％的养殖面积受到不同程度的影响，直接经济损失达数十亿元，并有继续加重的局势。水产动植物病害已严重地制约着渔业的发展。俗话说，“养鱼先养水”，水质的好坏直接影响着养殖体是否能健康生长。中国自20世纪90年代引进有效微生物菌群(EM)基本技术，在90年代中后期开始开发出一些产品，至今微生物制剂的产品已不少，但很多只是对EM技术的简单模仿，由于EM技术中的EM是″有效微生物菌群″的英文缩写，它是日本的琉球大学比嘉照夫教授研制出来的新型复合微生物菌剂，这种菌剂是由光合细菌、放线菌、酵母菌、乳酸菌等10个属80多种微生物复合培养而成的。目前，EM技术在日本，以色列，美国等农业强国都有应用，而且取得了非常好的效果。但EM技术是一种通用技术，用于提高农业、牧业、林业、水产业的生产能力，在治理环境、保护环境以及人类保健等方面，都有着一定的作用，但在具体进行EM生产时，由于成本等原因，不可能80多种分开培养后来混合制成微生物制剂，由于不同微生物的营养要求和培养条件相差很大，也不可能一起培养，同时，由于用途的不同，能够有效发挥作用的微生物和起主导作用的微生物也不同，比如在养殖业上要求具备以下功能微生物：①能改善水质环境，降解残余饲料，消除养殖体粪便恶臭；②提高养殖体的防病抗病能力，提高成活率；③改善养殖体的肠道微生物环境，使有益微生物定植于肠道，有利于养殖体吸收营养，明显提高繁殖率和日增重；④促进水体中绿色藻类生长，提高水中溶解氧。
本发明所述的微生态养水剂就是根据养殖业的特点分离和筛选出具有不同功能的微生物，并把它们专门设计、组合成能高效发挥群体功能优势的一种渔用微生态制剂，同时在这种微生态制剂还专门加入维生素B和维生素C，更进一步提高养殖体的营养吸收和抗病能力，是一种高效渔用微生态养水剂，兼有养水和抗病的功效，它包括如下6种的微生物：凝结芽孢杆菌1.949(Bcilluscoagulans)、产朊假丝酵母AS2.1180(Candida utilis)、类球红假单胞菌1.1737(Rhodospseudomonas sphaerioide)、醋化醋杆菌1.117(Acetoberbacteraceti)、发酵乳杆菌AS1.122(Lactbacillus fermentum)和地衣芽孢杆菌1.105(Bacillus licheniformis)，它们各自发挥不同的功能。
凝结芽孢杆菌，它可以产生大量有益代谢产物，同时分泌一些杀菌物质，杀死或抑制腐败菌和其它有害微生物的生长，维持养殖体肠道吸收，而且其代谢产物，可促进肠蠕动，帮助养殖体消化吸收，同时对不良环境的抵抗力强，特别是抗高温、抗高胃酸的能力强，在肠道的定植性也强，这更增添了它的优点。
类球红假单胞菌是一种以光为能源进行营养繁殖的微生物。其菌体含有丰富的蛋白质、多种维生素，以及生物素、类胡萝卜素、辅酶Q等生活活性物质。它还具独特的生理功能，即能够吸收水体中氨和氮、亚硝酸盐硫化氢以及有机酸等，消除水体环境中的有害物质，使水质得到净化，病原菌难以发展。同时，可以促进水中绿色藻类的生长，增加水中溶解氧。
醋化醋杆菌，它从类球红假单胞菌中摄取糖类固态氮，然后一部分供给绿色藻类，另一部分再还给这种光合细菌，形成好气性和嫌气性细菌结构的共生态，形成一种益生菌群。益生菌群作为一个功能群体，采用适当的比例和独特的发酵工艺把经过仔细筛选出来的好气性和嫌气性有益微生物混合培养，形成多种多样的微生物群落，它们在生长过程中产生有用物质及其分泌物质成为各自或相互生长的基质(食物)，正是通过这样一种共生增殖关系，组成了复杂而稳定的微生态系统，使得它们具备功能齐全的优势。同时醋化醋杆菌分泌的代谢产物对很多有害病原菌有拮抗作用。
地衣芽孢杆菌，在生长代谢过程中产生多组分抗菌活性物质，已知者有短杆菌肽、枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素和头孢菌素C等，故对致病菌和内源性感染的条件致病菌，具有明显的拮抗作用，有促进巨噬细胞非特异性吞噬作用。同时，对不良环境的抵抗力也强，在不同的环境条件下均能生长繁殖。
发酵乳杆菌是乳酸菌的一种，乳酸具有很强的杀菌能力，能有效抑制有害微生物的活动，以及有机物的急剧腐败分解。乳酸菌能够使常态下不易分解的木质素和纤维素等变得容易分解，并且消除未分解有机物产生的种种弊端，在有机物发酵分解上发挥突击队的重要作用，它将未腐熟的有机物质转化成对动植物有效的养份。乳酸菌的另一个重要作用，就是能够抑制连作障碍产生的致病菌增殖。
产朊假丝酵母能利用氨基酸、糖类及其它有机物质产生发酵力，产生出促进细胞分裂的活性化物质。酵母菌在EM集团军中对于促进其它的有效微生物(如乳酸菌、放线菌)增殖所需要的基质(食物)的生产提供重要的给养保障。此外，酵母菌生产的单细胞蛋白是动物不可缺少的有效养份。
醋化醋杆菌，它从光合细菌中摄取糖类和固态氮，然后一部分供给绿色藻类，另一部分再还给光合细菌，形成好气性和嫌气性细菌构成的共生态，形成一种益生菌群。益生菌群作为一个功能群体，它们在生长过程中产生有用物质及其分泌物质成为各自或相互生长的基质(食物)，正是通过这样一种共生增殖关系，组成了复杂而稳定的微生态系统，使得它们具备功能齐全的优势。同时醋化醋杆菌分泌的代谢产物对很多有害病原菌有拮抗作用。
本发明所提供的高效渔用微生态制剂是由6种不同微生物通过无菌发酵而制得的微生物发酵液，在该发酵液中含有凝结芽孢杆菌1.949(Bcilluscoagulans)、产朊假丝酵母AS2.1180(Candida utilis)、类球红假单胞菌1.1737(Rhodospseudomonas sphaerioide)、醋化醋杆菌1.117(Acetoberbacteraceti)、发酵乳杆菌AS1.122(Lactbacillus fermentum)和地衣芽孢杆菌1.813(Bacillus licheniformis)，六种菌浓度达5×109cfu/ml以上。
所述六种菌的具体资料是：1、凝结芽孢杆菌1.949(Bcillus coagulans)保藏于CGMCC，中国普通微生物菌种保藏中心；2、产朊假丝酵母AS2.1180(Candida utilis)保藏于CGMCC，中国普通微生物菌种保藏中心；3、类球红假单胞菌1.1737(Rhodospseudomonas sphaerioide)保藏于CGMCC，中国普通微生物菌种保藏中心；4、醋化醋杆菌1.117(Acetoberbacter aceti)保藏于CGMCC，中国普通微生物菌种保藏中心；5、发酵乳杆菌AS1.122(Lactbacillus fermentum)保藏于CGMCC，中国普通微生物菌种保藏中心；6、地衣芽孢杆菌1.813(Bacillus licheniformis)保藏于CGMCC，中国普通微生物菌种保藏中心。
上述菌种在《中国普通微生物菌种保藏中心菌种目录》(中国微生物菌种保藏管理委员会等编著，主编：周宇光，1997，第二版，中国农业科技出版社出版)和《中国菌种目录》(中国微生物菌种保藏管理委员会编著，1983，轻工业出版社出版)上已公开记载，其中《中国菌种目录》(中国微生物菌种保藏管理委员会编著，1983，轻工业出版社出版，P122)上公开记载，其中醋化醋杆菌1.117(Acetoberbacter aceti)、凝结芽孢杆菌1.949(Bcilluscoagulans)、类球红假单胞菌1.1737(Rhodospseudomonas sphaerioide)分别记载在《中国普通微生物菌种保藏中心菌种目录》的P1、P7、P51等页面，地衣芽孢杆菌1.813(Bacillus licheniformis)、发酵乳杆菌AS1.122(Lactbacillus fermentum)和产朊假丝酵母AS2.1180(Candida utilis)分别记载在《中国菌种目录》P55、P122、P291等页面。
本发明所要解决的技术问题：提供一种具有不同功能、能高效发挥群体功能优势的高浓度微生物菌群的渔用微生态制剂及其生产方法，它通过6种不同微生物的简单组合，高效发挥养水和抗病的功效，使生产方便、所含微生物浓度高、功效明显。
本发明解决技术问题所采用的方案：
一、采用菌株：凝结芽孢杆菌1.949(Bcillus coagulans)、产朊假丝酵母AS2.1180(Candida utilis)、类球红假单胞菌1.1737(Rhodospseudomonassphaerioide)、醋化醋杆菌1.117(Acetoberbacter aceti)、发酵乳杆菌AS1.122(Lactbacillus fermentum)和地衣芽孢杆菌1.813(Bacilluslicheniformis)。类球红假单胞菌1.1737从保藏斜面种直接入盛在透明容器的液体培养基中，然后密封透明容器，置于自然光下培养。其它五个菌种中的任何一个菌种都经保藏斜面种、生产斜面种、一级液体活化种的阶段，然后接入二级液体活化种(种子罐)，最终进入发酵罐培养。
二、培养基的配制：
1.类球红假单胞菌培养基的配制：
a)保藏斜面种培养基(g/L)：牛肉膏1.5，酵母膏1.5，胰蛋白胨5.0，
  葡萄糖1.0，NaCl，K2HPO4 4.8，KH2PO4 1.32，琼脂20，深井水1000ml，
  pH7.2。115℃灭菌20分钟。
b)液体种培养基(g/L)：牛肉膏1.5，酵母膏1.5，胰蛋白胨5.0，葡萄
  糖1.0，NaCl，K2HPO4 4.8，KH2PO4 1.32，深井水1000ml，pH7.2。115
  ℃灭菌20分钟。
2.凝结芽孢杆菌培养基的配制：
a)保藏斜面种培养基(g/L)：蛋白胨20.0，酵母膏10.0，葡萄糖2.0，
 MnSO4·H2O 0.05，琼脂20，用麸皮水定容至1000ml，pH7.2~7.4，121
  ℃灭菌20分钟。
b)液体种培养基(g/L)：蛋白胨10.0，酵母膏10.0，葡萄糖60.0，MgSO4·7H2O
  0.5，CaCO3 10.0，MnSO4·H2O 0.05，用水定容至1000ml，pH7.2~7.4，
  121℃灭菌20分钟。
c)发酵培养基(g/L)：葡萄糖20，尿素6.0，玉米浆10，蛋白胨10，酵
  母膏10，MnSO4·H2O 0.05，用水定容至1000ml，pH7.0，121℃灭菌20
  分钟。
以下菌种的发酵培养基与此相同！
3.产朊假丝酵母培养基的配制：
a)保藏斜面种培养基(g/L)：12Bx°麦芽汁1000ml，琼脂15，pH自然。117
  ℃灭菌30分钟。
b)液体种培养基(g/L)：8Bx°麦芽汁1000ml，pH自然。117℃灭菌30分
  钟。
4.醋化醋杆菌培养基的配制：
a)保藏斜面种培养基(g/L)：葡萄糖80.0，酵母膏10.0，CaCO3 20.0，琼
  脂20，用水定容至1000ml，pH6.8，121℃灭菌20分钟。
b)液体种培养基(g/L)：葡萄糖100.0，酵母膏15.0，CaCO3 20.0，用水
  定容至1000ml，pH6.8，121℃灭菌20分钟。
5.发酵乳杆菌培养基的配制：
a)保藏斜面种培养基(g/L)：乳酪蛋白胨10.0，牛肉膏10.0，酵母膏5.0，
  葡萄糖5.0，吐温80 1.0，醋酸钠5.0，拧檬酸二胺2.0，KH2PO4 2.0，
 MgSO4·7H2O 0.2，MnSO4·H2O 0.05，琼脂20，用水定容至1000ml，pH6.8，
  121℃灭菌20分钟。
b)液体种培养基(g/L)：乳酪蛋白胨10.0，牛肉膏10.0，酵母膏5.0，葡
  萄糖20.0，吐温80 1.0，醋酸钠5.0，拧檬酸二胺2.0，KH2PO4 2.0，
 MgSO4·7H2O 0.2，MnSO4·H2O 0.05，琼脂20，用水定容至1000ml，pH6.8，
  121℃灭菌20分钟。
6.地衣芽孢杆菌
a)保藏斜面种培养基(g/L)：蛋白胨5.0，牛肉膏3.0，NaCl 5.0，MnSO4·H2O
   0.005，琼脂20，用水定容至1000ml，pH7.0，121℃灭菌20分钟。
b)液体种培养基(g/L)：葡萄糖20，尿素4.0，玉米浆6，蛋白胨10，酵
  母膏10，MnSO4 ·H2O 0.05，pH7.0，用水定容至1000ml，pH7.0，121
  ℃灭菌20分钟。
三、制备方法：
制备微生态养水剂时，类球红假单胞菌单独培养，其余5种菌分别在不同的保藏斜面种培养基和液体种培养基培养后，再取体积相同的5种菌的液体种混合，接入种子罐混合培养，种子罐培养成熟后，按10％接种量接入发酵罐中，种子罐和发酵罐均采用发酵培养基作为营养基质。
1.类球红假单胞菌的培养：类球红假单胞菌的培养采用液体连续扩大
  的方法进行，具体操作过程如下：用接种针将在保藏斜面种培养基
  已培养好的斜面种在无菌条件下接入装有50ml已灭菌的液体种培养
  基的50ml三角瓶(整个三角瓶装满液体培养基)中，用胶塞密封住
  瓶口，静置于室外有阳光处，用阳光照射，在气温超过28℃，阳光
  充足的时候，一般经过4天的培养，液体变红，这时可以用分光光
  度计于650nm处直接测定液体原液的光密度(O.D.值)，当O.D.值
  超过1.0，其菌浓度超过1.0×109cfu/ml时，这时可以用血球计数法
  计算其菌浓度。当菌浓度确实超过1.0×109cfu/ml，可将培养好细菌
  的三角瓶移入室内阴凉处放置，备用。如果要进一步扩大培养，可
  以取培养好50ml类球红假单胞菌的培养液按10％接种量接入装有
  500ml已灭菌的液体种培养基的500ml三角瓶(整个三角瓶装满液
  体培养基)中，培养方法同前，依此类推。
  血球计数法方法如下：将培养完毕的成熟培养液，以无菌操作方法
  吸取1毫升待测样品注入盛有9毫升灭菌蒸馏水的试管，混匀成1∶
  10稀释液，并按上述相同操作做10倍递增稀释。吸取不同浓度的
  稀释液时必须更换吸管。取合适稀释度的稀释液通过血球记数法在
  显微镜下进行记数。
2.其余5种菌(凝结芽孢杆菌1.949、产朊假丝酵母AS2.1180、类球
  红假单胞菌、醋化醋杆菌1.117、发酵乳杆菌AS1.122和地衣芽孢
  杆菌1.813)的培养：将在不同保藏斜面种培养基培养好的斜面种
  用接种环分别接种一环于上述不同液体种培养基中，液体活化培养
  基装于500ml三角瓶中，三角瓶装量为20ml，于33℃往复式摇床振
  荡培养15小时，摇床转速为110r/m，冲程为65-75mm，使液体种的
  菌数达1.0×109cfu/ml以上；这时，可将5种菌的培养液混合在一
  起，按1％接种量接入装有10L已灭菌发酵培养基的15L种子罐中，
  于33℃，转速200r/m，风量为50L/小时，进行通气培养，保持罐
  压0.1Mpa；从六小时开始，鉴测菌浓度，待菌数达1.0×109cfu/ml
  以上，停止培养。按10％接种量接入装有100L已灭菌发酵培养基的
  150L发酵罐中，于34℃，转速220r/m，风量为3.5M3/小时，进行
  通气培养，保持罐压0.1Mpa；从五小时开始，检测菌浓度，待菌数
  达5.0×109cfu/ml以上，停止培养。如果要进一步扩大培养，可按
  前面相同的方法进行，依此类推。
3.复合微生态制剂的制备：取上述培养好类球红假单胞菌的培养液1
  份+5份其余5种菌凝结芽孢杆菌1.949、产朊假丝酵母AS2.1180、
  类球红假单胞菌、醋化醋杆菌1.117、发酵乳杆菌AS1.122和地衣
  芽孢杆菌1.813)在发酵罐中混合发酵培养的培养液。
4.高效渔用微生态养水剂的制备：在已混合有六种以上微生物的培养
  液中，按1g/L分别添加复合维生素B和维生素C原料药，然后装进
  不同体积的包装罐中，立即封盖，制成成品，置于阴凉处存放。
本发明产生的有益效果：具有不同功能、能高效发挥群体功能优势的高浓度微生物菌群的渔用微生态制剂及其生产方法，它通过6种不同微生物的简单组合，就能高效发挥养水和抗病的功效，具有生产方便、所含微生物浓度高、功效明显等特点。该产品在淡、海水养殖全过程均可使用。每亩(水深1米)首次施放1公斤，以后每20-30天施放0.5-1公斤，可以保持水色状态良好。
实施范例：
生产60L高效渔用微生态养水剂的操作实例：
1.类球红假单胞菌的培养液的制备：用接种针将在保藏斜面种培养基
  已培养好的斜面种在无菌条件下接入装有50ml已灭菌的液体种培
  养基(成分见前)的50ml三角瓶(整个三角瓶装满液体培养基)
  中，共接两瓶，用胶塞密封住瓶口，静置于室外有阳光处，用阳光
  照射，这时气温30℃，阳光充足，经过4天的培养，液体变红，
  用分光光度计于650nm处直接测定液体原液的光密度(O.D.值)，
  O.D.为1.0。取上述培养好类球红假单胞菌的培养液(共100m)
  接入装有1000ml已灭菌的液体种培养基1000ml三角瓶(整个三角
  瓶装满液体培养基)中，静置于室外有阳光处，用阳光照射，经过
  4天的培养，液体完全变红，测定O.D.为1.10。这时将其再接入
  装有10L已灭菌的液体种培养基玻璃瓶(整个瓶装满液体培养基)
  中，静置于室外有阳光处，用阳光照射，经过4天的培养，液体完
  全变红，测定O.D.为1.12，用血球计数法计算其菌浓度为2.1×
  109cfu/ml，将玻璃瓶移入室内阴凉处存放，备用。
2.凝结芽孢杆菌1.949、产朊假丝酵母AS2.1180、类球红假单胞菌、
  醋化醋杆菌1.117、发酵乳杆菌AS1.122和地衣芽孢杆菌1.813培
  养液的制备：将在不同保藏斜面种培养基培养好的斜面种用接种环
  分别接种一环于前面所述的不同液体种培养基中，液体培养基装于
  500ml三角瓶中，三角瓶装量为20ml，于33℃往复式摇床振荡培
  养15小时，摇床转速为110r/m，冲程为65-75mm，用血球计数法
  计算其菌浓度，这时每瓶液体种的菌数均超过1.0×109cfu/ml；将
  5种菌的培养液混合在一起，按接入装有7L已灭菌发酵培养基的10L
  种子罐中，于33℃，转速200r/m，风量为35L/小时，进行通气培
  养，保持罐压0.1Mpa；经9小时培养，用血球计数法计算其菌浓
  度为5.5×109cfu/ml，停止培养。将其接入装有70L已灭菌发酵培
  养基的100L发酵罐中，于34℃，转速220r/m，风量为2.65M3/小
  时，进行通气培养，保持罐压0.1Mpa；经9小时培养，用血球计
  数法计算其菌浓度为为7.0×109cfu/ml，停止培养。无菌排出50L
  培养液进入已灭菌的100L金属罐中，备用。
3.将上述培养好的10L类球红假单胞菌的培养液无菌移入装有培养好
  其余5种菌50L的培养液100L金属罐中，再添加60克复合维生素
  B和60克维生素C原料药，充分搅拌混合均匀。
4.采用无菌操作将上述含有六种菌和维生素的混合液快速放入不同体
  积的包装罐中，既制成高效渔用微生态养水剂。

Claims (4)

1、一种渔用微生态养水剂及其制备方法，其特征在于：含有凝结芽孢杆菌1.949、产朊假丝酵母AS2.1180、类球红假单胞菌1.1737、醋化醋杆菌1.117、发酵乳杆菌AS1.122和地衣芽孢杆菌1.813，六种菌浓度达5×109cfu/ml以上。
2、根据权利要求1所述的一种渔用微生态养水剂及其制备方法，其特征在于：按1g/L分别添加复合维生素B和维生素C原料药。
3、根据权利要求1、2所述的一种渔用微生态养水剂及其制备方法，其特征在于：球红假单胞菌单独培养；其余5种菌(凝结芽孢杆菌、产朊假丝酵母、醋化醋杆菌、发酵乳杆菌和地衣芽孢杆菌)的保藏斜面种和液体种也是分别进行培养，其保藏斜面种和液体种培养基也是不同的，但这五种菌的液体种是采用等体积混合后一起接入种子罐的，再经种子罐接入发酵罐一起混合培养，种子罐和发酵罐均采用发酵培养基作为发酵基质。
4、根据权利要求3所述的一种渔用微生态养水剂及其制备方法，其特征在于：凝结芽孢杆菌、产朊假丝酵母、醋化醋杆菌、发酵乳杆菌和地衣芽孢杆菌种子罐和发酵罐采用的培养基为(g/L)：葡萄糖15~25，尿素4.0~8.0，玉米浆15~25，蛋白胨15~25，酵母膏15~25，MnSO4·H2O0.02~0.08，pH6.8~7.2。
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