CN101892157A - 用于制备生物菌肥的复合菌剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物复合菌剂及其制备方法，尤其是用于制备生物菌肥的微生物复合菌剂。由中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)菌种目录中公开的编号为1.2352的沼泽红假单胞菌(Rhodopseudanonaspalustris)、编号为2.1180的产朊假丝酵母(Candidautilis)、编号为1.1854的嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)、编号为1.1630的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和编号为4.0891的细黄链霉菌乳糖变种(Streptomycesmicroflavusvar.lactosus)培养而成，其中沼泽红假单胞菌：产朊假丝酵母：嗜酸乳杆菌：枯草芽孢杆菌的重量比为：1∶0.5∶0.5∶0.1。利用这种复合菌剂制备生物菌肥时能把秸秆和禽畜粪便中的粗纤维及其它营养成分有效分解、释放，制备出的生物有机肥能够调理土壤，激活土壤中微生物活跃率，克服土壤板结，增加土壤空气通透性，起到增加产量的作用，并且有效解决了农村农业废弃物面源污染的困难问题。

Description

用于制备生物菌肥的复合菌剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及微生物复合菌剂及其制备方法，尤其是用于制备生物菌肥的微生物复合菌剂。

背景技术

生物有机肥的出现，利用土壤中的有益微生物来改善作物和土壤的微生态体系，将土壤中含量丰富的难溶性磷、钾元素释放出来，或将农作物的秸秆等难以利用的物质转化为可被利用的有效营养物质，既缓解肥料供需矛盾，又改善生态环境恶化的局面，为绿色生态农业发展提供了可能性，国内外在生物有机肥方面的研究和运用从上世纪五六十年代就开始了，上世纪80年代末生物肥在我国兴起，但是由于多是单菌，功能单一，不能全面解决土壤情况复杂的问题，随着我国自己的生物肥研究发展，研究复合菌生物有机肥成为趋势，复合菌肥利用微生物之间的互利共栖现象，通过单向有利或互为有利共存，能较为全面的解决土壤中存在的多种问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于制备生物菌肥的复合菌剂及其制备方法，利用这种复合菌剂制备生物菌肥时能把秸秆和禽畜粪便中的粗纤维及其它营养成分有效分解、释放，制备出的生物有机肥能够调理土壤，激活土壤中微生物活跃率，克服土壤板结，增加土壤空气通透性，起到增加产量的作用，并且有效解决了农村农业废弃物面源污染的困难问题。

  本发明的一种用于制备生物菌肥的复合菌剂，特征在于由中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）菌种目录中公开的编号为1.2352的沼泽红假单胞菌（Rhodop seudanonas palustris）、编号为2.1180的产朊假丝酵母(Candida utilis)、编号为1.1854的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus )、编号为1.1630的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 和编号为4.0891的细黄链霉菌乳糖变种（放线菌）（Streptomyces microflavus var. lactosus）培养而成，其中沼泽红假单胞菌：产朊假丝酵母：嗜酸乳杆菌：枯草芽孢杆菌的重量比为：1:0.5:0.5:0.1。

所述制备生物菌肥的复合菌剂的制备方法包括各种菌种的培养和复合菌剂的制备，特征在于具体步骤如下：

步骤1、各种菌的的纯化培养，使用的培养基、培养温度分别如下：

（1）沼泽红假单胞菌的培养基为0259ATYP琼脂培养基，培养基配方：KH₂PO₄ 1.0g  、CaCl₂ 0.1g  、NaHCO₃ 3.0g  、乙酸钠 1.0g 、 NH₄Cl₂ 0.5g 、 NaCl 1.0g 、 微量元素溶液 1.0ml和维生素溶液 1.0ml；

其中微量元素溶液配方：FeCl₂·4H₂O 1.8g  、CoCl2·6H₂O 0.25g  、NiCl₂·6H₂O  CuCl·2H₂O 0.01g 、MnCl₂·4H₂O 0.70g 、ZnCl₂ 0.1g 、H₃BO₃ 0.5g 、NaMoO₄·2H₂O 0.03g 、 Na₂SeO₃·5H₂O 0.01g  、琼脂 15.0g和 蒸馏水 1.0L ；

维生素溶液配方：生物素0.1g 、 烟酸0.35g 、 盐酸硫胺素0.3g  、对氨基苯甲酸0.2g  、盐酸吡哆胺0.1g 、 泛酸钙0.1g 、 维生素B₁₂0.05g 和 蒸馏水1.0L

培养温度为30℃；

（2）嗜酸乳杆菌的培养基为MRS培养基，配方为酪蛋白胨 10.0g、酵母提取物 5.0g、柠檬酸二铵 2.0g、MgSO₄·7H₂O 0.2g、琼脂 15g、乙酸钠 5.0g、CaCO₃ 20.0g、牛肉提取物 10.0g、葡萄糖 5.0g、Tween80 1.0g、MnSO₄·H₂O 0.05g、蒸馏水1000ml、  K₂HPO₄ 2.0g  PH值6.8，培养温度为37℃ ；

（3）产朊假丝酵母的培养基为0013麦芽汁培养基，配方为12Brix.麦芽汁 1.0L 和琼脂15.0g  ，PH值自然，培养温度为25-28℃ ；

（4）枯草芽孢杆菌的培养基为0032BPY琼脂，配方葡萄糖5g、酵母提取物5.0g、蛋白胨10.0g、氯化钠5.0g、牛肉膏5.0g、琼脂 15.0g和蒸馏水1000ml、PH7.0，培养温度为37℃；

（5）细黄链霉菌乳糖变种（放线菌）的培养基为0012高氏合成一号琼脂，配方为可溶性淀粉20g 、硝酸钾1g、氯化钠0.5g、磷酸氢二钾0.5g、硫酸镁0.5g、硫酸亚铁0.01g、琼脂20g和蒸馏水1000ml，PH值7.2-7.4，先经过121℃高压蒸汽灭菌30分钟，培养温度为23~37℃；

上述各种菌的培养时间大于48小时；

步骤2、复合菌肥菌种的扩大培养

将五类纯化的菌种分别传斜面，培养3~5天，温度为30~34℃；

然后再选择生长良好的斜面，分别挖块转入已消毒好的50ml液体培养基，培养基按照步骤1中的配方配制，温度为30~35℃，培养5~7天；

步骤3、菌种的再继代培养

将五类纯化的液体菌种按2%的接种量转入已消毒的500ml玻璃瓶，2%的接种量是指液体菌种与培养瓶容积的体积比为2:100，同时加入消好的培养基，培养基按步骤1中的配方配制，温度为30~35℃，培养5~7天；

步骤4、复合菌剂的制备

（1）将材料按照下列重量比准备：糖蜜：水：沼泽红假单胞菌：产朊假丝酵母：嗜酸乳杆菌：枯草芽孢杆菌=6:200:1:0.5:0.5:0.1，接种前将含糖量85%的糖蜜消毒融化，然后加入水搅拌均匀，水温控制在22-30℃；

（2）将沼泽红假单胞菌：产朊假丝酵母：嗜酸乳杆菌：枯草芽孢杆菌投入糖蜜水中进行接种，接种后发酵温度控制在26-30℃，培养7-10天，检验达到标准：棕色液体，酸甜气味，PH值介于3.0~3.8之间，活菌数＞2.0χ10⁸个/ml；

（3）将检验合格的液体过滤，然后按照滤液和细黄链霉菌乳糖变种重量比100:1，将细黄链霉菌乳糖变种加到发酵好的液体中，最后进行分装。

本发明的复合菌剂是由沼泽红假单胞菌、产朊假丝酵母、嗜酸乳杆菌和枯草芽孢杆菌等多种微生物组合而成的多功能菌群，其中各菌种的主要功能如下：

1、沼泽红假单胞菌（Rhodop seudanonas palustris）：属于光合菌的一种，光合细菌简称PSB，复合菌肥中的光合菌群属于独立营养微生物，它能利用土壤接受的太阳热能或以紫外线为能源，将土壤中的硫化氢和碳氢化合物中的氢分离出来，变有害物质为无害物质，并以植物根部的分泌物、有机物、有害气体（硫化氢等）及二氧化碳、氮等为基质，合成糖类、氨基酸、维生素类、氮素化合物和生理活性物质等，是肥沃土壤和促进动植物生长的主力部队，光合菌的代谢物质或者被植物直接吸收，或者成为其它微生物繁殖的养分，光合细菌如果能够增殖，其它的有益微生物也会增殖。

2、产朊假丝酵母(Candida utilis) ：酵母菌的一种，酵母菌群为真核微生物，均为兼氧性微生物，在有氧环境中进行有氧呼吸，以糖作为基质合成自身细胞物质，在缺氧条件下，以糖为基质，发酵生成乙醇。酵母细胞含有丰富的蛋白质，在生长代谢过程中能形成多种Ｂ族维生素，有助于促进其它微生物和动植物的营养吸收与生长。酵母菌细胞中超氧化物歧化酶（简称ＳＯＤ）的含量高于其它微生物，是其它微生物细胞ＳＯＤ含量的3～10倍，ＳＯＤ是生物体内铜、锌或锰和铁的金属酶，它催化超氧阴离子自由基（Ｏ₂ ^－）转化为Ｈ₂Ｏ₂和Ｏ₂的歧化反应，从而消除体内多余的Ｏ₂ ^― ，解除Ｏ₂ ^― 对生物体的毒性作用，利用氨基酸、糖类及其它有机物质，通过发酵，产生出促进细胞分裂的活性化物质。酵母菌在 EM 集团军中对于促进其它的有效微生物增殖所需要的基质（食物）的生产提供重要的营养保障。

3、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus )： 乳酸菌的一种, 它以摄取光合细菌酵母菌产生的糖类等物质为基础，产生乳酸。乳酸具有很强的杀菌能力，能有效抑制有害微生物的活动，以及有机物的急剧腐败分解。乳酸菌能够 使常态下不易分解的木质素和纤维素等变得容易分解，并且消除未分解有机物产生的种种弊端，在有机物发酵分解上发挥突击队的重要作用，它将未腐熟的有机物质 转化成对动植物有效的养分。乳酸菌还能有效抑制连作障碍产生的致病菌增殖。

4、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种嗜温、好氧、产芽孢的杆状细菌，其生理特征多样，分布广泛，极易分离培养。该菌在自然界中广泛存在，对人畜无毒无害，不污染环境，能产生多种抗菌素和酶，具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力。枯草芽孢杆菌不仅可以在土壤、植物根际体表等外界环境中广泛存在，而且是植物体内常 见内生细菌，尤其是在植物的根、茎部。目前该菌已经在水稻、大豆、棉花、小麦、辣椒、番茄、玉米等农作物上显示出很好的病害防治效果。

5、细黄链霉菌乳糖变种（放线菌）（Streptomyces microflavus var. lactosus）主要是链霉菌属(Streptomyces)。产生纺锤菌素；产生螺旋霉素，对革兰氏阳性及阴性细菌、丝状真菌等有害菌都有抑制作用。常用于农业上防病保苗；同时可作菌肥，能转化土壤中氮磷元素提高土壤肥力，并有刺激作物生长作用。

它从光合细菌中获取氨基酸、氮素等作为基质，产生出各种抗生物质、维生素及酶，可以直接抑制病原菌。它提前获取有害霉菌和细菌增殖所需要的基质，从而抑制它们的增殖，并创造出其它有益微生物增殖的生存环境。放线菌和光合细菌混合后的净菌作用比放线菌单兵作战的杀伤力要大得多。 它对难分解的物质，如木质素、纤维素、甲壳素等具有降解作用，并容易被动植物吸收，增强动植物对各种病害的抵抗力和免疫力。放线菌也会促进固氮菌和 VA 菌根菌增殖。 放线菌能产生抗生素物质，抑制有害菌的生长，防止病虫害的发生，部分放线菌能产生纤维素酶、半纤维素酶、木质素酶，可以分解秸秆中的粗纤维。在生长繁殖过程中能产生的高温有利于有机肥腐熟。

由上可见，各类微生物都各自发挥着重要作用，核心作用是光合细菌和嗜酸性乳杆菌为主导，其合成能力支撑着其他微生物的活动，同时也利用其他微生物产生的物质，形成共生共荣的关系，保证复合菌肥多效活性液状态稳定，功能齐全，发挥出集团军作战的强大能量。复合菌肥多效活性液的主要功能是造就良性生态，只要施用恰当，它就会与所到之处的良性力量迅速结合，产生抗氧化物质，清除氧化物质，消除腐败，抑制病原菌，形成适于植物生长的良好环境，同时，它还产生大量易为植物吸收的有益物质，如氨基酸、有机酸、多醣类、各种维生素、各种生化酶、促生长因子、抗生素和抗病毒物质等，提高植物的免疫功能，促进健康生长，从而在减轻劳动、降低成本、提高产量、改善品质，提前上市，使人们吃上无污染的高质量农产品的前提下，提高全社会的生产水平和生活质量，保护地球环境和人类美好的家园。

具体实施方式

     实施例1：通过向中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）购买获得菌种目录中公开的编号为1.2352的沼泽红假单胞菌（Rhodop seudanonas palustris）、编号为2.1180的产朊假丝酵母(Candida utilis)、编号为1.1854的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus )、编号为1.1630的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 和编号为4.0891的细黄链霉菌乳糖变种（放线菌）（Streptomyces microflavus var. lactosus）；

步骤1、各种菌的的纯化培养，使用的培养基、培养温度和培养的时间分别如下：

（1）沼泽红假单胞菌的培养基为0259ATYP琼脂培养基，培养基配方：KH₂PO₄ 1.0g 、 CaCl₂ 0.1g、NaHCO₃ 3.0g 、乙酸钠 1.0g 、NH₄Cl₂ 0.5g 、NaCl 1.0g 、微量元素溶液 1.0ml和维生素溶液 1.0ml；

其中微量元素溶液：FeCl₂·4H₂O 1.8g 、CoCl2·6H₂O 0.25g 、NiCl₂·6H₂O  CuCl·2H₂O 0.01g、MnCl₂·4H₂O 0.70g、ZnCl₂ 0.1g、H₃BO₃ 0.5g 、NaMoO₄·2H₂O 0.03g 、Na₂SeO₃·5H₂O 0.01g、琼脂 15.0g和蒸馏水 1.0L；

其中维生素溶液：生物素0.1g、烟酸0.35g 、盐酸硫胺素0.3g 、对氨基苯甲酸0.2g 、盐酸吡哆胺0.1g 、泛酸钙0.1g、维生素B₁₂0.05g和蒸馏水1.0L；

培养温度为30℃；

（2）嗜酸乳杆菌的培养基为MRS培养基，配方为酪蛋白胨 10.0g、酵母提取物 5.0g、柠檬酸二铵 2.0g、MgSO₄·7H₂O 0.2g、琼脂 15g、乙酸钠 5.0g、CaCO₃ 20.0g、牛肉提取物 10.0g、葡萄糖 5.0g、Tween80 1.0g、MnSO₄·H₂O 0.05g、蒸馏水1000ml和K₂HPO₄ 2.0g  PH值6.8，培养温度为37℃ ；

（3）产朊假丝酵母的培养基为0013麦芽汁培养基，配方为12Brix.麦芽汁 1.0L 和琼脂15.0g   PH值自然，培养温度为25-28℃ ；

（4）枯草芽孢杆菌的培养基为0032BPY琼脂，配方葡萄糖5g、酵母提取物5.0g、蛋白胨10.0g、氯化钠5.0g、牛肉膏5.0g、琼脂 15.0g、蒸馏水1000ml、PH7.0，培养温度为37℃；

（5）细黄链霉菌乳糖变种（放线菌）的培养基为0012高氏合成一号琼脂，配方为可溶性淀粉20g 、硝酸钾1g、氯化钠0.5g、磷酸氢二钾0.5g、硫酸镁0.5g、硫酸亚铁0.01g、琼脂20g、蒸馏水1000ml，PH值7.2-7.4，先经过121℃高压蒸汽灭菌30分钟，培养温度为23~37℃；

上述各种菌的培养时间大于48小时；

步骤2、复合菌肥菌种的扩大培养

将五类纯化的菌种分别传斜面，培养3~5天，温度为30~34℃；

然后再选择生长良好的斜面，分别挖块转入已消毒好的50ml液体培养液，30~35℃培养5~7天；

步骤3、菌种的再继代培养

将五类纯化的液体菌种按2%的接种量转入已消毒的500ml玻璃瓶，同时加入消好的培养液，在30~35℃温度，培养5~7天；

步骤4、复合菌剂的制备

（1）将材料按照下列重量比准备：糖蜜：水：沼泽红假单胞菌：产朊假丝酵母：嗜酸乳杆菌：枯草芽孢杆菌=6:200:1:0.5:0.5:0.1，接种前将含糖量85%的糖蜜消毒融化，然后加入水搅拌均匀，水温控制在22-30℃；

（2）将光和菌、酵母菌、乳酸菌、芽孢杆菌投入糖蜜水中进行接种，接种后发酵温度控制在26-30℃，培养7-10天，检验达到标准：棕色液体，酸甜气味，PH值介于3.0~3.8之间，活菌数＞2.0χ10⁸个/ml；

（3）将检验合格的液体过滤，然后按照滤液和放线菌100:1的重量比将细黄链霉菌乳糖变种按加到发酵好的液体中，进行分装。

实施例2、使用实施例1中得到的复合菌剂制备生物有机肥，准备褐煤200kg、禽畜粪便500kg以及秸秆粉300kg、复合菌剂3kg。

按照下列步骤生产：

（1）将200kg褐煤、500kg禽畜粪便、300kg的秸秆粉混合均匀，搅拌过程中添加复合菌肥3kg，在发酵车间发酵48小时；

（2）待温度上升到72℃时用自动翻堆机开始翻堆，在以后的8天内，每隔12小时翻堆一次；

（3）翻堆过程中微生物发酵产生的高温将水蒸发，同时进行好氧发酵，当堆肥中的水份含量下降到20%时，进行产品检测；

（4）对检测合格，达到NY884-2004国际标准的产品进行定量包装即成。

根据检验报告表可知，这种生物有机肥达到NY884-2004标准要求，总养分含量，氮、磷以及钾元素达到4％，有机肥营养元素丰富，有效活菌数0.2，游离水含量14.4％，含量低，水分流失少，蛔虫卵死亡率高达100％，完全死亡，镉、汞、铅、铬、砷等对人体要害的元素，含量远远低于NY884-2004标准要求。

使用这种生物有机肥能够调理土壤，激活土壤中微生物活跃率，克服土壤板结，增加土壤空气通透性，起到增加产量的作用，并且有效解决了农村农业废弃物面源污染的困难问题。

Claims (2)

1.一种用于制备生物菌肥的复合菌剂，特征在于由中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）菌种目录中公开的编号为1.2352的沼泽红假单胞菌（Rhodop seudanonas palustris）、编号为2.1180的产朊假丝酵母(Candida utilis)、编号为1.1854的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus )、编号为1.1630的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 和编号为4.0891的细黄链霉菌乳糖变种（放线菌）（Streptomyces microflavus var. lactosus）培养而成，其中沼泽红假单胞菌：产朊假丝酵母：嗜酸乳杆菌：枯草芽孢杆菌的重量比为：1:0.5:0.5:0.1。

2.一种制备权利要求1所述的复合菌剂的制备方法，包括各种菌种的培养和复合菌剂的制备，其特征在于具体步骤如下：

步骤1、各种菌的的纯化培养，使用的培养基、培养温度分别如下：

（1）沼泽红假单胞菌的培养基为0259ATYP琼脂培养基，培养基配方：KH₂PO₄ 1.0g  、CaCl₂ 0.1g  、NaHCO₃ 3.0g  、乙酸钠 1.0g 、 NH₄Cl₂ 0.5g 、 NaCl 1.0g 、 微量元素溶液 1.0ml和维生素溶液 1.0ml；

其中微量元素溶液配方：FeCl₂·4H₂O 1.8g  、CoCl2·6H₂O 0.25g  、NiCl₂·6H₂O  CuCl·2H₂O 0.01g 、MnCl₂·4H₂O 0.70g 、ZnCl₂ 0.1g 、H₃BO₃ 0.5g 、NaMoO₄·2H₂O 0.03g 、 Na₂SeO₃·5H₂O 0.01g  、琼脂 15.0g和 蒸馏水 1.0L ；

维生素溶液配方：生物素0.1g 、 烟酸0.35g 、 盐酸硫胺素0.3g  、对氨基苯甲酸0.2g  、盐酸吡哆胺0.1g 、 泛酸钙0.1g 、 维生素B₁₂0.05g 和 蒸馏水1.0L；

培养温度为30℃；

（2）嗜酸乳杆菌的培养基为MRS培养基，配方为酪蛋白胨 10.0g、酵母提取物 5.0g、柠檬酸二铵 2.0g、MgSO₄·7H₂O 0.2g、琼脂 15g、乙酸钠 5.0g、CaCO₃ 20.0g、牛肉提取物 10.0g、葡萄糖 5.0g、Tween80 1.0g、MnSO₄·H₂O 0.05g、蒸馏水1000ml、  K₂HPO₄ 2.0g  PH值6.8，培养温度为37℃ ；

（3）产朊假丝酵母的培养基为0013麦芽汁培养基，配方为12Brix.麦芽汁 1.0L 和琼脂15.0g  ，PH值自然，培养温度为25-28℃ ；

（4）枯草芽孢杆菌的培养基为0032BPY琼脂，配方葡萄糖5g、酵母提取物5.0g、蛋白胨10.0g、氯化钠5.0g、牛肉膏5.0g、琼脂 15.0g和蒸馏水1000ml、PH7.0，培养温度为37℃；

（5）细黄链霉菌乳糖变种的培养基为0012高氏合成一号琼脂，配方为可溶性淀粉20g 、硝酸钾1g、氯化钠0.5g、磷酸氢二钾0.5g、硫酸镁0.5g、硫酸亚铁0.01g、琼脂20g和蒸馏水1000ml，PH值7.2-7.4，先经过121℃高压蒸汽灭菌30分钟，培养温度为23~37℃；

上述各种菌的培养时间大于48小时；

步骤2、复合菌肥菌种的扩大培养

将五类纯化的菌种分别传斜面，培养3~5天，温度为30~34℃；

然后再选择生长良好的斜面，分别挖块转入已消毒好的50ml液体培养基，培养基按照步骤1中的配方配制，温度为30~35℃，培养5~7天；

步骤3、菌种的再继代培养

将五类纯化的液体菌种按2%的接种量转入已消毒的500ml玻璃瓶，2%的接种量是指液体菌种与培养瓶容积的体积比为2:100，同时加入消好的培养基，培养基按步骤1中的配方配制，温度为30~35℃，培养5~7天；

步骤4、复合菌剂的制备

（1）将材料按照下列重量比准备：糖蜜：水：沼泽红假单胞菌：产朊假丝酵母：嗜酸乳杆菌：枯草芽孢杆菌=6:200:1:0.5:0.5:0.1，接种前将含糖量85%的糖蜜消毒融化，然后加入水搅拌均匀，水温控制在22-30℃；

（2）将沼泽红假单胞菌：产朊假丝酵母：嗜酸乳杆菌：枯草芽孢杆菌投入糖蜜水中进行接种，接种后发酵温度控制在26-30℃，培养7-10天，检验达到标准：棕色液体，酸甜气味，PH值介于3.0~3.8之间，活菌数＞2.0χ10⁸个/ml；

（3）将检验合格的液体过滤，然后按照滤液和细黄链霉菌乳糖变种重量比100:1，将细黄链霉菌乳糖变种加到发酵好的液体中，最后进行分装。