CN101153294A - 琥珀酸的固定化细胞单罐高强度连续发酵工艺 - Google Patents

Abstract

本发明公开了琥珀酸的固定化细胞单罐高强度连续发酵工艺方法，涉及如下步骤：(1)制备高活性产琥珀酸放线杆菌种子液；(2)菌种的10L罐扩培；(3)10L罐固定化细胞的制备；(4)10L罐单罐反复发酵：无菌接入新鲜培养基，第一批次控制发酵时间为24小时，以后连续发酵9个批次，发酵时间均为16小时，通过CO₂和H₂混合气流速控制兼性厌氧培养模式，发酵液的pH值通过流加氢氧化钙控制，每个批次发酵结束时，通过罐体内置旋浆过滤器正压无菌操作截流固定化细胞进行下一批次发酵，发酵强度稳定在3.10g/(h·L)以上，完全实现了琥珀酸的固定化细胞单罐高强度连续发酵。

Description

琥珀酸的固定化细胞单罐高强度连续发酵工艺

技术领域

本发明涉及细菌发酵琥珀酸的新工艺，更具体地说是利用产琥珀酸放线杆菌固定化细胞进行单罐高强度连续发酵的新工艺，属于发酵工程领域。

背景技术

琥珀酸作为一种重要的有机酸，广泛应用于医药、农药、染料、香料、油漆、食品、塑料和照相材料工业，而琥珀酸更大的潜在市场是由于它可以作为化工合成的中间体。目前，许多的化工产品都是以苯为原料的，但苯是石油化工产品，不具有可再生性。从长远考虑必须找到合适的可再生原料取代苯。大约有250种可以用苯为原料生产的化工产品都可以通过琥珀酸为原料生产。一旦实现了琥珀酸的大规模生产，就可以取代石油化工产品苯。与传统化学方法相比，微生物发酵法生产琥珀酸生产成本具有竞争力，利用可再生的农业资源为原料，避免了对石化原料的依赖，减少了化学合成工艺对环境的污染等优点，可见发酵法生产的琥珀酸将是一种很好的绿色平台化学品，而优良菌株的获得则至关重要。因此琥珀酸的生物转化研究近年来引起人们重视，在众多产琥珀酸微生物中，由于产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes/ATCC55618)有营养消耗简单、不易染菌、兼性厌氧等特点，具有工业化生产的潜力。

固定化细胞(cell immobilization)培养是20世纪中期兴起的一种新型生物技术，是指利用物理或化学手段将游离的细胞或酶与固态的不溶性载体相结合，使其保持活性并可反复使用的一种技术。与传统分批游离发酵相比，利用固定化微生物技术具有细胞负荷高、生物催化高效、细胞可反复使用等优点，并可得到高的目标产量和原料转化率，易于实现细胞与产物分离，有利于实现工艺过程的自动化、连续化，降低生产成本，具体表现在：(1)生物反应器中可以获得极高的菌体浓度，因而发酵速率可以大大提高，反应器设备的生产强度得以强化；(2)产物分离纯化过程中菌体从发酵液中的分离十分容易；(3)固定化细胞可以重复或长期使用，这样既能够简化游离细胞过程需要不断培养菌体的操作，又减少了营养物质的浪费，提高了生产率。

在各种固定化技术中，天然高分子和合成高分子材料的吸附和包埋是研究最为活跃的微生物细胞固定化方法，然而采用固定化细胞进行琥珀酸发酵还没未见有专利研究报道，本专利采用海藻酸钙固定化产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes/ATCC55618)细胞进行琥珀酸连续高强度发酵，工业应用意义重大。

发明内容

本发明的目的是提供一种运行成本低、发酵强度高、适于工业化生产的琥珀酸的固定化细胞单罐高强度连续发酵工艺。

本发明具体工艺方法如下：

产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes/ATCC55618)有营养消耗简单、不易染菌、兼性厌氧等特点，具有工业化生产的潜力，作为本专利的菌源，温度为34℃，取胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)生长1天的菌斜面作为原始种子。

制备高活性产琥珀酸放线杆菌种子液：斜面菌种直接接种于500mL三角瓶，温度为34℃，培养基采用：葡萄糖60g/L，酵母浸粉10g/L，胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)5g/L，玉米浆(CSL)15g/L，磷酸二氢钠(NaH₂PO₄·2H₂O)1.16g/L，磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)0.7g/L，氯化钠(NaCl)1.0g/L，氯化镁(MgCl₂·6H₂O)0.2g/L。进行CO₂和H₂混合气培养18小时，得液体种子液。

菌种的10L罐扩培：将培养18小时的液体种子直接接种于10L发酵罐内，温度为34℃，培养基同上，通过控制CO₂和H₂混合气流速进行兼性厌氧培养18小时，得高活性游离细胞。

10L罐固定化细胞的制备：向装有4L对数生长期的高活性游离细胞菌液的罐内添加400mL浓度为25％的无菌海藻酸钠溶液，控制该罐内细胞菌液的海藻酸钠浓度约2.5％，将海藻酸钠菌悬液搅拌均匀，无菌流加至另一装有4L浓度2％氯化钙无菌水溶液的10L发酵罐内进行钙化处理，通过调节流加速度和加料口针头孔径来控制固定化颗粒大小，控制固定化载体直径3.0-4.0mm范围内，无菌正压排出剩余氯化钙液体，制得粒径均匀的固定化细胞。

10L罐单罐反复发酵：无菌接入新鲜培养基，第一批次控制发酵时间为24小时，以后连续发酵9个批次，发酵时间均为16小时，温度为34℃，通过CO₂和H₂混合气流速控制兼性厌氧培养模式，发酵液的pH值通过流加氢氧化钙控制，发酵液的pH值控制为5.5，每个批次发酵结束时，通过罐体内置旋桨过滤器正压无菌操作截流固定化细胞进行下一批次发酵，完全实现了琥珀酸的固定化细胞单罐高强度连续发酵。每次发酵培养基成分如下：葡萄糖60g/L，酵母浸粉1.5g/L，胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)0.5g/L，玉米浆(CSL)2.0g/L，磷酸二氢钠(NaH₂PO₄·2H₂O)0.5g/L，磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)00.2g/L，氯化钠(NaCl)0.3g/L，氯化镁(MgCl₂·6H₂O)0.05g/L。对发酵结果进行检测，主要含有琥珀酸，菌体蛋白小于0.2％，有利于产物分离提取，产物琥珀酸浓度均大于50g/L，发酵强度稳定在3.10g/(h·L)以上，完全适应工业生产。

本发明的琥珀酸的固定化细胞单罐高强度连续发酵工艺与常规琥珀酸间歇式分批发酵相比，有益技术效果体现在：

(1)由于重复发酵不需要持续大量的消耗N源，本发明所涉及菌种的发酵工艺中比普通游离发酵所要求的营养更为简单，节约发酵成本。

(2)本发明中悬浮培养体系所制备的固定化细胞形状规则、大小较均一，制作成本低，发酵条件温和、可控，有利于工业规模的生产。

(3)本发明中所制备的固定化细胞能够成功实现半连续重复发酵，提高了菌种的利用效率。

(4)本发明中发酵工艺在重复发酵10批次均能保持较高的发酵强度，稳定在3.10g/(h·L)以上，完全适应工业化规模发酵要求。

(5)发酵稳定性好，持续发酵10批次后没有检测到杂菌。

附图说明

图1为琥珀酸单罐高强度连续发酵固定化细胞，通过图中可以固定化细胞呈现形状规则、大小均一的特征。

图2为产琥珀酸固定化细胞从第2批次到第10批次平均发酵强度随发酵批次的变化情况，从图中可以看出菌株的固定化细胞在整个重复发酵期间均保持较高发酵强度，稳定在3.10g/(h·L)以上。

具体实施方式

下面通过实施例，对本发明作进一步详细说明。

实施例：

琥珀酸的固定化细胞单罐高强度连续发酵工艺方法包括下述操作步骤：

(1)斜面菌种的准备

将产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes/ATCC55618)划线接种于胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)平板，设置培养温度为34℃，进行CO₂和H₂混合气室培养1天的菌斜面作为原始种子，CO₂和H₂混合气的混合比例为1∶1。

(2)制备高活性产琥珀酸放线杆菌种子液

斜面菌种直接接种于500mL三角瓶，装液200mL，培养基采用：葡萄糖60g/L，酵母浸粉10g/L，胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)5g/L，玉米浆(CSL)15g/L，磷酸二氢钠(NaH₂PO₄·2H₂O)1.16g/L，磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)0.7g/L，氯化钠(NaCl)1.0g/L，氯化镁(MgCl₂·6H₂O)0.2g/L，发酵液总体积为200mL。设置温度为34℃，摇瓶转速为100转/min，进行CO₂和H₂混合气培养18小时，CO₂和H₂混合气的混合比例为1∶1，温度为34℃，得液体种子。

(3)菌种的10L罐扩培

将培养18小时的液体种子直接接种于10L发酵罐内，培养基同(2)，通过控制CO₂和H₂混合气流速进行兼性厌氧培养18小时，设置温度为34℃，搅拌转速为100转/min，混和气流速为0.03L/(min·L)，其中CO₂和H₂的体积比为1∶1，得高活性游离细胞。

(4)10L罐固定化细胞的制备

将两个10L的发酵罐用无菌管连接，其中一个10L罐内装有4L对数生长期的高活性游离细胞菌液，另10L罐内装有4L浓度2％的氯化钙无菌水溶液。

首先向装有4L对数生长期的高活性游离细胞菌液10L罐内添加400mL浓度为25％的无菌海藻酸钠溶液，控制该罐内细胞菌液的海藻酸钠浓度约2.5％，将海藻酸钠菌悬液搅拌均匀，之后无菌流加至另一装有4L浓度2％氯化钙无菌水溶液的10L发酵罐内进行钙化处理，钙化时间为30min，通过调节流加速度10mL/min和针头直径1.0mm来控制固定化颗粒大小，控制固定化载体直径3.0-4.0mm范围内，无菌正压排出剩余氯化钙液体，制得粒径均匀的固定化细胞，见图1。

(5)10L罐单罐反复发酵

将上述固定化细胞无菌接入新鲜培养基，第一批次控制发酵时间为24小时，设置温度为34℃，通过CO₂和H₂混合气流速控制兼性厌氧培养模式，CO₂和H₂混合气的流速为0.02L/(min·L)，其中CO₂和H₂的比例为1∶1，采用直板式搅拌桨生物反应器，搅拌转速为100转/min，，

以后连续发酵9个批次，发酵时间均为16小时，设置温度为34℃，通过CO₂和H₂混合气流速控制兼性厌氧培养模式，CO₂和H₂混合气的流速为0.02L/(min·L)，其中CO₂和H₂的比例为1∶1，采用直板式搅拌桨生物反应器，搅拌转速为100转/min，且配有内置旋桨无菌过滤器，以实现固定化细胞的反复无菌截流，发酵液的pH值控制为5.5，通过pH电极检测结合补料泵无菌流加氢氧化钙完成，每个批次发酵结束时，通过罐体内置旋桨过滤器进行无菌正压放料截流固定化细胞，后采用无菌操作补加4L成分相同的新鲜培养基进行下一批次发酵，完全实现了琥珀酸的固定化细胞单罐高强度连续发酵。

新鲜培养基成分如下：葡萄糖60g/L，酵母浸粉1.5g/L，胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)0.5g/L，玉米浆(CSL)2.0g/L，磷酸二氢钠(NaH₂PO₄·2H₂O)0.5g/L，磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)00.2g/L，氯化钠(NaCl)0.3g/L，氯化镁(MgCl₂·6H₂O)0.05g/L，发酵液总体积为4L。

每个批次发酵结束后的4L发酵液中，菌体蛋白浓度小于0.2％，残糖浓度约1g/L，有利于产物分离提取，产物琥珀酸的浓度大于50g/L，完全达到提取的要求，每批次发酵周期为16小时，发酵强度稳定在3.10g/(h·L)以上，见图2。

Claims (1)

1.琥珀酸的固定化细胞单罐高强度连续发酵工艺，其特征在于包括如下操作步骤：

A、斜面菌种的准备

将产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes/ATCC55618)划线接种于胰蛋白胨大豆琼脂培养基平板，在温度为34℃条件，进行CO₂和H₂混合气室培养1天，CO₂和H₂混合气的混合比例为1∶1，得斜面菌种作为原始种子；

B、制备高活性产琥珀酸放线杆菌种子液

斜面菌种直接接种于500mL三角瓶，装液200mL，在温度为34℃、摇瓶转速为100转/min条件下进行CO₂和H₂混合气培养18小时，CO₂和H₂混合气的混合比例为1∶1，得液体种子；

培养基包括下列重量配比的原料：葡萄糖60g/L，酵母浸粉10g/L，胰蛋白胨大豆肉汤5g/L，玉米浆15g/L，磷酸二氢钠1.16g/L，磷酸氢二钠0.7g/L，氯化钠1.0g/L，氯化镁0.2g/L；发酵液体积为200mL，装液系数为0.4；

C、菌种的10L罐扩培

将培养18小时的液体种子直接接种于10L发酵罐内，液体体积为4L，在温度为34℃、搅拌转速为100转/min、在混合比为1∶1的CO₂和H₂混合气流速为0.03L/(min·L)条件下，进行兼性厌氧培养18小时，得高活性游离细胞菌液；

培养基成分组成同B步骤；

D、10L罐固定化细胞的制备

向装有4L对数生长期的高活性游离细胞菌液的罐内添加400mL浓度为25％的无菌海藻酸钠溶液，控制该罐内细胞菌液的海藻酸钠浓度约2.5％，搅拌均匀，无菌流加至另一装有4L浓度2％氯化钙无菌水溶液的10L发酵罐内进行钙化处理，钙化时间为30min，调节流加速度10mL/min和采用直径1.0mm针头来控制固定化颗粒大小，控制固定化载体直径3.0-4.0mm范围内，无菌正压排出剩余氯化钙液体，制得粒径均匀的固定化细胞；

E、10L罐单罐反复发酵

将固定化细胞无菌接入新鲜培养基，第一批次发酵时间为24小时，设置温度为34℃，通过兼性厌氧培养模式，CO₂和H₂混合气的流速为0.02L/(min·L)，其中CO₂和H₂的比例为1∶1，搅拌转速为100转/min，

以后连续发酵9个批次，每次发酵时间均为16小时，设置温度为34℃，通过兼性厌氧培养模式，CO₂和H₂混合气的流速为0.02L/(min·L)，其中CO₂和H₂的比例为1∶1，采用直板式搅拌桨生物反应器，搅拌转速为100转/min；发酵液的pH值通过流加氢氧化钙控制为5.5，每个批次发酵结束后，进行无菌正压放料截流固定化细胞，补加入新鲜培养基至4L，进行下一批次发酵，

在发酵进行至16h的时候，琥珀酸浓度大于50g/L，菌体蛋白浓度小于0.2％，发酵强度稳定在3.10g/(h·L)以上；

所述新鲜培养基包括下列重量配比的原料：葡萄糖60g/L，酵母浸粉1.5g/L，胰蛋白胨大豆肉汤0.5g/L，玉米浆2.0g/L，磷酸二氢钠0.5g/L，磷酸氢二钠00.2g/L，氯化钠0.3g/L，氯化镁0.05g/L，灌内液体发酵培养基的总体积为4L。