KR20200026783A - 아스페르길루스 니제르 종자의 연속 배양 및 그 구연산 생산 방법 - Google Patents

아스페르길루스 니제르 종자의 연속 배양 및 그 구연산 생산 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20200026783A
KR20200026783A KR1020197006893A KR20197006893A KR20200026783A KR 20200026783 A KR20200026783 A KR 20200026783A KR 1020197006893 A KR1020197006893 A KR 1020197006893A KR 20197006893 A KR20197006893 A KR 20197006893A KR 20200026783 A KR20200026783 A KR 20200026783A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seed
fermentation
incubator
aspergillus niger
continuous
Prior art date
Application number
KR1020197006893A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102174885B1 (ko
Inventor
구이양 시
지지에 후
유란 리
시아동 지앙
사이 진
푸신 선
쳉 장
동지아오 저우
지아웨이 루
마오동 미아오
지하오 판
Original Assignee
장쑤 구오신 유니온 에너지 컴퍼니 리미티드
지앙난대학교
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 장쑤 구오신 유니온 에너지 컴퍼니 리미티드, 지앙난대학교 filed Critical 장쑤 구오신 유니온 에너지 컴퍼니 리미티드
Publication of KR20200026783A publication Critical patent/KR20200026783A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102174885B1 publication Critical patent/KR102174885B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/44—Polycarboxylic acids
    • C12P7/48—Tricarboxylic acids, e.g. citric acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/04—Preserving or maintaining viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungal isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/66—Aspergillus
    • C12R2001/685—Aspergillus niger

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

본 발명은 일종의 아스페르길루스 니제르 종자의 연속 배양 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다. (1) 시작 단계, 아스페르길루스 니제르 포자를 종자 배양기로 접종시켜서 종자액을 얻는다. (2) 종자 연속 배양 단계, 단계 (1)에서 얻은 종자액을 연속 분산 처리하고, 분산시켜 얻은 종자액에 대해 연속 배양을 진행하며, 동시에 신선한 종자를 피딩 배양기에 보충한다. (3) 중지 단계, 신선한 종자의 피딩 배양기 보충과 분산 처리를 중지하고, 계속 배양해서 얻은 종자액을 발효 배양기로 이식하여 발효 배양을 진행한다. 본 발명의 방법은 다세포 사상균의 느린 성장 및 연속 배양 중 균사체가 유실되기 쉬운 문제를 획기적으로 해결하여 종자의 연속 배양을 완전히 구현함으로써, 균체가 최적의 성장 환경에서 일정할 수 있게 하여 균종의 퇴화를 방지하고, 종자액을 연속적이고 안정적인 고활력 상태로 유지시켜 해당 발효로 만든 구연산의 성능을 향상시킨다.

Description

아스페르길루스 니제르 종자의 연속 배양 및 그 구연산 생산 방법
본 발명은 미생물 배양의 기술영역에 관한 것이며, 특히 일종의 아스페르길루스 니제르 종자의 연속 배양 및 그 구연산 생산 방법에 관한 것이다.
구연산은 세계적으로 생산량과 사용량이 가장 많은 유기산이며, 일종의 중요한 화학제품으로 광범위한 용도를 가지고 있다. 구연산은 주로 산미제, 항산화제, 겔화제 등과 같이 식품산업에 사용되고, 의약, 사료, 화학, 전자, 방직 등 산업분야에도 매우 광범위하게 응용되고 있으며, 시장의 수요량이 매년 증가하고 있다. 우리나라는 구연산의 최대 생산과 수출국으로, 생산기술이 선진적이고 시장경쟁력이 강력하며, 특히 독창적으로 옥수수와 감자 등 전분 소재 원료의 심층 발효 지수는 세계적으로 선두권에 위치해 있다.
비록 최근 바이오 발효기술이 끊임없이 신속하게 발전하고, 새로운 발효기술이 끊임없이 개발되며, 여러가지 고효율의 연속 배양방식이 다양한 발효제품에서 광범위하게 응용되고 있지만, 다핵 사장진균인 구연산 생산균종 아스페르길루스 니제르는 그 성장 특성과 균체 형태가 효모와 세균 등의 단세포 미생물과는 완전히 다르고, 효모와 세균으로 균주를 생산하는 고효율의 성숙한 발효 방식은 아스페르길루스 니제르 구연산 발효 생산에 잘 응용될 수 없기 때문에, 구연산 등 사상균으로 균주를 생산하는 발효 산업의 발전을 심각하게 제약하고 있다.
현재, 구연산 발효 생산은 여전히 전통적 방식을 계속 사용하고 있다. 즉 먼저 대량의 아스페르길루스 니제르 포자를 준비한 후, 포자를 종자 배양기에 이식하여 성숙한 종자액을 얻는다. 그후 종자액을 발효 배양기에 이식 발효시켜 구연산 발효액을 얻는다. 구연산 전통 발효 방식은 다음과 같은 문제점이 존재한다.
(1) 아스페르길루스 니제르 포자는 준비가 번거롭고, 주기가 길며 효율이 낮다 : 아스페르길루스 니제르 균종은 우량성의 회복, 평판 선별과 3단계 확대배양을 거쳐야 해서 준비 주기가 30일 이상이다. 수동 조작이 번거롭고, 감염의 위험이 크다.
(2) 균종 안정성, 일치성이 나쁘다 : 현재 포자 준비 기계화 수준이 낮고, 누룩 배양용기가 작으며, 서로 다른 용기 내에서의 일치성이 나빠서 종자 배양 품질과 발효 결과가 안정적이지 않다.
(3) 종자 배양 효율이 낮다 : 포자 접종부터 종자 배양까지 8~12h 발아 시간이 필요하며, 종자 탱크의 이용 효율성이 떨어진다.
(4) 종자의 비연속 간헐적 배양이 안정적이지 않다 : 비연속 간헐적 배양 중, 균체의 성장 환경(당 농도, pH 등)이 부단히 변화하여 균체가 장기간 최적의 환경에서 성장할 수 없게 된다.
현재 업계에는 사상균 종자의 연속 배양 방법이 아직 없는데, 그 이유는 사상균이 보통 다세포로 성장이 느리고, 덩어리나 공 모양을 이루며, 연속 배양 중에서 세포가 유실되기 쉽기 때문이다. 일반적인 연속 배양은 주로 세균, 효모 등 종류의 미생물 방면에 집중되는데, 그것들은 단세포로 형태가 단순하며, 제어가 용이하다. 특허 CN201410329652.X에서 공개한 일종의 균사체 분산 기술에 기반한 구연산 아스페르길루스 니제르 종자의 연속 배양 방법은 비록 "연속" 배양이라고 하지만, 그 본질은 "순환" 배양이며, 그 방법은 지난 번에 남은 분산 균사를 새로운 종자 배양기에 접종해 종자액으로 배양시켜서 종자의 순환 배양을 구현하는 것이다. 그 방법은 비록 포자 사용량을 줄이고 포자의 발아 시간을 단축하지만, 종자가 다른 탱크 내에서 전환 배양을 진행해야 하므로 설비 서스템이 증가되고, 조작이 상대적으로 번거롭다. 또한 각 배치의 종자액이 여전히 비연속 간헐적 배양 방식으로 진행되고, 배양 환경이 부단히 변화하기 때문에, 종자가 최적의 환경조건에서 성장하는지 보장할 수 없고, 배치 간의 불안정성이 존재할 뿐 아니라, 더 중요한 것은 균종이 퇴화해서 발효 수준에 영향을 미치기 쉽다는 점이다. 따라서, 현재 업계에는 진정한 종자의 연속 배양 방법이 아직 개발되지 않았다.
특허 CN201410329652.X의 비연속 간헐적 배양과 비교해서, 아스페르길루스 니제르 종자의 연속 배양은 다음의 기술적 어려움을 해결해야 한다. (1) 균체 성장이 느리고, 균사체가 유실되기 쉽다. (2) 균종의 계대배양 횟수를 줄이고, 균체의 퇴화를 방지한다. (3) 적절한 종자액 체류시간을 확정하여 지나치게 빠른 균체의 실을 방지하는 동시에, 이식 종자액 중의 균체량을 충분하게 보장하고, 안정적인 배양 환경을 보증한다. (4) 적절한 균사 크기를 확정하여 균체의 성장속도와 희석속도의 균형을 이룬다.
따라서, 다세포 사상균의 한계를 해결하고, 종자액의 준비 과정을 개선하여 포자 사용량을 줄이고 종자 배양 효율을 향상시키며, 또 종자의 성장 환경을 최적의 상태로 일정하게 유지시킬 수 있고, 배양 환경을 균체의 성장 상태에 따라 실시간으로 피드백 조정해서 균종의 퇴화를 방지하고, 종자액의 품질을 안정적으로 보증하여 발효 수준을 향상시킬 수 있는 방법은 현재 구연산 생산에서 해결해야 할 긴급한 문제이다.
종래의 기술에 존재하는 상기 문제에 대해, 본 발명 청구인은 일종의 아스페르길루스 니제르 종자의 연속 배양 및 그 구연산 생산 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 다세포 사상균의 느린 성장 및 연속 배양 중 균사체가 유실되기 쉬운 문제를 획기적으로 해결하여 종자의 연속 배양을 완전히 구현함으로써, 균체가 최적의 성장 환경에서 일정할 수 있게 하여 균종의 퇴화를 방지하고, 종자액을 연속적이고 안정적인 고활력 상태로 유지시켜 해당 발효 지표를 뚜렷하게 상승시킨다.
본 발명의 기술방안은 다음과 같다.
일종의 아스페르길루스 니제르 종자의 연속 배양 방법에서, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다.
(1) 시작 단계 : 아스페르길루스 니제르 종자를 종자 배양기에 접종하고, 16~36h 동안 배양하여 종자액을 얻는다.
(2) 종자 연속 배양 단계 : 단계 (1)에서 얻은 종자액을 연속 분산 처리하고, 분산시켜 얻은 종자액을 연속 배양시키며, 배양 과정 중 종자액을 발효 배양기로 연속 유출시켜 발효 배양하고, 동시에 유출 종자액과 동일한 속도로 신선한 종자를 피딩 배양기에 보충한다.
(3) 단계 중지 : 신선한 종자의 피딩 배양기 보충 및 분산 처리를 중지하고, 계속해서 배양시켜 종자액을 얻은 후, 종자액을 발효 배양기로 이식하여 발효 배양을 진행한다.
단계 (1) 중 아스페르길루스 니제르 포자 접종 후 최종농도는 1~9*105개/mL이다. 단계 (1) 중 종자 배양기의 총 당은 100~180g/L, C/N은 20~40이다. 단계 (1) 중 종자 배양 조건은 온도 35~39℃, 풍량 0.2~0.4vvm， 탱크 압력 0.05~0.1Mpa, 교반 회전속도 100~200rpm이다.
단계 (2) 중 신선한 종자가 보충된 피딩 배양기의 총 당은 150~200g/L, C/N은 15-30이다. 단계 (2) 중의 연속 배양 조건은 온도 35~37℃, 풍량 0.3~0.6vvm, 탱크 압력 0.05~0.07Mpa, 교반 회전속도 150~200 rpm이다.
단계 (3) 중 연속 배양의 배양 조건 : 온도 35~39℃, 풍량 0.3~0.6vvm, 탱크 압력 0.05~0.1Mpa, 교반 회전속 150~200rpm이다.
단계 (2) 중 상기 종자액 연속 분산 처리 방법 : 분산기를 사용해 종자액 중의 균사체를 10~80μm의 솜털 모양 균사로 분산시킨다.
단계 (2) 중 신선한 종자의 피딩 배양기 보충 속도와 종자액 유출 속도는 F=V/t이고, 그중 V는 종자 탱크 내의 종자액 부피이며, 다른 탱크로 진행해 확정한다. t는 종자액의 체류시간이고, 솜털 모양 균사의 세포농도에 따라 피드백 조절하며, 보통 6~24h이다.
단계 (2), 단계 (3) 중 발효 접종 비율은 5~25%(v/v)이다.
단계 (2), 단계 (3) 중 발효 배양기의 총 당은 160~200g/L이고, C/N은 50-90이다. 단계 (2), 단계 (3) 중 발효 배양 조건은 온도 35~39℃, 풍량 0.1~0.4vvm, 탱크 압력 0.05~0.1Mpa, 발효 회전속도 100~200rpm이며, 환원당 농도가 5g/L 미만일 때 발효를 중지한다.
상기 종자 배양기, 신선한 종자 피딩 배양기, 발효 배양기는 각각 전분 소재 원료의 액화액과 질소원을 배합하여 만든다. 상기 전분 소재 원료는 적어도 옥수수 가루, 타피오카 가루, 수수 가루, 밀가루 전분 중의 일종을 포함한다. 상기 질소원은 적어도 황산 암모늄, 요소, 콩깻묵 가루, 옥수수 침지액 중의 일종을 포함한다.
일종의 구연산을 생산하는 방법에서, 그 방법은 종자 연속 배양 방법에서 얻은 아스페르길루스 니제르를 사용해 발효를 진행하여 구연산을 생산한다.
본 발명의 유익한 기술효과는 다음과 같다.
본 발명은 사상균의 종자 연속 배양을 완전하게 구현하였고, 특허 CN201410329652.X와 비교해서 설비 시스템을 대폭 간소화시키며, 종자 탱크 사용량도 1/3로 감소시킨다. 조작 단계도 줄이고, 생산효울을 뚜렷하게 향상시키며, 각 배치의 발효 탱크에 해당되는 종자 배양 보조시간을 12h 단축시킨다. 종자 배양 자동화 수준을 향상시킨다.
본 발명의 종자 연속 배양 방법에서, 특허 CN201410329652.X와 비교해서, 균종 계대배양 횟수를 감소시켜서 균종 퇴화를 효율적으로 방지하고, 15일 연속 종자의 활력을 떨어뜨리지 않고 지속시킬 수 있어서 발효 지표가 안정적이다. 고효율의 연속 실행으로 시작 중지의 보조시간을 단축시킬 수 있을 뿐 아니라, 아스페르길루스 니제르 포자의 사용량도 1/3 줄일 수 있어서 아스페르길루스 니제르 포자의 배양 비용을 대폭 절감할 수 있다.
본 발명 방법의 획기적 장점은 균체가 최적의 성장 환경에서 일정하게 유지되어서 종자가 항상 안정적인 고활력 성숙 상태를 계속 유지할 수 있기 때문에, 종자액 품질의 안정성과 일치성을 보증할 수 있다는 점이다. 특허 CN201410329652.X 중의 종자는 비연속 간헐적 배양을 사용하고, 탱크 내 pH가 끊임없이 떨어지고 영양물질이 점점 소모되며, 배양 조건이 점점 균체의 성장과 활력 유지에 불리해짐에 따라서, 종자액의 품질에 영향을 미치고, 배치 간 종자액 품질 차이가 비교적 크다. 더 큰 단점은 발효탱크 내로 이식한 종자액이 분산기 처리된 후의 분산 균사이므로, 발효 탱크 초기 단계에서 성장을 회복해야 하기 때문에, 발효 지표에 영향을 미친다. 특허 CN201410329652.X와 비교해서, 발효 초기 당 농도가 16%일 때, 발효 강도는 27.5% 향상되고, 발효 전환율은 3.4% 향상되며, 발효 안정성도 뚜렷하게 향상된다.
또한, 종자의 활력이 향상되고 산 생산 속도가 증가되기 때문에, 본 발명의 방법은 고농도 발효 조건 하에서 특허 CN201410329652.X보다 장점이 더 많다. 발효 초기 당농도를 18%로 높이면, 발효 산 생산은 18% 이상, 발효주기는 60h 미만, 발효 전환율은 100% 이상이고, 발효강도는 31.6% 향상되며, 발효 전환율도 4.8% 향상될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 구연산의 고농도, 고전환율 및 고효율의 발효 생산을 완전하게 구현할 수 있고, 구연산 산업의 기술 향상에 중요한 촉진 역할을 한다.
본 발명은 처음으로 연속 피딩과 연속 분산을 결합시켜 아스페르길루스 니제르 종자의 연속 배양을 구현하는 방법을 사용함으로써, 최적의 체류시간과 균사 크기를 확정하고, 얻은 종자를 각 단계에서 배양시키는 배양 매개변수를 최적화하여, 다세포 사상균의 느린 성장 및 연속 배양 중에서 균사체가 유실되기 쉬운 문제를 해결하고, 종자의 연속 배양을 완전히 구현함으로써, 균체를 최적의 성장 환경 속에서 일정하게 유지시켜서 균체의 퇴화를 방지하고, 종자액을 안정적인 고활력 상태에 지속적으로 유지시켜서 해당 발효 지표를 뚜렷하게 향상시킨다.
도 1은 CN201410329652.X의 배양 방법 결선도,
도 2는 본 발명의 배양 방법 결선도이다.
다음은 도면과 실시예를 결합시킨 본 발명에 대한 구체적 설명이다.
아래 실시예와 비교예에 사용된 원료와 시제는 모두 시중에서 판매되는 제품이다. 아스페르길루스 니제르균 출처는 중국 산업 미생물 균종 보관 관리센터(CICC), 보관 번호 CICC 40021이다. 총 당, 환원당 측정은 모두 펠링 적정법을 사용하고, 질소원 측정은 켈달법을 사용하며, 구연산은 0.1429 mol/L의 NaOH 적정법을 사용해 측정하고, 포자 계수는 혈구계수판을 사용한다. 특별한 설명이 없으면, 모두 본 영역의 일반적인 설비와 공정 방법을 사용한다.
실시예 1
옥수수 가루와 수돗물을 1:3의 질량비로 골고루 혼합하고, Ca(OH)2를 사용해 슬러리 pH를 6.0으로 조정하며, 옥수수 가루 20U/g의 첨가량에 따라 α-고온 아밀레이스를 첨가한다, 분사 액화를 거쳐 요오드 테스트에서 라이트 브라운이 되면 합격 옥수수 액화액을 얻는다. 80%의 옥수수 액화액을 플레이트 및 프레임 여과를 통해 잔여물을 제거해서 옥수수 당액을 얻는다.
시작 단계 : 옥수수 액화액과 황산암모늄을 배합해서 종자 배양기를 만들고 (총 당 100g/L, C/N 20), 멸균 냉각시킨 후 아스페르길루스 니제르 포자를 종자 배양기로 접종하며, 포자의 최종농도는 9*105개/mL이고, 온도 35℃, 풍량 0.2vvm, 탱크 압력 0.05Mpa, 교반 회전속도 100rpm 조건 하에서 16h 배양해서 종자액을 얻는다.
연속 단계 : 옥수수 액화액과 황산암모늄을 배합해서 종자 피딩 배양기를 만든다 (총 당 150g/L, C/N 15). 분산기를 이용해 얻은 종자액을 연속 분산 처리하고, 균사체를 10μm의 솜털 모양 균사로 분산시킨다. 동시에 체류시간 6h에 따라 신선한 종자를 피딩 배양기에 연속 보충하는 속도를 제어하고, 종자액을 동일한 속도로 발효 배양기로 유출시켜 발효 배양을 진행한다. 종자 연속 배양 단계의 배양 온도는 35℃, 풍량은 0.3vvm, 탱크 압력은 0.05Mpa, 교반 회전속도는 150rpm이다.
중지 단계 : 종자 활력을 측정하여 감소하는 추세를 나타낼 때, 신선한 종자의 피딩 배양기 보충과 분산 처리를 중지하고, 남은 종자액을 발효 배양기로 이식하여 발효 배양을 진행한다. 그 단계의 종자 배양 조건은 온도 35℃, 풍량 0.3vvm, 탱크 압력 0.05Mpa, 교반 회전속도 150rpm이다.
발효 배양기는 옥수수 액화액, 옥수수 당액과 황산암모늄을 배합해서 만든다 (총 당 160g/L, C/N 50). 발효 접종 비율은 25%(v/v)이다. 발효 배양 조건은 온도 35℃, 풍량 0.1vvm, 탱크 압력 0.05Mpa, 교반 회전속도 100 rpm이며, 환원당 농도가 5g/L 미만일 때 발효를 중단한 후, 각 배치의 발효 산도, 잔류 당을 측정하고, 전환율, 발효 강도 등의 지표를 계산한다.
실시예 2
옥수수 가루와 수돗물을 1:3의 질량비로 골고루 혼합하고, Ca(OH)2를 사용해 슬러리 pH를 6.0으로 조정하며, 옥수수 가루 20U/g의 첨가량에 따라 α-고온 아밀레이스를 첨가한다, 분사 액화를 거쳐 요오드 테스트에서 라이트 브라운이 되면 합격 옥수수 액화액을 얻는다. 80%의 옥수수 액화액을 플레이트 및 프레임 여과를 통해 잔여물을 제거해서 옥수수 당액을 얻는다. 타피오카 가루와 수돗물을 1:3의 질량비로 골고루 혼합하고, Ca(OH)2를 사용해 슬러리 pH를 6.0으로 조정하며, 타피오카 가루 20U/g의 첨가량에 따라 α-고온 아밀레이스를 첨가한다, 분사 액화를 거쳐 요오드 테스트에서 라이트 브라운이 되면 합격 타피오카 당액을 얻는다.
시작 단계 : 옥수수 액화액과 요소를 배합해서 종자 배양기를 만들고 (총 당 140g/L, C/N 30), 멸균 냉각시킨 후 아스페르길루스 니제르 포자를 종자 배양기로 접종하며, 포자의 최종농도는 4.5*105개/mL이고, 온도 37℃, 풍량 0.3vvm, 탱크 압력 0.075Mpa, 교반 회전속도 150rpm 조건 하에서 26h 배양해서 종자액을 얻는다.
연속 단계 : 옥수수 액화액과 요소를 배합해서 종자 피딩 배양기를 만든다 (총 당 175g/L, C/N 23). 분산기를 이용해 얻은 종자액을 연속 분산 처리하고, 균사체를 45μm의 솜털 모양 균사로 분산시킨다. 동시에 체류시간 15h에 따라 신선한 종자를 피딩 배양기에 연속 보충하는 속도를 제어하고, 종자액을 동일한 속도로 발효 배양기로 유출시켜 발효 배양을 진행한다. 종자 연속 배양 단계의 배양 온도는 36℃, 풍량은 0.45vvm, 탱크 압력은 0.06Mpa, 교반 회전속도는 175rpm이다.
중지 단계 : 종자 활력을 측정하여 감소하는 추세를 나타낼 때, 신선한 종자의 피딩 배양기 보충과 분산 처리를 중지하고, 남은 종자액을 발효 배양기로 이식하여 발효 배양을 진행한다. 그 단계의 종자 배양 조건은 온도 37℃, 풍량 0.45vvm, 탱크 압력 0.075Mpa, 교반 회전속도 175rpm이다.
발효 배양기는 옥수수 액화액, 옥수수 당액, 타피오카 당액과 요소를 배합해서 만든다 (총 당 180g/L, C/N 70). 발효 접종 비율은 15%(v/v)이다. 발효 배양 조건은 온도 37℃, 풍량 0.25vvm, 탱크 압력 0.075Mpa, 교반 회전속도 150 rpm이며, 환원당 농도가 5g/L 미만일 때 발효를 중단한 후, 각 배치의 발효 산도, 잔류 당을 측정하고, 전환율, 발효 강도 등의 지표를 계산한다.
실시예 3
옥수수 가루와 수돗물을 1:3의 질량비로 골고루 혼합하고, Ca(OH)2를 사용해 슬러리 pH를 6.0으로 조정하며, 옥수수 가루 20U/g의 첨가량에 따라 α-고온 아밀레이스를 첨가한다, 분사 액화를 거쳐 요오드 테스트에서 라이트 브라운이 되면 합격 옥수수 액화액을 얻는다. 80%의 옥수수 액화액을 플레이트 및 프레임 여과를 통해 잔여물을 제거해서 옥수수 당액을 얻는다. 밀가루 전분 가루와 수돗물을 1:3의 질량비로 골고루 혼합하고, Ca(OH)2를 사용해 슬러리 pH를 6.0으로 조정하며, 밀가루 전분 가루 20U/g의 첨가량에 따라 α-고온 아밀레이스를 첨가한다, 분사 액화를 거쳐 요오드 테스트에서 라이트 브라운이 되면 합격 밀가루 당액을 얻는다.
시작 단계 : 옥수수 액화액과 콩깻묵 가루를 배합해서 종자 배양기를 만들고 (총 당 180g/L, C/N 40), 멸균 냉각시킨 후 아스페르길루스 니제르 포자를 종자 배양기로 접종하며, 포자의 최종농도는 1*105개/mL이고, 온도 39℃, 풍량 0.4vvm, 탱크 압력 0.1Mpa, 교반 회전속도 200rpm 조건 하에서 36h 배양해서 종자액을 얻는다.
연속 단계 : 옥수수 액화액과 콩깻묵 가루를 배합해서 종자 피딩 배양기를 만든다 (총 당 200g/L, C/N 30). 분산기를 이용해 얻은 종자액을 연속 분산 처리하고, 균사체를 80μm의 솜털 모양 균사로 분산시킨다. 동시에 체류시간 24h에 따라 신선한 종자를 피딩 배양기에 연속 보충하는 속도를 제어하고, 종자액을 동일한 속도로 발효 배양기로 유출시켜 발효 배양을 진행한다. 종자 연속 배양 단계의 배양 온도는 37℃, 풍량은 0.6vvm, 탱크 압력은 0.07Mpa, 교반 회전속도는 200rpm이다.
중지 단계 : 종자 활력을 측정하여 감소하는 추세를 나타낼 때, 신선한 종자의 피딩 배양기 보충과 분산 처리를 중지하고, 남은 종자액을 발효 배양기로 이식하여 발효 배양을 진행한다. 그 단계의 종자 배양 조건은 온도 39℃, 풍량 0.6vvm, 탱크 압력 0.1Mpa, 교반 회전속도 200rpm이다.
발효 배양기는 옥수수 액화액, 옥수수 당액, 밀가루 당액과 콩깻묵 가루를 배합해서 만든다 (총 당 200g/L, C/N 90). 발효 접종 비율은 5%(v/v)이다. 발효 배양 조건은 온도 39℃, 풍량 0.4vvm, 탱크 압력 0.1Mpa, 교반 회전속도 200 rpm이며, 환원당 농도가 5g/L 미만일 때 발효를 중단한 후, 각 배치의 발효 산도, 잔류 당을 측정하고, 전환율, 발효 강도 등의 지표를 계산한다.
비교예 1（CN201410329652.X 중 실시예 1）
포도당과 콩깻묵 가루를 각각 배합해서 종자 배양기(총 당 80g/L, 총 질소 1.5g/L)와 발효 배양기(총 당 160g/L, 총 질소 1.5g/L)를 만든다. 종자 이식 후 포자 농도는 55만 개/mL 접종이다. 20h 접종해서 성숙한 종자액을 얻으며, 종자액 균사는 분산기를 통해 분산되고, 처리된 후의 균체 평균 직경은 100μm으로 각각 다음 단계의 종자 배양기와 발효 배양기로 이식된다. 그중 다음 단계의 발효 배양기로 이식해서 발효 배양기 중 환원당 농도가 5g/L 미만으로 떨어지면 발효를 중지한다. 이렇게 종자 활력이 뚜렷하게 쇠퇴할 때까지 순환시킨 후 중지한다. 각 배치의 발효 산도, 잔류 당을 측정하고, 전환율, 발효 강도 등의 지표를 계산한다.
비교예 2
발효 배양기의 총 당은 180g/L이고, 총 질소는 1.5g/L이다. 기타 조건은 비교예 1과 동일하다.
비교예 3
옥수수 가루 액화액과 옥수수 당액 준비는 실시예 1과 동일하다. 옥수수 액화액과 황산암모늄을 배합해서 종자 배양기(총 당 120g/L, 총 질소 2g/L)와 발효 배양기(총 당 160g/L, 총 질소 1.0g/L)를 만든다. 아스페르길루스 니제르 포자를 종자 배양기로 접종하고, 포자의 최종농도는 4*105개/mL이며, 20h 배양해서 1단계 성숙 종자액을 얻는다. 70%의 성숙 종자액을 제 1 배치 발효 배양기로 이전해서 배양하며, 환원당 농도가 5g/L 미만일 때 발효를 중지한다. 남은 30% 종자액을 분산기를 통해 처리해서 얻은 균사체 또는 균류의 평균 직경은 62μm이며, 종자 배양기로 이전해 16h 배양해서 다시 2단계 성숙 종자액을 얻는다. 이렇게 종자 활력이 뚜렷하게 쇠퇴할 때까지 순환시킨 후 중지한다. 각 배치의 발효 산도, 잔류 당을 측정하고, 전환율, 발효 강도 등의 지표를 계산한다.
비교예 4
옥수수 가루 액화액과 옥수수 당액 준비는 실시예 1과 동일하다. 옥수수 액화액과 황산암모늄을 배합해서 종자 배양기(총 당 120g/L, 총 질소 2g/L)와 발효 배양기(총 당 160g/L, 총 질소 1.0g/L)를 만든다. 아스페르길루스 니제르 포자를 종자 배양기로 접종하고, 포자의 최종농도는 4*105개/mL이며, 20h 배양해서 1단계 성숙 종자액을 얻는다. 70%의 성숙 종자액을 제 1 배치 발효 배양기로 이전해서 배양하며, 환원당 농도가 5g/L 미만일 때 발효를 중지한다. 남은 30% 종자액을 분산기를 통해 처리해서 얻은 균사체 또는 균류의 평균 직경은 50μm이며, 신선한 종자 배양기를 남은 종자액에 보충해 16h 배양해서 다시 2단계 성숙 종자액을 얻는다. 이렇게 종자 활력이 뚜렷하게 쇠퇴할 때까지 순환시킨 후 중지한다. 각 배치의 발효 산도, 잔류 당을 측정하고, 전환율, 발효 강도 등의 지표를 계산한다.
비교예 5
종자 연속 배양 단계 중 신선한 종자를 피딩 배양기로 연속 보충하는 속도는 체류시간 4h에 따라 제어한다. 기타 조건은 실시예 1과 동일하다.
비교예 6
종자 연속 배양 단계 중 종자 피딩 배양기의 C/N은 40이다. 기타 조건은 실시예 1과 동일하다.
시험예 1
실시예 1과 비교예 1, 3, 4의 기술 효과 비교는 표 1과 같다.
표 1
Figure pct00001
실시예 1과 비교예 1, 3, 4의 기술 효과 비교 : (1) 본 발명의 방법은 특허 CN201410329652.X보다 설비 시스템이 간소화되고, 종자 탱크 사용량이 1/3로 감소된다. 조작 단계가 감소되고, 생산 효율이 뚜렷하게 향상되며, 각 배치의 발효 탱크에 해당되는 종자 배양 보조시간이 12h 절약된다. (2) 본 발명의 방법 연속 실행시간이 더 길며, 아스페르길루스 니제르 포자의 사용량이 1/3 감소되고, 아스페르길루스 니제르 포자의 배양 비용이 대폭 감소된다. (3) 특허 CN201410329652.X와 비교해서, 발효 초기 당 농도가 16%일 때, 발효 강도가 27.5% 향상되고, 발효 전환율이 3.4% 향상된다.
시험예 2
실시예 2와 비교예 2의 기술 효과 비교는 표 2와 같다.
표 2
Figure pct00002
실시예 2와 비교예 2의 기술 효과를 비교하면, 본 발명의 방법은 고농도 발효 조건 하에서 특허 CN201410329652.X보다 더 많은 장점을 갖는다. 발효 초기 당 농도가 18%로 향상되면, 발효 산 생산 18% 이상, 발효 주기 60h 미만, 발효 전환율 100% 이상이고, 발효 강도는 31.6% 향상되며, 발효 전환율은 4.8% 향상된다. 따라서, 본 발명의 방법을 이용하면, 구연산의 고농도, 고전환율 및 고효율의 발효 생산을 완전하게 구현하고, 구연산 산업의 기술 향상에 중요한 촉진 역할을 할 수 있다.
시험예 3 : 본 발명의 실시예 1과 비교예 5, 6의 성능 비교는 표 3과 같다.
표 3
Figure pct00003
본 발명의 실시예 1과 비교예 5, 6의 성능을 비교하면, 종자 연속 배양 단계의 체류시간과 피딩 배양기 C/N 등의 매개변수를 변경하면, 종자의 연속 실행시간이 뚜렷하게 영향을 받아 실행시간이 단축되며, 종자 활력이 신속하게 떨어지고, 해당 발효 전환율, 발효 강도 등의 지표도 뚜렷하게 감소한다.
이상 상기 설명은 본 발명의 최적화 실시방식일 뿐이며, 본 발명은 상기 실시예에 국한되지 않는다. 본 영역의 기술자가 본 발명의 정신 및 개념을 벗어나지 않는 전제 하에서 직접 도출하거나 연상한 기타 개선이나 변화는 모두 본 발명의 보호범위 내에 포함된다는 점을 알아야 한다.

Claims (10)

  1. (1) 시작 단계 : 아스페르길루스 니제르 포자를 종자 배양기로 접종하여 16~36h 배양해서 종자액을 얻으며,
    (2) 종자 연속 배양 단계 : 단계 (1)에서 얻은 종자액을 연속 분산 처리하고, 분산시켜 얻은 종자액을 연속 배양하며, 배양 과정 중 종자액을 발효 배양기로 연속 유출시켜 발효 배양하고, 동시에 종자액을 유출시키는 동일한 속도로 신선한 종자를 피딩 배양기에 보충하며,
    (3) 중지 단계 : 신선한 종자의 피딩 배양기 보충과 분산 처리를 중지하고, 계속 배양시켜 종자액을 얻은 후, 종자액을 발효 배양기로 이식시켜 발효 배양을 진행하며,
    상기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 아스페르길루스 니제르 종자의 연속 배양 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    단계 (1) 중의 아스페르길루스 니제르 포자를 접종한 후 최종농도는 1~9*105개/mL이며,
    단계 (1) 중의 종자 배양기의 총 당은 100~180g/L, C/N은 20~40이며,
    단계 (1) 중의 종자 배양 조건은 온도 35~39℃, 풍량 0.2~0.4vvm, 탱크 압력 0.05~0.1Mpa, 교반 회전속도 100~200rpm인 것을 특징으로 하는 아스페르길루스 니제르 종자의 연속 배양 방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    단계 (2) 중의 신선한 종자가 보충된 피딩 배양기의 총 당은 150~200g/L, C/N은 15~30이며,
    단계 (2) 중의 연속 배양 조건은 온도 35~37℃, 풍량 0.3~0.6vvm, 탱크 압력 0.05~0.07Mpa, 교반 회전속도 150~200rpm인 것을 특징으로 하는 아스페르길루스 니제르 종자의 연속 배양 방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    단계 (3) 중의 연속 배양 조건은 온도 35~39℃, 풍량 0.3~0.6vvm, 탱크 압력 0.05~0.1Mpa, 교반 회전속도 150~200rpm인 것을 특징으로 하는 아스페르길루스 니제르 종자의 연속 배양 방법.
  5. 제 1항에 있어서,
    단계 (2) 중의 상기 종자액 연속 분산 처리 방법이 분산기를 사용해 종자액 중의 균사체를 10~80μm의 솜털 모양 균사로 분산시키는 것을 특징으로 하는 아스페르길루스 니제르 종자의 연속 배양 방법.
  6. 제 1항에 있어서.
    단계 (2) 중의 신선한 종자의 피딩 배양기 보충 속도와 종자액 유출속도는 F=V/t이며, 그중 V는 종자 탱크 내의 종자액 부피이고, 다른 탱크로 확인하며,
    t는 종자액 체류시간이며, 솜털 모양 균사의 세포 농도에 따라 피드백 조정하고, 보통 6-24h을 취하는 것을 특징으로 하는 아스페르길루스 니제르 종자의 연속 배양 방법.
  7. 제 1항에 있어서,
    단계 (2), 단계 (3) 중의 발효 접종비율이 5~25%(v/v)인 것을 특징으로 하는 아스페르길루스 니제르 종자의 연속 배양 방법.
  8. 제 1항에 있어서,
    단계 (2), 단계 (3) 중의 발효 배양기의 총 당은 160~200g/L, C/N은 50-90이며,
    단계 (2), 단계 (3) 중의 발효 배양 조건은 온도 35~39℃, 풍량 0.1~0.4vvm, 탱크 압력 0.05~0.1Mpa, 교반 회전속도 100~200rpm이고, 환원당 농도가 5g/L 미만일 때 발효를 중지하는 것을 특징으로 하는 아스페르길루스 니제르 종자의 연속 배양 방법.
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 종자 배양기, 신선한 종자의 피딩 배양기, 발효 배양기는 각각 전분 소재 원료 액화액과 질소원을 배합해서 만들며,
    상기 전분 소재 원료는 적어도 옥수수 가루, 타피오카 가루, 수수 가루, 밀가루 전분 중의 일종을 포함하며,
    상기 질소원은 적어도 황산 암모늄, 요소, 콩깻묵 가루, 옥수수 침지액 중의 일종을 포함하는 것을 특징으로 하는 아스페르길루스 니제르 종자의 연속 배양 방법.
  10. 제 1항의 상기 종자 연속 배양 방법을 사용해 얻은 아스페르길루스 니제르를 발효시켜 구연산을 생산하는 것을 특징으로 하는 구연산 생산 방법.
KR1020197006893A 2018-08-28 2018-12-24 아스페르길루스 니제르 종자의 연속 배양 및 그 구연산 생산 방법 KR102174885B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810986196.4A CN109055444B (zh) 2018-08-28 2018-08-28 一种黑曲霉种子连续培养及其生产柠檬酸的方法
CN2018109861964 2018-08-28
PCT/CN2018/123053 WO2020042481A1 (zh) 2018-08-28 2018-12-24 一种黑曲霉种子连续培养及其生产柠檬酸的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20200026783A true KR20200026783A (ko) 2020-03-11
KR102174885B1 KR102174885B1 (ko) 2020-11-06

Family

ID=64757502

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020197006893A KR102174885B1 (ko) 2018-08-28 2018-12-24 아스페르길루스 니제르 종자의 연속 배양 및 그 구연산 생산 방법

Country Status (7)

Country Link
US (1) US11434467B2 (ko)
EP (1) EP3640337B1 (ko)
JP (1) JP6937366B2 (ko)
KR (1) KR102174885B1 (ko)
CN (1) CN109055444B (ko)
BR (1) BR112019008405A2 (ko)
WO (1) WO2020042481A1 (ko)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109055444B (zh) 2018-08-28 2020-06-05 江苏国信协联能源有限公司 一种黑曲霉种子连续培养及其生产柠檬酸的方法
CN111349570A (zh) * 2018-12-24 2020-06-30 中粮生物化学（安徽）股份有限公司 一种制备黑曲霉种子的方法和柠檬酸的发酵方法
CN109609391B (zh) * 2019-02-15 2023-03-17 福州大学 一种菌丝球的定量接种方法
CN112535253A (zh) * 2020-12-08 2021-03-23 江南大学 一种高效脱除苹果渣中展青霉素的生物脱毒方法
CN112553284B (zh) 2020-12-30 2021-12-14 甘肃省科学院生物研究所 一种自然共生的混合培养物降解粗饲料生产柠檬酸的方法
CN112753930B (zh) * 2021-01-14 2023-07-14 陕西省微生物研究所 一种食品级二氧化硫脱除剂及其制备方法和应用方法
CN114045313B (zh) * 2021-09-30 2023-09-22 日照金禾博源生化有限公司 一种通过控制黑曲霉菌球形态来调控柠檬酸发酵的方法
CN114774325A (zh) * 2022-05-11 2022-07-22 中国烟草中南农业试验站 促进作物氮素利用的复合微生物菌剂、制备方法及应用
CN116515713A (zh) * 2023-06-06 2023-08-01 天津科技大学 一种生产菌种培养方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0731468A (ja) * 1993-07-19 1995-02-03 Yamasa Shoyu Co Ltd 糸状菌の連続液体培養法
JPH07121218A (ja) * 1991-10-30 1995-05-12 Enshu Ltd 対話プログラミングのミラーイメージ入力方法
KR100892355B1 (ko) * 2008-01-07 2009-04-08 (주)큐젠바이오텍 치마버섯 균사체의 반연속식 액상배양을 통한 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸 대량생산 방법
CN104099253A (zh) * 2014-07-11 2014-10-15 江南大学 基于菌丝球分散技术的柠檬酸黑曲霉种子连续培养方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102250971B (zh) * 2010-12-23 2013-11-27 日照金禾博源生化有限公司 一种柠檬酸的发酵生产方法
CN102409066B (zh) * 2011-12-15 2013-09-25 中粮生物化学（安徽）股份有限公司 一种柠檬酸的发酵方法
CN102864082B (zh) * 2012-09-19 2014-04-30 中粮生物化学（安徽）股份有限公司 柠檬酸发酵种子培养的方法及发酵制备柠檬酸的方法
CN103290070B (zh) 2013-06-20 2015-03-11 南通凯赛生化工程设备有限公司 一种连续流加补料发酵生产柠檬酸的方法
CN104087624B (zh) * 2014-07-11 2017-08-08 江南大学 黑曲霉连续发酵生产柠檬酸的方法
CN104531541B (zh) * 2014-12-16 2017-12-22 日照金禾博源生化有限公司 一种柠檬酸发酵种子罐培养工艺
CN109055444B (zh) 2018-08-28 2020-06-05 江苏国信协联能源有限公司 一种黑曲霉种子连续培养及其生产柠檬酸的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07121218A (ja) * 1991-10-30 1995-05-12 Enshu Ltd 対話プログラミングのミラーイメージ入力方法
JPH0731468A (ja) * 1993-07-19 1995-02-03 Yamasa Shoyu Co Ltd 糸状菌の連続液体培養法
KR100892355B1 (ko) * 2008-01-07 2009-04-08 (주)큐젠바이오텍 치마버섯 균사체의 반연속식 액상배양을 통한 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸 대량생산 방법
CN104099253A (zh) * 2014-07-11 2014-10-15 江南大学 基于菌丝球分散技术的柠檬酸黑曲霉种子连续培养方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Bioprocess Biosyst. Eng., Vol. 40, pp. 45-53 (2016.08.29.)* *
RSC Adv., Vol. 6, pp. 105003-105009 (2016.10.19.) *

Also Published As

Publication number Publication date
EP3640337A4 (en) 2020-04-22
EP3640337A1 (en) 2020-04-22
US11434467B2 (en) 2022-09-06
KR102174885B1 (ko) 2020-11-06
EP3640337B1 (en) 2022-04-13
BR112019008405A2 (pt) 2020-05-26
CN109055444B (zh) 2020-06-05
US20200231929A1 (en) 2020-07-23
CN109055444A (zh) 2018-12-21
JP6937366B2 (ja) 2021-09-22
WO2020042481A1 (zh) 2020-03-05
JP2020534787A (ja) 2020-12-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20200026783A (ko) 아스페르길루스 니제르 종자의 연속 배양 및 그 구연산 생산 방법
KR102015829B1 (ko) 온라인 산소 소비율과 전도율의 통합 제어를 기반으로 한 코엔자임 q10 발효 생산 공정
CN102550293B (zh) 一种双孢蘑菇菌种的液体发酵培养方法
CN101250485B (zh) 一种提高纤维素酶产量的里氏木霉培养方法
CN102409066A (zh) 一种柠檬酸的发酵方法
CN102533889B (zh) 一种赖氨酸连续发酵的方法
CN104099253A (zh) 基于菌丝球分散技术的柠檬酸黑曲霉种子连续培养方法
CN107815421B (zh) 一种黑曲霉种子培养及其制备柠檬酸的方法
CN103074401B (zh) 一种硫酸新霉素的生产方法
CN105925495B (zh) 一种高活性粉状毕赤酵母菌粉及其制备方法
CN109161508A (zh) 一种微生物培养基及其制备方法与应用
CN104277978A (zh) 黑曲霉种子液的制备方法以及发酵制备柠檬酸的方法
CN101182499A (zh) 一种以甘油为碳源的制备植酸酶的方法
CN105543112B (zh) 一种黑曲霉种子培养方法
CN101638675A (zh) 一种蔗糖发酵法生产柠檬酸的方法
CN105602995B (zh) 一种液体深层快速发酵制备浒苔生物肥的方法
CN106755146B (zh) 一种连续发酵生产长链二元酸的方法及装置
Kim et al. Control of intracellular ammonium level using specific oxygen uptake rate for overproduction of citric acid by Aspergillus niger
CN105586366A (zh) 一种基于控制菌丝体结构改善柠檬酸发酵性能的方法
CN106957882A (zh) 一种发酵制备柠檬酸的方法
CN110129205A (zh) 一种白灵菇液体菌种培养基及白灵菇液体菌种制备方法
CN104498542A (zh) 连续法发酵生产l-乳酸的方法
CN106754564A (zh) 一种红椒根际促生菌液体发酵的方法
CN106947713A (zh) 一种用于培养细黄链霉菌的培养基及其培养黄链霉菌的方法
CN105647881A (zh) 一种高活力漆酶液的制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right