CN105925495B - 一种高活性粉状毕赤酵母菌粉及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种高活性粉状毕赤酵母菌粉及其制备方法，该制备方法包括活化培养、一级种子培养、制备高密度液体发酵培养基、发酵培养、补料与添加辅料等步骤。该制备方法可显著提高单位产量30％左右，降低单位成本20％左右，大大提高了设备利用率；复合保护剂和载体赋予了菌体本身最佳保护，从而可以获得高活性粉状毕赤酵母菌粉；本发明与传统离心喷雾干燥生产工艺相比，采用冷风干燥技术干燥温度较低，更好地保留了生物活性，克服了传统工艺低活菌、高投入的缺点，具有广阔的市场前景。

Description

一种高活性粉状毕赤酵母菌粉及其制备方法
【技术领域】
本发明属于生物技术领域。更具体地，本发明涉及一种高活性粉状毕赤酵母菌粉的制备方法，还涉及采用所述制备方法制备得到的高活性粉状毕赤酵母菌粉。
【背景技术】
粉状毕赤酵母作为工业菌种具有非常广泛的用途。它不仅可以治理养殖业生产过程中氨氮的排放，还可以为畜禽类提供优质活性蛋白，提高畜禽产品质量；一些研究工作表明，粉状毕赤酵母不仅对土壤盐碱性有良好的改良效果，以及对根结线虫有较强的抑制作用，而且还可以提高作物产量；粉状毕赤酵母可促进有机物料腐熟，是有机物料腐熟剂生产中的重要菌种；粉状毕赤酵母在有机肥堆肥发酵过程中可抑制畜禽粪便氨气挥发，起到除氨保氮的作用。由此可见，大力发展粉状毕赤酵母产业有非常广阔的市场前景。
目前市场上的粉状毕赤酵母菌粉较少，活菌数较低，稳定性也较差。主要是由于其本身耐受性较低，不适合进行喷雾干燥，然而冷冻干燥成本又相对较高，因此严重制约了粉状毕赤酵母产业化生产。
针对现有技术存在的技术缺陷，本发明人在总结现有技术基础之上，通过大量实验研究与分析，终于完成了本发明。
【发明内容】
[要解决的技术问题]
本发明的目的是提供一种高活性粉状毕赤酵母菌粉的制备方法。
本发明的另一个目的是提供采用所述制备方法制备得到的高活性粉状毕赤酵母菌粉。
[技术方案]
本发明是通过下述技术方案实现的。
本发明涉及一种粉状毕赤酵母高活性菌粉的制备方法。
该制备方法的步骤如下：
A、活化培养
用无菌吸管吸取0.3～0.5mL麦芽汁液体培养基，滴入装有冻干的粉状毕赤酵母ACCC20136的安瓿内，轻轻振荡，使其溶解呈悬浮状，吸取全部菌悬液，放于1L麦芽汁培养基中，在温度26～30℃下活化培养2～3d；
按照以YPD培养基重量计3～5％接种量，将活化培养的粉状毕赤酵母ACCC20136接种于YPD培养基斜面上，在温度26～30℃下斜面培养2～3d；
B、一级种子培养
使用接种环挑取一环斜面培养的粉状毕赤酵母ACCC20136，接种于50～80mL YPD液体培养基中，在温度28～32℃与转速200～250rad/min条件下振荡培养，直到培养液OD600nm达到12.0～15.0时得到一级种子液；
C、制备高密度液体发酵培养基
将1～3重量份葡萄糖、0.5～1.5重量份蛋白胨、0.1～0.5重量份磷酸二氢钾、0.01～0.05重量份硫酸镁、0.03～0.06重量份硫酸亚铁、0.03～0.06重量份硫酸锰与补充至1000重量份蒸馏水混合均匀，然后在压力0.11～0.15MPa与温度121℃～125℃的条件下灭菌18～22min，接着使用浓度为以体积计22～28％的氨水将其pH值调节至5.0～6.0，得到一种高密度液体发酵培养基；
D、发酵培养
按照以液体发酵培养基重量计6～10％的接种量，将步骤B得到的种子液接种于在步骤C得到的高密度液体发酵培养基中，在培养温度28～32℃、初始pH 5.5、压力0.03～0.06MPa、转速200～350rad/min与通气比1：1～2.5的条件下进行发酵培养；与此同时，通过通气比、压力与转速调整，将整个发酵过程中溶解氧DO控制在≧20％，通过滴加浓度为以体积计22～28％的氨水将在整个发酵过程中发酵培养液的pH值控制在5.5～6.5；
E、补料
在整个发酵培养过程中，在通气量、压力与转速不变时，如果溶解氧DO在1min内升高30％以上时，需要按照发酵培养基体积计18～22％的添加量，往发酵培养液中添加由35～45重量份葡萄糖与5～15重量份硫酸镁组成的补料培养基；
F、添加辅料
在发酵培养结束前0.5～1h，按照发酵培养基体积计1～3％的添加量添加甘露醇保护剂与2～6％的添加量添加吐温80，充分混匀；接着在离心转速2000～4000rpm的条件下离心浓缩2～4倍；再按照发酵培养基体积计20～30％的添加量添加米糠载体、20～30％的添加量添加加益粉载体，充分混匀，接着输送至冷风干燥机中进行冷风干燥，得到粉状毕赤酵母高活性菌粉。
根据本发明的一种优选实施方式，在步骤A中，在按照大麦芽与水的重量比1:3～5，把水加到大麦芽中，搅拌混合均匀，然后放于保温箱中在温度55～60℃下进行糖化3.5～4.5h，过滤，得到的糖化麦芽汁在压力0.5～0.7kg/cm2下灭菌38～42min，接着用水将灭菌的糖化麦芽汁稀释至糖度为12波美度，得到一种麦芽汁液体培养基。
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤C与步骤D中，所述的氨水浓度是以体积计22～28％。
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤C中，高密度液体发酵培养基由2重量份葡萄糖、1重量份蛋白胨、0.3重量份磷酸二氢钾、0.03重量份硫酸镁、0.05重量份硫酸亚铁、0.05重量份硫酸锰与补充至1000重量份蒸馏水组成。
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤E中，所述的补料培养基在蒸汽压力102～104kPa与温度110～117℃的条件下灭菌18～22min。
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤E中，在整个发酵培养过程中添加8～10次所述的补料培养基。
根据本发明的另一种优选实施方式，整个发酵培养时间是36～48h。
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤F中，在温度为5～15℃的条件下进行冷风干燥4～5h。
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤F中，所述的米糠载体粒度是100～150目。
本发明还涉及采用所述制备方法制备得到的高活性粉状毕赤酵母菌粉。所述的粉状毕赤酵母有效活菌数CFU≧60.0亿/g；杂菌率≦10.0％；水分5.5-7.0％；pH值5.5～6.5；在温度25℃以下保存6个月时菌数保存率≧75％。
下面将更详细地描述本发明。
本发明涉及一种高活性粉状毕赤酵母菌粉的制备方法。
该制备方法的步骤如下：
A、活化培养
用无菌吸管吸取0.3～0.5mL麦芽汁液体培养基，滴入装有冻干的粉状毕赤酵母ACCC20136的安瓿内，轻轻振荡，使其溶解呈悬浮状，吸取全部菌悬液，放于1L麦芽汁培养基中，在温度26～30℃下活化培养2～3d；
按照以YPD培养基重量计3～5％接种量，将活化培养的粉状毕赤酵母ACCC20136接种于YPD培养基斜面上，在温度26～30℃下斜面培养2～3d；
粉状毕赤酵母ACCC20136是由中国农业微生物菌种保藏管理中心获得的。使用75％酒精脱脂棉对装有冻干粉状毕赤酵母ACCC20136的安瓿管外表面进行消毒，用火焰加热其顶端，滴少量无菌水至加热安瓿顶端使之破裂，用锉刀或镊子敲下已经破裂的安瓿顶端。然后把麦芽汁液体培养基滴入安瓿内。
根据本发明，所述的麦芽汁液体培养基制备方法如下：按照大麦芽与水的重量比1:3～5，把水加到大麦芽中，搅拌混合均匀，然后放于保温箱中在温度55～60℃下进行糖化3.5～4.5h，过滤，得到的糖化麦芽汁在压力0.5～0.7kg/cm2下灭菌38～42min，接着用水将灭菌的糖化麦芽汁稀释至糖度为12波美度，得到所述的麦芽汁液体培养基。
在本发明中，使用的大麦芽是目前市场上销售的产品，例如由郑州龙海啤酒物资有限公司销售的大麦芽。
所述的麦芽汁液体培养基的pH是自然的pH。
YPD培养基是本技术领域里技术人员熟知的培养基，它的制备方法如下：将10g酵母膏、20g蛋白胨与20g葡萄糖溶于900mL水中，在温度121℃下灭菌20min，得到所述的YPD培养基。
B、一级种子培养
使用接种环挑取一环斜面培养的粉状毕赤酵母ACCC20136，接种于50～80mL YPD液体培养基中，在温度28～32℃与转速200～250rad/min条件下振荡培养，直到培养液OD600nm达到12.0～15.0时得到一级种子液；
YPD液体培养基已在前面描述，因此这里不再赘述。
在本发明中，振荡培养使用的设备例如是由苏州威尔实验用品有限公司以商品名振荡培养箱销售的设备。
通常利用分光光度法来测量单细胞微生物培养液的浓度，从而估计菌体的生长情况，所以OD600nm通常用来指菌体细胞密度。例如测量细菌培养液在波长600nm处的吸光值，得到的OD600nm的数值如果在0.6-0.8之间，表明细菌处于旺盛生长的对数生长期，超过0.8就要稀释培养液。
培养液OD600nm为12.0～15.0表明粉状毕赤酵母正处于对数生长期，开始大量、快速繁殖。
测定OD600nm使用的设备是本技术领域里通常使用的分光光度计，测定OD600nm的方法是常规方法。
C、制备高密度液体发酵培养基
将1～3重量份葡萄糖、0.5～1.5重量份蛋白胨、0.1～0.5重量份磷酸二氢钾、0.01～0.05重量份硫酸镁、0.03～0.06重量份硫酸亚铁、0.03～0.06重量份硫酸锰与补充至1000重量份蒸馏水混合均匀，然后在压力0.11M～0.15MPa与温度121℃～125℃的条件下灭菌18～22min，接着使用浓度为以体积计22～28％的氨水将其pH值调节至5.0～6.0，得到一种高密度液体发酵培养基；
优选地，高密度液体发酵培养基由2.0重量份葡萄糖、1.0重量份蛋白胨、0.3重量份磷酸二氢钾、0.03重量份硫酸镁、0.05重量份硫酸亚铁、0.05重量份硫酸锰与补充至1000重量份蒸馏水组成。
本发明使用的葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锰都是目前市场上销售的产品。
在这个步骤中，所述的氨水浓度是以体积计22～28％。
D、发酵培养
按照以液体发酵培养基重量计6～10％的接种量，将步骤B得到的种子液接种于在步骤C得到的高密度液体发酵培养基中，在培养温度28～32℃、初始pH 5.5、压力0.03～0.06MPa、转速200～350rad/min与通气比1：1～2.5的条件下进行发酵培养；与此同时，通过通气比、压力与转速调整，将整个发酵过程中溶解氧DO控制在≧20％，通过滴加浓度为以体积计22～28％的氨水将在整个发酵过程中发酵培养液的pH值控制在5.5～6.5；
溶解于水中的分子态氧称为溶解氧，通常记作DO，用每升水里氧气的毫克数表示。溶解氧通常采用碘量法进行测定，即水样中加入硫酸锰和碱性碘化钾，水中溶解氧将低价锰氧化成高价锰，生成四价锰氢氧化物棕色沉淀。加酸后，氢氧化物沉淀溶解，并与碘离子反应而释放出游离碘。以淀粉为指示剂，用硫代硫酸钠标准溶液滴定释放出的碘，据滴定溶液消耗量计算溶解氧含量。
在本发明中，将整个发酵过程中溶解氧DO控制在≧20％，如果溶解氧DO＜20％时，则粉状毕赤酵母会因缺氧而进行厌氧呼吸途径产生大量乙醇，通过反馈抑制作用抑制菌体生长。
根据本发明，在这个步骤中，所述的氨水浓度是以体积计22～28％。
在本发明中，如果在整个发酵过程中发酵培养液的pH值控制在5.5以下，则会引起细胞质膜的电性改变，影响营养吸收和代谢途径；如果在整个发酵过程中发酵培养液的pH值控制在6.5以上，则会影响粉状毕赤酵母自身酶系的酶活性及基质和产物性质，从而导致菌体生长速度变慢；因此，在整个发酵过程中发酵培养液的pH值控制在5.5～6.5是合理的，优选地是5.8～6.2；更优选地是5.9～6.1。
E、补料
在整个发酵培养过程中，在通气量、压力与转速不变时，如果溶解氧DO在1min内升高30％以上时，需要按照发酵培养基体积计18～22％的添加量，往发酵培养液中添加由35～45重量份葡萄糖与5～15重量份硫酸镁组成的补料培养基；
在这个步骤中，溶解氧DO在1min内升高30％以上时，表明发酵培养基中葡萄糖已耗尽，会造成菌体衰老死亡，同时出现pH升高，应及时补充碳源。因此，需要添加由35～45重量份葡萄糖与5～15重量份硫酸镁组成的补料培养基，其中葡萄糖的主要作用是为粉状毕赤酵母菌体生长补充必需的碳源，延长对数期，促进菌体大量积累；而硫酸镁是许多酶的活化剂，能促进碳水化合物的新陈代谢、核酸的合成、磷酸盐的转化等。
在这个步骤中，所述的补料培养基在蒸汽压力102～104kPa与温度110～117℃的条件下灭菌18～22min。
在整个发酵培养过程中，所述的补料培养基通常需要添加8～10次。
根据本发明，整个发酵培养时间是36～48h。如果整个发酵培养时间小于36h，则发酵仍处于对数生长期，不能获取最高浓度的发酵液；如果整个发酵培养时间长于48h，则发酵已进入稳定期乃至衰亡期，菌体数量将按几何级数下降；因此，整个发酵培养时间为36～48h是合理的。
F、添加辅料
在发酵培养结束前0.5～1h，按照发酵培养基体积计1～3％的添加量添加甘露醇保护剂与2～6％的添加量添加吐温80，充分混匀；接着在离心转速2000～4000rpm的条件下离心浓缩2～4倍；再按照发酵培养基体积计20～30％的添加量添加米糠载体、20～30％的添加量添加加益粉载体，充分混匀，接着输送至冷风干燥机中进行冷风干燥，得到粉状毕赤酵母高活性菌粉。
在本发明中，添加甘露醇保护剂的主要目的是可与菌体细胞膜磷脂中的磷酸基团或菌体蛋白质极性基团形成氢键，保护细胞膜和蛋白质结构和功能的完整性。如果甘露醇保护剂的添加量小于1％，则会影响粉状毕赤酵母菌体存活率；如果甘露醇保护剂的添加量大于3％，则会使细胞间隙内的液体逐渐浓缩，从而使电解质的浓度显著增加，发生溶质损伤效应，导致细胞脱水死亡；因此，甘露醇保护剂的添加量为1～3％是恰当的。
添加吐温80保护剂的主要目的是减少细胞暴露于氧气和介质中的面积，同时在菌体表面形成保护层，减少由于细胞壁损伤而引起的胞内物质泄漏。如果吐温80保护剂的添加量小于2％，则起不到最佳保护效果；如果吐温80保护剂的添加量大于6％，则容易造成样品发粘，不易干燥、保存；因此，吐温80保护剂的添加量为2～6％是适当的。
在本发明中，添加米糠载体的主要目的是吸附粉状毕赤酵母菌体。如果米糠的添加量小于20％，则不能将发酵液中的菌体充分吸附；如果米糠的添加量大于30％，则会减少单位质量中有效活菌数，影响产品质量；因此，米糠的添加量为20～30％是可行的。所述的米糠粒度是100～150目。
添加加益粉载体的主要目的是在产品使用过程中为菌体繁殖提供多种矿物质和无机盐；改善产品外观。如果加益粉载体的添加量小于20％，则不能为菌体生长繁殖提供充足的营养；如果加益粉载体的添加量大于30％，则会减少单位质量中有效活菌数，影响产品质量；因此，加益粉载体的添加量为20～30％是恰当的。
冷风干燥技术是利用空调除湿原理，即将干燥空气强制循环于物料间，使其含水量逐渐减少以达到干燥的目的。低温低湿空气在强制循环中不断吸收物料表面水分，达到饱和状态的空气经过蒸发器被降温并析出，析出的水分由集水盘排出库体，达到循环干燥的目的。冷风干燥设备运行费用低，易于控制，干燥温度为中低温(5-50℃)，对微生物菌体损伤小。
在本发明中，在温度为5～15℃的条件下进行冷风干燥4～5h。冷风干燥所使用的设备例如是由湖北欧胜电器有限公司以商品名冷风干燥机销售的产品。
本发明还涉及采用所述制备方法制备得到的高活性粉状毕赤酵母菌粉。
根据农用微生物菌剂(GB 20287-2006)标准分析方法测定，所述粉状毕赤酵母粉的有效活菌数CFU≧60.0亿/g；杂菌率≦10.0％；
根据农用微生物菌剂(GB 20287-2006)标准分析方法测定，所述粉状毕赤酵母粉的水分5.5-7.0％；
根据农用微生物菌剂(GB 20287-2006)标准分析方法测定，pH值5.5～6.5；
根据农用微生物菌剂(GB 20287-2006)标准分析方法测定，在温度25℃以下保存6个月时菌数保存率≧75％。
所述的粉状毕赤酵母为灰黄色粉末，无潮解结块。
所述粉状毕赤酵母菌粉应该在阴凉、通风、干燥处贮存，本发明高活性粉状毕赤酵母菌粉的保藏曲线列于附图3中。由附图3可以看出温度越低越有利于粉状毕赤酵母菌粉的保存，4℃保存6个月时，菌数保存率为85.7％，25℃保存6个月时，菌数保存率为77.8％，均达到规定指标。
本发明的粉状毕赤酵母菌粉主要应用于有机物料腐熟剂的生产和有机肥堆肥发酵；它的使用方法是将该产品与所需发酵的物料充分混匀，调整水分为以重量计35-45％，进行堆堆发酵，温度超过50℃时要及时补水、翻堆降温；它的使用量通常是2-4kg每吨物料，或根据需要可适当加大用量。
[有益效果]
本发明的有益效果是：
通过粉状毕赤酵母高密度补料发酵，显著提高了单位产量约30％，降低了单位成本约20％，设备利用率提高。
通过复配正交试验筛选出保护剂和载体的最佳种类及配比，赋予菌体本身最佳保护，从而获得高活性粉状毕赤酵母菌粉。
与传统离心喷雾干燥生产工艺相比，采用冷风干燥技术干燥温度较低，更好地保留了生物活性，克服了传统工艺低活菌、高投入的缺点，具有广阔的市场前景。
【附图说明】
图1是实施例1粉状毕赤酵母高密度补料发酵与pH控制时与对比实施例1不补料和不控制pH时OD600nm随发酵时间而变化的示意图；
图2是实施例2使用复合保护剂和载体与对比实施例2使用单一载体和保护剂对粉状毕赤酵母菌体存活率影响示意图。
图3是本发明高活性粉状毕赤酵母菌粉的保藏曲线。
【具体实施方式】
通过下述实施例将能够更好地理解本发明。
实施例1：粉状毕赤酵母高活性菌粉的制备
该实施例的实施步骤如下：
A、活化培养
制备麦芽汁液体培养基：按照大麦芽与水的重量比1:4，把水加到大麦芽中，搅拌混合均匀，然后放于保温箱中在温度58℃下进行糖化3.8h，过滤，得到的糖化麦芽汁在压力0.5kg/cm2下灭菌40min，接着用水将灭菌的糖化麦芽汁稀释至糖度为12波美度，得到麦芽汁液体培养基；
用无菌吸管吸取0.3mL上述麦芽汁液体培养基，滴入装有冻干的粉状毕赤酵母ACCC20136的安瓿内，轻轻振荡，使其溶解呈悬浮状，吸取全部菌悬液，放于1L麦芽汁培养基中，在温度26℃下活化培养2d；
按照以YPD培养基重量计3％接种量，将活化培养的粉状毕赤酵母ACCC20136接种于YPD培养基斜面上，在温度26℃下斜面培养2d；
B、一级种子培养
使用接种环挑取一环斜面培养的粉状毕赤酵母ACCC20136，接种于60mL YPD液体培养基中，在温度28℃与转速220rad/min条件下振荡培养，直到培养液OD600nm达到12.0时得到一级种子液；
C、制备高密度液体发酵培养基
将2重量份葡萄糖、0.5重量份蛋白胨、0.5重量份磷酸二氢钾、0.01重量份硫酸镁、0.03重量份硫酸亚铁、0.06重量份硫酸锰与补充至1000重量份蒸馏水混合均匀，然后在压力0.12MPa与温度125℃的条件下灭菌18min，接着使用浓度为以体积计26％的氨水将其pH值调节至5.4，得到一种高密度液体发酵培养基；
D、发酵培养
按照以液体发酵培养基重量计6％的接种量，将步骤B得到的种子液接种于在步骤C得到的高密度液体发酵培养基中，在培养温度30℃、初始pH 5.5、压力0.03MPa、转速300rad/min与通气比1：1.0的条件下进行发酵培养；与此同时，通过通气比、压力与转速调整，将整个发酵过程中溶解氧DO控制在≧20％，通过滴加浓度为以体积计26％的氨水将在整个发酵过程中发酵培养液的pH值控制在5.5；
E、补料
在整个发酵培养过程中，在通气量、压力与转速不变时，如果溶解氧DO在1min内升高30％以上时，需要按照发酵培养基体积计18％的添加量往发酵培养液中添加补料培养基；所述的补料培养基由42重量份葡萄糖与8重量份硫酸镁组成，在蒸汽压力102kPa与温度110℃的条件下灭菌22min，在整个发酵培养过程中添加9次所述的补料培养基。整个发酵培养时间为44h。
F、添加辅料
在发酵培养结束前0.5h，按照发酵培养基体积计1％的添加量添加甘露醇保护剂，4％的添加量添加吐温80，充分混匀；接着在离心转速2600rpm的条件下离心浓缩2倍；再按照发酵培养基体积计20％的添加量添加粒度100～150目米糠、24％的添加量添加加益粉，充分混匀，接着输送至冷风干燥机中在温度为5～15℃的条件下进行冷风干燥4h，得到粉状毕赤酵母高活性菌粉。
根据本说明书描述的方法测定所述粉状毕赤酵母粉的有效活菌数CFU为60.0亿/g；杂菌率≦10.0％；水分5.5％；pH值5.5；在温度25℃以下保存6个月时菌数保存率≧75％。
本实施例制备的粉状毕赤酵母为灰黄色粉末，无潮解结块。
实施例2：粉状毕赤酵母高活性菌粉的制备
该实施例的实施步骤如下：
A、活化培养
制备麦芽汁液体培养基：按照大麦芽与水的重量比1:3，把水加到大麦芽中，搅拌混合均匀，然后放于保温箱中在温度55℃下进行糖化4.5h，过滤，得到的糖化麦芽汁在压力0.6kg/cm2下灭菌38min，接着用水将灭菌的糖化麦芽汁稀释至糖度为12波美度，得到麦芽汁液体培养基；
用无菌吸管吸取0.5mL上述麦芽汁液体培养基，滴入装有冻干的粉状毕赤酵母ACCC20136的安瓿内，轻轻振荡，使其溶解呈悬浮状，吸取全部菌悬液，放于1L麦芽汁培养基中，在温度30℃下活化培养2d；
按照以YPD培养基重量计4％接种量，将活化培养的粉状毕赤酵母ACCC20136接种于YPD培养基斜面上，在温度30℃下斜面培养2.5d；
B、一级种子培养
使用接种环挑取一环斜面培养的粉状毕赤酵母ACCC20136，接种于50mL YPD液体培养基中，在温度30℃与转速200rad/min条件下振荡培养，直到培养液OD600nm达到15.0时得到一级种子液；
C、制备高密度液体发酵培养基
将1重量份葡萄糖、1.5重量份蛋白胨、0.1重量份磷酸二氢钾、0.04重量份硫酸镁、0.06重量份硫酸亚铁、0.03重量份硫酸锰与补充至1000重量份蒸馏水混合均匀，然后在压力0.11MPa与温度123℃的条件下灭菌20min，接着使用浓度为以体积计24％的氨水将其pH值调节至5.0，得到一种高密度液体发酵培养基；
D、发酵培养
按照以液体发酵培养基重量计8％的接种量，将步骤B得到的种子液接种于在步骤C得到的高密度液体发酵培养基中，在培养温度28℃、初始pH 5.5、压力0.06MPa、转速200rad/min与通气比1：2.5的条件下进行发酵培养；与此同时，通过通气比、压力与转速调整，将整个发酵过程中溶解氧DO控制在≧20％，通过滴加浓度为以体积计24％的氨水将在整个发酵过程中发酵培养液的pH值控制在6.0；
E、补料
在整个发酵培养过程中，在通气量、压力与转速不变时，如果溶解氧DO在1min内升高30％以上时，需要按照发酵培养基体积计22％的添加量往发酵培养液中添加补料培养基；所述的补料培养基由35重量份葡萄糖与5重量份硫酸镁组成，在蒸汽压力104kPa与温度114℃的条件下灭菌18min，在整个发酵培养过程中添加8次所述的补料培养基。整个发酵培养时间为36h；
F、添加辅料
在发酵培养结束前1.0h，按照发酵培养基体积计3％的添加量添加甘露醇保护剂，2％的添加量添加吐温80，充分混匀；接着在离心转速2000rpm的条件下离心浓缩3倍；再按照发酵培养基体积计30％的添加量添加粒度100～150目米糠、20％的添加量添加加益粉，充分混匀，接着输送至冷风干燥机中在温度为5～15℃的条件下进行冷风干燥5h，得到粉状毕赤酵母高活性菌粉。
根据本说明书描述的方法测定所述粉状毕赤酵母粉的有效活菌数CFU为62.2亿/g；杂菌率≦10.0％；水分7.0％；pH值6.5；在温度25℃以下保存6个月时菌数保存率≧75％。
本实施例制备的粉状毕赤酵母为灰黄色粉末，无潮解结块。
实施例3：粉状毕赤酵母高活性菌粉的制备
该实施例的实施步骤如下：
A、活化培养
制备麦芽汁液体培养基：按照大麦芽与水的重量比1:5，把水加到大麦芽中，搅拌混合均匀，然后放于保温箱中在温度60℃下进行糖化3.5h，过滤，得到的糖化麦芽汁在压力0.7kg/cm2下灭菌40min，接着用水将灭菌的糖化麦芽汁稀释至糖度为12波美度，得到麦芽汁液体培养基；
用无菌吸管吸取0.4mL上述麦芽汁液体培养基，滴入装有冻干的粉状毕赤酵母ACCC20136的安瓿内，轻轻振荡，使其溶解呈悬浮状，吸取全部菌悬液，放于1L麦芽汁培养基中，在温度28℃下活化培养3d；
按照以YPD培养基重量计5％接种量，将活化培养的粉状毕赤酵母ACCC20136接种于YPD培养基斜面上，在温度28℃下斜面培养3d；
B、一级种子培养
使用接种环挑取一环斜面培养的粉状毕赤酵母ACCC20136，接种于70mL YPD液体培养基中，在温度32℃与转速250rad/min条件下振荡培养，直到培养液OD600nm达到13.0时得到一级种子液；
C、制备高密度液体发酵培养基
将3重量份葡萄糖、1.2重量份蛋白胨、0.2重量份磷酸二氢钾、0.05重量份硫酸镁、0.05重量份硫酸亚铁、0.04重量份硫酸锰与补充至1000重量份蒸馏水混合均匀，然后在压力0.15MPa与温度121℃的条件下灭菌22min，接着使用浓度为以体积计22％的氨水将其pH值调节至6.0，得到一种高密度液体发酵培养基；
D、发酵培养
按照以液体发酵培养基重量计10％的接种量，将步骤B得到的种子液接种于在步骤C得到的高密度液体发酵培养基中，在培养温度32℃、初始pH 5.5、压力0.04MPa、转速350rad/min与通气比1：1.6的条件下进行发酵培养；与此同时，通过通气比、压力与转速调整，将整个发酵过程中溶解氧DO控制在≧20％，通过滴加浓度为以体积计22％的氨水将在整个发酵过程中发酵培养液的pH值控制在6.5；
E、补料
在整个发酵培养过程中，在通气量、压力与转速不变时，如果溶解氧DO在1min内升高30％以上时，需要按照发酵培养基体积计20％的添加量往发酵培养液中添加补料培养基；所述的补料培养基由45重量份葡萄糖与12重量份硫酸镁组成，在蒸汽压力102kPa与温度117℃的条件下灭菌20min，在整个发酵培养过程中添加10次所述的补料培养基。整个发酵培养时间为40h；
F、添加辅料
在发酵培养结束前0.8h，按照发酵培养基体积计2％的添加量添加甘露醇保护剂，6％的添加量添加吐温80，充分混匀；接着在离心转速4000rpm的条件下离心浓缩4倍；再按照发酵培养基体积计28％的添加量添加粒度100～150目米糠、30％的添加量添加加益粉，充分混匀，接着输送至冷风干燥机中在温度为5～15℃的条件下进行冷风干燥4h，得到粉状毕赤酵母高活性菌粉。
根据本说明书描述的方法测定所述粉状毕赤酵母粉的有效活菌数CFU为64.4亿/g；杂菌率≦10.0％；水分5.8％；pH值6.0；在温度25℃以下保存6个月时菌数保存率≧75％。
本实施例制备的粉状毕赤酵母为灰黄色粉末，无潮解结块。
实施例4：粉状毕赤酵母高活性菌粉的制备
该实施例的实施步骤如下：
A、活化培养
制备麦芽汁液体培养基：按照大麦芽与水的重量比1:4，把水加到大麦芽中，搅拌混合均匀，然后放于保温箱中在温度56℃下进行糖化4.0h，过滤，得到的糖化麦芽汁在压力0.6kg/cm2下灭菌42min，接着用水将灭菌的糖化麦芽汁稀释至糖度为12波美度，得到麦芽汁液体培养基；
用无菌吸管吸取0.4mL上述麦芽汁液体培养基，滴入装有冻干的粉状毕赤酵母ACCC20136的安瓿内，轻轻振荡，使其溶解呈悬浮状，吸取全部菌悬液，放于1L麦芽汁培养基中，在温度26℃下活化培养3d；
按照以YPD培养基重量计4％接种量，将活化培养的粉状毕赤酵母ACCC20136接种于YPD培养基斜面上，在温度28℃下斜面培养2.5d；
B、一级种子培养
使用接种环挑取一环斜面培养的粉状毕赤酵母ACCC20136，接种于80mL YPD液体培养基中，在温度30℃与转速230rad/min条件下振荡培养，直到培养液OD600nm达到14.0时得到一级种子液；
C、制备高密度液体发酵培养基
将2重量份葡萄糖、0.8重量份蛋白胨、0.4重量份磷酸二氢钾、0.03重量份硫酸镁、0.04重量份硫酸亚铁、0.05重量份硫酸锰与补充至1000重量份蒸馏水混合均匀，然后在压力0.14MPa与温度124℃的条件下灭菌20min，接着使用浓度为以体积计28％的氨水将其pH值调节至6.0，得到一种高密度液体发酵培养基；
D、发酵培养
按照以液体发酵培养基重量计8％的接种量，将步骤B得到的种子液接种于在步骤C得到的高密度液体发酵培养基中，在培养温度30℃、初始pH 5.5、压力0.05MPa、转速250rad/min与通气比1：2.0的条件下进行发酵培养；与此同时，通过通气比、压力与转速调整，将整个发酵过程中溶解氧DO控制在≧20％，通过滴加浓度为以体积计28％的氨水将在整个发酵过程中发酵培养液的pH值控制在6.2；
E、补料
在整个发酵培养过程中，在通气量、压力与转速不变时，如果溶解氧DO在1min内升高30％以上时，需要按照发酵培养基体积计20％的添加量往发酵培养液中添加补料培养基；所述的补料培养基由38重量份葡萄糖与15重量份硫酸镁组成，在蒸汽压力104kPa与温度116℃的条件下灭菌20min，在整个发酵培养过程中添加9次所述的补料培养基。整个发酵培养时间为48h；
F、添加辅料
在发酵培养结束前0.5h，按照发酵培养基体积计2％的添加量添加甘露醇保护剂，5％的添加量添加吐温80，充分混匀；接着在离心转速3400rpm的条件下离心浓缩3倍；再按照发酵培养基体积计24％的添加量添加粒度100～150目米糠、28％的添加量添加加益粉，充分混匀，接着输送至冷风干燥机中在温度为5～15℃的条件下进行冷风干燥5h，得到粉状毕赤酵母高活性菌粉。
根据本说明书描述的方法测定所述粉状毕赤酵母粉的有效活菌数CFU为61.2亿/g；杂菌率≦10.0％；水分6.6％；pH值5.9；在温度25℃以下保存6个月时菌数保存率≧75％。
本实施例制备的粉状毕赤酵母为灰黄色粉末，无潮解结块。
对比实施例1：
该对比实施例按照与实施例1相同的方式进行，只是不添加本发明补料培养基，也不控制在整个发酵过程中发酵培养液的pH值。
实施例1与对比实施例1的OD600nm随发酵时间而改变的情况列于图1中。
附图1的结果非常清楚地显示，通过粉状毕赤酵母高密度补料发酵，显著提高了发酵液的单位产量，单位产量提高30.4％，降低了单位成本，单位成本降低19.2％，设备利用率提高。
对比实施例2：
该对比实施例按照与实施例2相同的方式进行，只是使用甘露醇、吐温80单一保护剂，使用米糠、加益粉单一载体。
实施例2与对比实施例2使用不同保护剂与载体对粉状毕赤酵母菌体存活率影响列于附图2中。
附图2的结果非常明显地显示，在选用单一保护剂和单一载体时，粉状毕赤酵母的存活率明显低于通过正交试验筛选出的最佳种类及配比的保护剂和载体。由此说明，复合保护剂和载体赋予了菌体本身最佳保护，从而获得了高活性粉状毕赤酵母菌粉。

Claims (8)

1.一种粉状毕赤酵母高活性菌粉的制备方法，其特征在于该制备方法的步骤如下：
A、活化培养
用无菌吸管吸取0.3～0.5mL麦芽汁液体培养基，滴入装有冻干的粉状毕赤酵母ACCC20136的安瓿内，轻轻振荡，使其溶解呈悬浮状，吸取全部菌悬液，放于1L麦芽汁培养基中，在温度26～30℃下活化培养2～3d；
所述的麦芽汁液体培养基制备方法如下：在按照大麦芽与水的重量比1:3～5，把水加到大麦芽中，搅拌混合均匀，然后放于保温箱中在温度55～60℃下进行糖化3.5～4.5h，过滤，得到的糖化麦芽汁在压力0.5～0.7kg/cm2下灭菌38～42min，接着用水将灭菌的糖化麦芽汁稀释至糖度为12波美度，得到所述的麦芽汁液体培养基；
按照以YPD培养基重量计3～5％接种量，将活化培养的粉状毕赤酵母ACCC20136接种于YPD培养基斜面上，在温度26～30℃下斜面培养2～3d；
B、一级种子培养
使用接种环挑取一环斜面培养的粉状毕赤酵母ACCC20136，接种于50～80mL YPD液体培养基中，在温度28～32℃与转速200～250rad/min条件下振荡培养，直到培养液OD600nm达到12.0～15.0时得到一级种子液；
C、制备高密度液体发酵培养基
将1～3重量份葡萄糖、0.5～1.5重量份蛋白胨、0.1～0.5重量份磷酸二氢钾、0.01～0.05重量份硫酸镁、0.03～0.06重量份硫酸亚铁、0.03～0.06重量份硫酸锰与补充至1000重量份蒸馏水混合均匀，然后在压力0.11～0.15MPa与温度121℃～125℃的条件下灭菌18～22min，接着使用浓度为以体积计22～28％的氨水将其pH值调节至5.0～6.0，得到一种高密度液体发酵培养基；
D、发酵培养
按照以液体发酵培养基重量计6～10％的接种量，将步骤B得到的种子液接种于在步骤C得到的高密度液体发酵培养基中，在培养温度28～32℃、初始pH 5.5、压力0.03～0.06MPa、转速200～350rad/min与通气比1：1～2.5的条件下进行发酵培养；与此同时，通过通气比、压力与转速调整，将整个发酵过程中溶解氧DO控制在≧20％，通过滴加浓度为以体积计22～28％的氨水将在整个发酵过程中发酵培养液的pH值控制在5.5～6.5；
E、补料
在整个发酵培养过程中，在通气量、压力与转速不变时，如果溶解氧DO在1min内升高30％以上时，需要按照发酵培养基体积计18～22％的添加量，往发酵培养液中添加由35～45重量份葡萄糖与5～15重量份硫酸镁组成的补料培养基；
F、添加辅料
在发酵培养结束前0.5～1h，按照发酵培养基体积计1～3％的添加量添加甘露醇保护剂与2～6％的添加量添加吐温80，充分混匀；接着在离心转速2000～4000rpm的条件下离心浓缩2～4倍；再按照发酵培养基体积计20～30％的添加量添加米糠载体、20～30％的添加量添加加益粉载体，充分混匀，接着输送至冷风干燥机中进行冷风干燥，得到粉状毕赤酵母高活性菌粉。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在步骤C中，高密度液体发酵培养基由2重量份葡萄糖、1重量份蛋白胨、0.3重量份磷酸二氢钾、0.03重量份硫酸镁、0.05重量份硫酸亚铁、0.05重量份硫酸锰与补充至1000重量份蒸馏水组成。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在步骤E中，所述的补料培养基在蒸汽压力102～104kPa与温度110～117℃的条件下灭菌18～22min。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在步骤E中，在整个发酵培养过程中添加8～10次所述的补料培养基。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于整个发酵培养时间是36～48h。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在步骤F中，在温度为5～15℃的条件下进行冷风干燥4～5h。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在步骤F中，所述的米糠载体粒度是100～150目。
8.根据权利要求1所述制备方法制备得到的高活性粉状毕赤酵母菌粉，其特征在于粉状毕赤酵母有效活菌数CFU≧60.0亿/g；杂菌率≦10.0％；水分5.5-7.0％；pH值5.5～6.5；在温度25℃以下保存6个月时菌数保存率≧75％。
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