CN110004068A - 一种香菇菌种保藏培养基及保藏方法 - Google Patents

一种香菇菌种保藏培养基及保藏方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种香菇菌种保藏培养基，由下列原料组成：酵母浸粉、蛋白胨、杨木屑、氯化钠、磷酸二氢钾、硫酸镁、葡萄籽提取物、L‑脯氨酸、硒代半胱氨酸、甜菜碱、调环酸钙、水杨酸、果糖‑1，6‑二磷酸、海藻糖、醇类，余量为纯净水。同时本发明还公开了一种香菇菌种保藏方法，将待保藏的香菇菌种培养出菌丝体后，打孔接入菌种保藏培养基中，密封后置于冰箱低温保藏。本发明能够实现香菇菌种的稳定保存，菌种变异或退化程度极小，存活率高，保藏效果好。本发明操作简便，无需定期移植，降低了污染的风险；对保藏设备要求不高，节约了生产成本，具有很高的实用价值。

Description

一种香菇菌种保藏培养基及保藏方法
技术领域
本发明涉及一种香菇菌种保藏培养基以及利用该培养基对香菇菌种进行保藏的方法，属于菌种保藏技术领域。
背景技术
香菇，又名香蕈、花菇、香信、香菌、冬菇、香菰等，是世界上著名的食用菌之一，因其含有一种特有的香味物质——香菇精，形成独特的菇香，所以称为“香菇”。在分类上，香菇隶属于担子菌门，伞菌纲，伞菌目，光茸菌科，香菇属。香菇是一种木腐真菌，其味道鲜美，香气怡人，营养丰富，在我国民间素有“山珍”之称。
香菇具有很高的营养价值，富含蛋白质，碳水化合物，纤维素，铁、钙、磷、钠等矿质元素，维生素B1、维生素B2、尼克酸、维生素D原（经日晒后转成维生素D）等多种维生素，还含有30多种酶和18种氨基酸。在人体所必需的8中氨基酸中，香菇就含有7种，因此香菇又成为纠正人体酶缺乏症和补充氨基酸的首选食物。中医认为香菇味甘，性平，主治食欲减退，少气乏力，中国不少古籍中记载香菇“益气不饥，治风破血和益胃助食”。民间用来助减少痘疮、麻疹的诱发，治头痛、头晕。现代研究证明，香菇中含有香菇多糖、麦芽甾醇和核糖核酸等有益成分。其中香菇多糖可促进T淋巴细胞的产生，并提高T淋巴细胞的杀伤活性，还能降低甲基胆蒽诱发肿瘤的能力；麦角甾醇可以转变为维生素D，对于增强抗疾病和预防感冒及治疗有良好效果；核糖核酸能诱导体内干扰素的产生，干扰病毒蛋白质的合成，使其不能繁殖。经常食用香菇，有利于提高人体免疫力，防癌抗癌，防治软骨病，降血压、降血脂、降胆固醇，增进食欲，美肤养颜和减肥瘦身等。
我国是香菇生产第一大国，年产量为8万吨左右，出口量也居世界之首。随着香菇产业的迅速发展，一些瓶颈问题逐渐显露，其中菌种保藏就是一个突出的问题。菌种作为生产的源头，直接关系到最终产品的产量和质量，其重要性不言而喻。菌种保藏的基本原理是：创造不良的环境和营养条件，使微生物处于休眠的状态或者孢子状态，使其代谢处于最不活跃或相对静止的状态，并且菌种在较长期的保藏之后仍然保持着原有的生命力、优良生产性能、形态特征以及不污染杂菌，能够长期在研究、生产上应用。这样的保藏方法要求给与营养瘠薄、缺氧、干燥、低温、缺水等条件。食用菌的菌种保藏方法主要包括以下几种：1）低温斜面保藏法：将菌种接种于合适的斜面培养基上，待生长好后置于4℃冰箱保藏，每隔一定时间进行转接培养后，再将新斜面继续保藏；2）液体石蜡保藏法：在无菌条件下，往生长好的新鲜斜面中倒入已灭菌的液体石蜡，油层要高出斜面上端1cm，使之与空气隔绝，然后垂直放于室温或冰箱内保藏；3）水溶液保藏法：将菌种转接到无菌容器中，加入蒸馏水或生理盐水使其浸没菌种，密封后置于4℃冰箱保藏；4）冷冻干燥保藏法：在较低温度下使菌液呈冻结状态，同时抽气减压使之干燥；5）液氮超低温保藏法：菌种保藏在液氮冰箱中，温度可低至-196℃。
目前，在生产上较为常用的香菇菌种保藏方法是低温斜面保藏法，使用的保藏培养基为PDA固体培养基。这种方法的优点是操作相对简单，成本低廉，使用方便，不需要特殊设备，缺点是保藏时间较短，保藏过程中易污染，保藏的菌种稳定性不好，易发生变异和退化，携带不方便等。就保藏效果而言，冷冻干燥保藏法和液氮超低温保藏法的效果良好，可以进行长期保藏。但这两种方法对于技术、设备及资金要求较高，不适宜企业的生产。
为满足香菇产业发展的需求，探索更好、更实用的香菇菌种保藏方法，申请人对保藏温度、渗透调节剂、生长延缓剂、低温保护剂剂等多种因素进行了单因子、多因子的试验，对不同保藏时间下的香菇菌种进行存活率、菌丝生长情况检测，总结出了更适用于香菇菌种保藏用的培养基以及保藏方法。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明以高效、低成本、易操作为目标，提供了一种香菇菌种保藏培养基，以及利用该培养基对香菇菌种进行低温保藏的方法。
本发明主要是通过以下技术方案来实现：
一种香菇菌种保藏培养基，其特征在于，该培养基是由下列重量配比的原料组成：酵母浸粉0.8-1.2g/L，蛋白胨4.0-5.0g/L，杨木屑3.5-4.5g/L，氯化钠0.8-1.2g/L，磷酸二氢钾3.0-3.8g/L，硫酸镁1.0-1.5g/L，葡萄籽提取物6-10mg/L，L-脯氨酸90-110mg/L，硒代半胱氨酸45-55mg/L，甜菜碱22-30mg/L，调环酸钙17-23mg/L，水杨酸5-8mg/L，果糖-1，6-二磷酸28-40mg/L，海藻糖40-50g/L，醇类150-200ml/L，余量为纯净水。
所述杨木屑使用前需经40目筛网过筛处理，然后在室温下于纯净水中浸泡4-5h。
所述醇类是指丙三醇、异丙醇、丙二醇中的一种或几种经60℃鼓风干燥过夜后得到的无水醇，优选为丙三醇。
该方法包括以下步骤：
1） 将待保藏的香菇菌种接种到改良PDA培养基平板上，置于23-27℃培养箱中培养7-10d，使菌丝体充分生长；
2）将灭菌后的菌种保藏培养基分装于保藏容器中，然后将生长健壮一致的菌丝体用5mm打孔器打孔，挑取3-4个菌丝块接入菌种保藏培养基中，迅速密封好保藏容器；
3）将保藏容器置于冰箱中低温保藏，保藏温度为-20℃~4℃。
所述改良PDA培养基的配方为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨1g/L，琼脂15g/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁1.5g/L，硫酸锰10mg/L，维生素B1 0.1mg/L，维生素B60.5mg/L，NAA1.2mg/L，pH调至6.5。
所述菌种保藏培养基的灭菌方法为：121℃高压蒸汽灭菌15-20min，其中果糖-1，6-二磷酸需用0.22μm滤膜过滤除菌，再加入其它灭菌的培养基原料中。
所述保藏容器为冻存管或带密封螺旋帽的安瓿瓶，规格为3-5mL。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1）本发明依据菌种保藏的基本原理，充分创造有利于香菇菌种休眠的环境条件，最大限度地降低香菇菌种的代谢水平，使香菇菌种而在一定时间内得到保存。本发明的菌种保藏培养基中包含了营养物质兼大分子低温保护剂如酵母浸粉、蛋白胨、杨木屑，以及小分子低温保护剂如海藻糖、醇类、甜菜碱、L-脯氨酸、硒代半胱氨酸、果糖-1，6-二磷酸，渗透调节剂如氯化钠，抗氧化剂如葡萄籽提取物、硒代半胱氨酸，生长延缓剂如调环酸钙、水杨酸，各种成分之间优势互补，形成了很好的菌种低温保藏培养基的组合，使菌种细胞的损伤降到最低程度，有效地保护了菌种。
2）本发明能够实现香菇菌种的稳定保存，菌种变异或退化程度极小，存活率高，保藏效果好，在4℃保藏期为12个月，在-20℃保藏期为36个月。本发明操作简便，无需定期移植，降低了污染的风险；对保藏设备要求不高，节约了生产成本，具有很高的实用价值。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
以下实施例中的香菇菌种购自山东省永腾食用菌研究所；所用实验和检测方法，如无特殊说明，均为常规方法；所使用仪器，如无特殊说明，均为常规检测和操作仪器；所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的；以下涉及到的定量试验，均设置五次重复实验，结果取平均值。
1）菌种存活率的测定
将复苏后的菌种转接到PDA培养基斜面上，25℃培养7-10d，观察菌丝成活情况，统计存活率。
2）菌丝长速长势的测定
将复苏后的菌种转接到PDA培养基斜面上，25℃培养，以菌丝在斜面上的直线生长距离及长势的强弱作为生长量指标，记录菌丝生长速度、菌丝长势。
实施例1
一种香菇菌种保藏培养基，该培养基是由下列重量配比的原料组成：酵母浸粉1.0g/L，蛋白胨4.5g/L，杨木屑3.0g/L，氯化钠1.0g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，硫酸镁1.3g/L，葡萄籽提取物8mg/L，L-脯氨酸100mg/L，硒代半胱氨酸50mg/L，甜菜碱26mg/L，调环酸钙20mg/L，水杨酸7.5mg/L，果糖-1，6-二磷酸34mg/L，海藻糖45g/L，丙三醇175ml/L，余量为纯净水。
所述的，杨木屑使用前需经40目筛网过筛处理，然后在室温下于纯净水中浸泡4-5h。
所述的，丙三醇为经60℃鼓风干燥过夜后得到的无水醇。
一种香菇菌种保藏方法，该方法包括以下步骤：
1） 将待保藏的香菇菌种接种到改良PDA培养基（配方为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨1g/L，琼脂15g/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁1.5g/L，硫酸锰10mg/L，维生素B1 0.1mg/L，维生素B6 0.5mg/L，NAA1.2mg/L，pH调至6.5）平板上，置于25℃培养箱中培养10d，使菌丝体充分生长。
2）将灭菌后的菌种保藏培养基分装于3mL冻存管中，然后将生长健壮一致的菌丝体用5mm打孔器打孔，挑取3-4个菌丝块接入菌种保藏培养基中，迅速密封好冻存管；菌种保藏培养基的灭菌方法为：121℃高压蒸汽灭菌15-20min，其中果糖-1,6-二磷酸需用0.22μm滤膜过滤除菌，再加入其它灭菌的培养基原料中。
3）将冻存管置于冰箱中低温保藏，保藏温度设置为4℃和-20℃，分别保藏6、12、24、36个月后取出进行复苏培养，将-20℃保藏的菌种取出后立即置于37℃水浴中，快速解冻，将4℃保藏的菌种取出后在室温下放置1-2h。
从表1可以看出，将菌种置于4℃条件下保藏，保藏时间到12个月时，菌种的存活率为96%，保藏时间到24个月时，存活率显著降低至52%，因此当保藏温度为4℃时，菌种适宜的保藏时间为12个月；将菌种置于-20℃条件下保藏，保藏时间到36个月时，菌种的存活率为97%，没有显著降低，因此当保藏温度为-20℃时，菌种的保藏时间能达到36个月。
实施例2
一种香菇菌种保藏培养基，该培养基是由下列重量配比的原料组成：酵母浸粉1.0g/L，蛋白胨4.5g/L，杨木屑3.0g/L，氯化钠1.0g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，硫酸镁1.3g/L，葡萄籽提取物8mg/L，硒代半胱氨酸50mg/L，甜菜碱26mg/L，调环酸钙20mg/L，水杨酸7.5mg/L，果糖-1,6-二磷酸34mg/L，海藻糖45g/L，丙三醇175ml/L，余量为纯净水。
所述的，杨木屑使用前需经40目筛网过筛处理，然后在室温下于纯净水中浸泡4-5h。
所述的，丙三醇为经60℃鼓风干燥过夜后得到的无水醇。
一种香菇菌种保藏方法，该方法包括以下步骤：
1） 将待保藏的香菇菌种接种到改良PDA培养基（配方为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨1g/L，琼脂15g/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁1.5g/L，硫酸锰10mg/L，维生素B1 0.1mg/L，维生素B6 0.5mg/L，NAA1.2mg/L，pH调至6.5）平板上，置于25℃培养箱中培养10d，使菌丝体充分生长。
2）将灭菌后的菌种保藏培养基分装于3mL冻存管中，然后将生长健壮一致的菌丝体用5mm打孔器打孔，挑取3-4个菌丝块接入菌种保藏培养基中，迅速密封好冻存管；菌种保藏培养基的灭菌方法为：121℃高压蒸汽灭菌15-20min，其中果糖-1,6-二磷酸需用0.22μm滤膜过滤除菌，再加入其它灭菌的培养基原料中。
3）将冻存管置于冰箱中低温保藏，保藏温度为4℃时保藏12个月，保藏温度为-20℃时保藏36个月，然后取出进行复苏培养，将-20℃保藏的菌种取出后立即置于37℃水浴中，快速解冻，将4℃保藏的菌种取出后在室温下放置1-2h。
本实施例的菌种保藏培养基与实施例1的区别在于没有添加L-脯氨酸。从表2可以看出，在保藏条件相同的情况下，实施例1中的菌种存活率和菌丝生长速度要高于实施例2，说明添加L-脯氨酸后菌种保藏效果更好。研究表明，脯氨酸可以提高生物体的的抗逆性。在生物体内，脯氨酸不仅是理想的渗透调节物质，而且还可作为膜和酶的保护物质及自由基清除剂，从而对生物体在渗透胁迫下的生长起到保护作用。
实施例3
一种香菇菌种保藏培养基，该培养基是由下列重量配比的原料组成：酵母浸粉1.0g/L，蛋白胨4.5g/L，杨木屑3.0g/L，氯化钠1.0g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，硫酸镁1.3g/L，L-脯氨酸100mg/L，硒代半胱氨酸50mg/L，甜菜碱26mg/L，调环酸钙20mg/L，水杨酸7.5mg/L，果糖-1,6-二磷酸34mg/L，海藻糖45g/L，丙三醇175ml/L，余量为纯净水。
所述的，杨木屑使用前需经40目筛网过筛处理，然后在室温下于纯净水中浸泡4-5h。
所述的，丙三醇为经60℃鼓风干燥过夜后得到的无水醇。
一种香菇菌种保藏方法，该方法包括以下步骤：
1） 将待保藏的香菇菌种接种到改良PDA培养基（配方为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨1g/L，琼脂15g/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁1.5g/L，硫酸锰10mg/L，维生素B1 0.1mg/L，维生素B6 0.5mg/L，NAA1.2mg/L，pH调至6.5）平板上，置于25℃培养箱中培养10d，使菌丝体充分生长。
2）将灭菌后的菌种保藏培养基分装于3mL冻存管中，然后将生长健壮一致的菌丝体用5mm打孔器打孔，挑取3-4个菌丝块接入菌种保藏培养基中，迅速密封好冻存管；菌种保藏培养基的灭菌方法为：121℃高压蒸汽灭菌15-20min，其中果糖-1,6-二磷酸需用0.22μm滤膜过滤除菌，再加入其它灭菌的培养基原料中。
3）将冻存管置于冰箱中低温保藏，保藏温度为4℃时保藏12个月，保藏温度为-20℃时保藏36个月，然后取出进行复苏培养，将-20℃保藏的菌种取出后立即置于37℃水浴中，快速解冻，将4℃保藏的菌种取出后在室温下放置1-2h。
本实施例的菌种保藏培养基与实施例1的区别在于没有添加葡萄籽提取物。从表3可以看出，在保藏条件相同的情况下，实施例1中的菌种存活率和菌丝生长速度要高于实施例3，说明添加葡萄籽提取物后菌种保藏效果更好。葡萄籽提取物含有大量花青素，是很好的抗氧化剂。由于低温缺氧保存过程中会产生大量的自由基和酸性物质，会进一步加剧菌种细胞膜损伤，通过抗氧化剂的作用，可以有效的降低组织细胞在低温缺氧状态下及糖酵解过程中产生的大量自由基和酸，维持正常的细胞生长环境。
实施例4
一种香菇菌种保藏培养基，该培养基是由下列重量配比的原料组成：酵母浸粉1.0g/L，蛋白胨4.5g/L，杨木屑3.0g/L，氯化钠1.0g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，硫酸镁1.3g/L，葡萄籽提取物8mg/L，L-脯氨酸100mg/L，硒代半胱氨酸50mg/L，甜菜碱26mg/L，水杨酸7.5mg/L，果糖-1,6-二磷酸34mg/L，海藻糖45g/L，丙三醇175ml/L，余量为纯净水。
所述的，杨木屑使用前需经40目筛网过筛处理，然后在室温下于纯净水中浸泡4-5h。
所述的，丙三醇为经60℃鼓风干燥过夜后得到的无水醇。
一种香菇菌种保藏方法，该方法包括以下步骤：
1） 将待保藏的香菇菌种接种到改良PDA培养基（配方为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨1g/L，琼脂15g/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁1.5g/L，硫酸锰10mg/L，维生素B1 0.1mg/L，维生素B6 0.5mg/L，NAA1.2mg/L，pH调至6.5）平板上，置于25℃培养箱中培养10d，使菌丝体充分生长。
2）将灭菌后的菌种保藏培养基分装于3mL冻存管中，然后将生长健壮一致的菌丝体用5mm打孔器打孔，挑取3-4个菌丝块接入菌种保藏培养基中，迅速密封好冻存管；菌种保藏培养基的灭菌方法为：121℃高压蒸汽灭菌15-20min，其中果糖-1,6-二磷酸需用0.22μm滤膜过滤除菌，再加入其它灭菌的培养基原料中。
3）将冻存管置于冰箱中低温保藏，保藏温度为4℃时保藏12个月，保藏温度为-20℃时保藏36个月，然后取出进行复苏培养，将-20℃保藏的菌种取出后立即置于37℃水浴中，快速解冻，将4℃保藏的菌种取出后在室温下放置1-2h。
本实施例的菌种保藏培养基与实施例1的区别在于没有添加调环酸钙。从表4可以看出，在保藏条件相同的情况下，实施例1中的菌种存活率和菌丝生长情况要优于实施例4，尤其是在4℃保藏温度下，菌种存活率和菌丝生长情况差异更显著，说明添加调环酸钙后菌种保藏效果更好。调环酸钙是一种植物生长调节剂，试验发现添加适量的调环酸钙能够延缓香菇菌种的生长，还能提高菌种的抗逆性，增强其抗低温的能力。
实施例5
一种香菇菌种保藏培养基，该培养基是由下列重量配比的原料组成：酵母浸粉1.0g/L，蛋白胨4.5g/L，杨木屑3.0g/L，氯化钠1.0g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，硫酸镁1.3g/L，葡萄籽提取物8mg/L，L-脯氨酸100mg/L，硒代半胱氨酸50mg/L，甜菜碱26mg/L，调环酸钙20mg/L，水杨酸7.5mg/L，海藻糖45g/L，丙三醇175ml/L，余量为纯净水。
所述的，杨木屑使用前需经40目筛网过筛处理，然后在室温下于纯净水中浸泡4-5h。
所述的，丙三醇为经60℃鼓风干燥过夜后得到的无水醇。
一种香菇菌种保藏方法，该方法包括以下步骤：
1） 将待保藏的香菇菌种接种到改良PDA培养基（配方为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨1g/L，琼脂15g/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁1.5g/L，硫酸锰10mg/L，维生素B1 0.1mg/L，维生素B6 0.5mg/L，NAA1.2mg/L，pH调至6.5）平板上，置于25℃培养箱中培养10d，使菌丝体充分生长。
2）将灭菌后的菌种保藏培养基分装于3mL冻存管中，然后将生长健壮一致的菌丝体用5mm打孔器打孔，挑取3-4个菌丝块接入菌种保藏培养基中，迅速密封好冻存管；菌种保藏培养基的灭菌方法为：121℃高压蒸汽灭菌15-20min，其中果糖-1,6-二磷酸需用0.22μm滤膜过滤除菌，再加入其它灭菌的培养基原料中。
3）将冻存管置于冰箱中低温保藏，保藏温度为4℃时保藏12个月，保藏温度为-20℃时保藏36个月，然后取出进行复苏培养，将-20℃保藏的菌种取出后立即置于37℃水浴中，快速解冻，将4℃保藏的菌种取出后在室温下放置1-2h。
本实施例的菌种保藏培养基与实施例1的区别在于没有添加果糖-1，6-二磷酸。从表2可以看出，在保藏条件相同的情况下，实施例1中的菌种存活率和菌丝生长情况要优于实施例5，说明添加果糖-1，6-二磷酸后菌种保藏效果更好。果糖-1，6-二磷能够作用于细胞膜，调节调节细胞代谢中某些酶的活性，有利于香菇菌种细胞在低温缺氧状态下的细胞能量代谢以及对糖的利用，还能促进细胞修复和改善功能，从而提高香菇菌种的存活率。
实施例6
本实施例采用了一些菌种常规保藏方法对香菇菌种进行保藏：
低温斜面保藏法：将香菇菌种接种到 PDA 培养基平板上，置于25℃培养箱中培养，待菌丝长满平板后，用直径5mm打孔器在长有菌种的平板上打孔，得到5mm 菌块，挑取一块菌块接种于PDA培养基斜面上，培养15d后将长好的斜面试管置于冰箱中低温保藏，保藏温度为4℃，保藏时间为12个月，保藏期间每2个月移植一次。
水溶液保藏法：将香菇菌种接种到 PDA 培养基平板上，置于25℃培养箱中培养，待菌丝长满平板后，用直径5mm打孔器在长有菌种的平板上打孔，得到5mm 菌块，将菌块放入冻存管中，每管放入3-4个菌块，加入蒸馏水使其浸没菌块，密封，置于冰箱中低温保藏，保藏温度为4℃，保藏时间为12个月。
液氮超低温保藏法：将香菇菌种接种到 PDA 培养基平板上，置于25℃培养箱中培养，待菌丝长满平板后，用直径5mm打孔器在长有菌种的平板上打孔，得到5mm 菌块，采用甘油作为保护剂，将甘油分装到冻存管中，再将菌块放入甘油中，先置于-30℃慢速冻结，然后放入-196℃超低温液氮罐中保藏，保藏时间为36个月。
将本发明的香菇菌种保藏方法与低温斜面保藏法、水溶液保藏法以及液氮超低温保藏法进行比较，结果如表6所示。
从表6可以看出，在保藏温度均为4℃，保藏时间均为12个月时，使用本发明的保藏方法，香菇菌种的存活率要显著高于低温斜面保藏法和水溶液保藏法，菌丝生长速度和菌丝长势也显著优于低温斜面保藏法和水溶液保藏法；在保藏温度均为-20℃，保藏时间均为36个月时，使用本发明的保藏方法，香菇菌种的存活率与液氮超低温保藏法的存活率、菌丝生长速度、菌丝长势没有显著差异，但本发明的方法既简便又节约了液氮保藏设备和液氮经费的开支，可以作为一种实用的长期保藏香菇菌种的方法，既适合于科研人员使用，又适合于食用菌生产企业使用，具有极大的推广价值。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种香菇菌种保藏培养基，其特征在于，该培养基是由下列重量配比的原料组成：酵母浸粉0.8-1.2g/L，蛋白胨4.0-5.0g/L，杨木屑3.5-4.5g/L，氯化钠0.8-1.2g/L，磷酸二氢钾3.0-3.8g/L，硫酸镁1.0-1.5g/L，葡萄籽提取物6-10mg/L，L-脯氨酸90-110mg/L，硒代半胱氨酸45-55mg/L，甜菜碱22-30mg/L，调环酸钙17-23mg/L，水杨酸5-8mg/L，果糖-1，6-二磷酸28-40mg/L，海藻糖40-50g/L，醇类150-200ml/L，余量为纯净水。
2.根据权利要求1所述的一种香菇菌种保藏培养基，其特征在于，所述杨木屑使用前需经40目筛网过筛处理，然后在室温下于纯净水中浸泡4-5h。
3.根据权利要求1所述的一种香菇菌种保藏培养基，其特征在于，所述醇类是指丙三醇、异丙醇、丙二醇中的一种或几种经60℃鼓风干燥过夜后得到的无水醇，优选为丙三醇。
4.一种香菇菌种保藏方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
1） 将待保藏的香菇菌种接种到改良PDA培养基平板上，置于23-27℃培养箱中培养7-10d，使菌丝体充分生长；
2）将灭菌后的菌种保藏培养基分装于保藏容器中，然后将生长健壮一致的菌丝体用5mm打孔器打孔，挑取3-4个菌丝块接入菌种保藏培养基中，迅速密封好保藏容器；
3）将保藏容器置于冰箱中低温保藏，保藏温度为-20℃~4℃。
5.根据权利要求4所述的一种香菇菌种保藏方法，其特征在于，所述改良PDA培养基的配方为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨1g/L，琼脂15g/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁1.5g/L，硫酸锰10mg/L，维生素B1 0.1mg/L，维生素B6 0.5mg/L，NAA1.2mg/L，pH调至6.5。
6.根据权利要求4所述的一种香菇菌种保藏方法，其特征在于，所述菌种保藏培养基的灭菌方法为：121℃高压蒸汽灭菌15-20min，其中果糖-1，6-二磷酸需用0.22μm滤膜过滤除菌，再加入其它灭菌的培养基原料中。
7.根据权利要求4所述的一种香菇菌种保藏方法，其特征在于，所述保藏容器为冻存管或带密封螺旋帽的安瓿瓶，规格为3-5mL。
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