CN107653192A - 一种金针菇母种保藏的培养基配方及方法 - Google Patents

一种金针菇母种保藏的培养基配方及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种金针菇母种保藏的培养基配方及其制备方法，土豆100g，葡萄糖10g，蛋白胨1g，酵母膏0.5g，羧甲基纤维素钠5g，愈创木酚0.5g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，琼脂粉20g，水1000ml。本发明在金针菇母种保藏培养基配方中加入羧甲基纤维素钠和愈创木酚，以分解纤维素的纤维素酶活性和降解愈创木酚的漆酶活性作为菌种活性的检测指标。在设计的三种含羧甲基纤维素钠和愈创木酚培养基中筛选出了菌丝长势良好的培养基配方。并通过PDA培养基和筛选出的培养基进行交替传代培养，测定每一代菌种的纤维素酶和漆酶活性，结果显示15次传代过程中菌种的纤维素酶和漆酶活性呈上升趋势而淀粉酶活性基本不变。

Description

一种金针菇母种保藏的培养基配方及方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种金针菇母种保藏的培养基配方及方法。
背景技术
金针菇[Flammulina velutipes(Fr)sing.]又称朴菇、构菌、冬菇、毛柄小火菇、金菇、增智菇等。在分类上,金针菇隶属于真菌门，担子菌亚门，层菌纲，伞菌目，口蘑科，小火焰菌属。
金针菇的营养成分丰富，含有丰富的粗蛋白、碳水化合物、粗脂肪、粗纤维、烟酸、矿质元素如铁、钙、磷、钠等.其中蛋白质中含有人体必需的8种氨基酸，其中赖氨酸和精氨酸含量极为丰富，具有促进儿童智力发育的重要作用。另外金针菇富含多糖,其中以葡聚糖的量最多。金针菇多糖类物质对保护预防肝脏损伤起到了很好的保护作用,并且能有效地抑制Lewi肺癌,小鼠肿瘤Heps和H22，S180及L615，是一种抗肿瘤和抗白血病的有效物质.金针菇中还含有多种功能性蛋白,如真菌免疫调节蛋白(FIP)、核糖体失活蛋白(RIPs)、金针菇毒素(FTX)等。被证实具有抗肿瘤的作用。
金针菇是国内外广泛栽培的一种食用菌品种，现在生产的金针菇，几乎都是工厂化栽培产品。这些公司，投资大，运行成本高，需要在生产以及流通的每一个环节降低成本，同时，更需要保证金针菇生产有较高的生物学效率，这样，企业才有竞争能力。据调查与反映，一个优良的金针菇品种，传3-5代后，其生产性能即生物学效率开始下降。于是，多数公司开始购买新菌种，但新购买的新菌种，生产性能并不能得到保证与稳定。致使有的企业，亏损严重。也有从国外引进菌种的，但每年一支母种，价格近百万。对于较小规模的种植户，是承受不起的。所以，对于大多数金针菇种植户来讲，对于目前用到的心仪品种，总想长久地用下去，发挥菌种的优良生产性能。但食用菌菌种的保存，与农作物种子保存干种子的方式不一样，其特点是保存在含有培养基质的玻璃试管内，等到用时，再传代转接，这样的无性繁殖，导致菌种生产性能退化严重。大多数种植户，没有恰当的菌种传代以及保藏方法，反复奔波于新菌种的试用中，而生产性能极不稳定，因此，寻找一种金针菇母种保藏办法，维持金针菇菌种的高效稳定生产性能，对于中小金针菇种植户很有必要。
金针菇母种保藏一般采用PDA试管低温传代保藏，在多次传代后菌种分解纤维素和木质素等有机养料的能力下降甚至严重退化，菌种不能继续使用。金针菇菌种保持持续的分解利用纤维素、木质素这类食用菌栽培培养料的能力即高效的纤维素酶、漆酶分泌能力是金针菇生产者最关注的，否则，原料不能被充分利用，生产效益就会低下。为解决这个问题有人将玉米粉、豆粉等有机养料加入培养基，但这些养料容易沉积在试管底部不被利用或者菌丝长势弱，不能诱导纤维素酶、漆酶的产生，对于维持菌种的生产性能稳定效果并不理想，寻找一种高效的能保证金针菇母种优良生产性能的培养基及方法，对于金针菇生产行业迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的在于克服金针菇母种现有保藏技术中存在的缺陷，提供一种金针菇母种保藏的培养基配方及方法，达到稳定金针菇母种的生产性能。
其具体技术方案为：
1制备两种金针菇母种保藏培养基
一种是常规PDA培养基：配方为土豆200g，葡萄糖20g，琼脂20g，自来水1000ml，pH自然。
具体做法如下：挑选新鲜的土豆，削皮，切成黄豆大小颗粒状，加水煮沸30min。过滤后取滤液，加入琼脂熬煮沸腾后，加入葡萄糖，搅拌均匀，分装试管。121℃灭菌20min，摆斜面。待培养基凝固后，即可传接母种。
另一种是改良PDA培养基：配方为土豆100g，葡萄糖10g，蛋白胨1g，酵母膏0.5g，羧甲基纤维素钠5g，愈创木酚0.5g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，琼脂粉20g，水1000ml，pH自然。
具体做法如下：挑选新鲜的土豆，削皮，切成黄豆大小颗粒状，加水煮沸30min。过滤后取滤液，加入蛋白胨、酵母膏、羧甲基纤维素钠、愈创木酚、磷酸二氢钾、硫酸镁、琼脂熬煮沸腾并全部溶解后，再加入葡萄糖，搅拌均匀，分装试管。121℃灭菌20min，摆斜面。待培养基凝固后，即可传接母种。
2金针菇母种传代时培养基的交替使用与保藏方法
金针菇母种的传代保存采用上面提供的常规PDA培养基与改良PDA培养基并交替使用，即奇数代用常规PDA培养基接种培养，长满菌丝体后低温保藏；而偶数代用改良PDA培养基接种培养，长满菌丝体后低温保藏。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
食用菌栽培的原料主要为农副产品下脚料，这些原料的营养成分主要特点是富含纤维素、半纤维素以及木质素等，他们难于被一般微生物分解利用。野生金针菇具有强有力的分解纤维素、半纤维素以及木质素的能力，所以金针菇栽培配方中添加了较多量的木屑，原因是该菌种能分泌利用木屑中的纤维素、木质素的纤维素酶、漆酶，使得金针菇高产、挺拔、菇型好。
然而，一株金针菇菌种获得后，需要传代培养保藏菌种，大多数菌种保藏者，简单地使用PDA培养基进行传代，随着这样传代方式的进行，菌种的生产性能越来越差。其根本原因在于，长期单一营养成分的培养基保藏菌种，会使菌种严重地丧失分泌某些主要酶系的功能，因为，在菌种长期保藏中，饲喂的营养物品质好，而生产上使用的原料，就营养说，是较为贫乏的。这样菌种保藏时，金针菇菌种长期得不到与生产相关的营养类似物的养分的供给，导致菌种利用营养基质的功能缺陷。为保持菌种在传代过程中，其生产性能不变，也即长期传代而还有丰富多样的高效酶系统存在，必须要改良培养基。
本发明就是在金针菇母种培养基中添加羧甲基纤维素钠和愈创木酚营养成分，让金针菇母种在传代过程中，有类似于天然木材的营养成分，能保持高效分泌纤维素酶，在生产中便于分解转化原料中的纤维素为金针菇菌丝体的组成，同时能保持高效分泌漆酶，在生产中便于分解转化原料中的木质素为金针菇菌丝体的组成。但是，单用改良培养基，导致金针菇菌丝体不太浓密，我们采用奇数代用常规PDA培养基接种培养，长满菌丝体后低温保藏；而偶数代用改良PDA培养基接种培养的交替方法，在保证菌种分解淀粉能力的同时有助于母种在多次传代过程中两种酶活性的保持，进而维持金针菇母种长久的良好的生产性能。
附图说明
图1为川金3#在培养基1上的酶活力曲线；
图2为金野在培养基1上的酶活力曲线；
图3为川金3#在培养基2上的酶活力曲线；
图4为金野在培养基2上的酶活力曲线；
图5为川金3#在培养基3上的酶活力曲线；
图6为金野在培养基3上的酶活力曲线；
图7为川金3#交替传代酶活力图；
图8为金野交替传代酶活力图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
为表明本方法的有效性和真实性，我们利用该方法，对金针菇母种交替培养保存后的菌种生产性能进行了测试，方法与结果如下：
1材料与方法
1.1供试菌株
川金3#和金野
1.2母种培养基
1号培养基：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂粉20g，水1000ml。
2号培养基：土豆100g，葡萄糖10g，蛋白胨1g，酵母膏0.5g，羧甲基纤维素钠5g，愈创木酚0.5g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，琼脂粉20g，水1000ml。
3号培养基：土豆50g，葡萄糖5g，蛋白胨1g，酵母膏0.5g，羧甲基纤维素钠8g，愈创木酚0.8g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，琼脂粉20g，水1000ml。
4号培养基：蛋白胨1g，羧甲基纤维素钠10g，愈创木酚1g，硫酸铵4g，磷酸二氢钾2g，琼脂粉20g，水1000ml。
1.3金针菇母种配方筛选以及交替使用效果评价
分别接种金针菇母种川金3#和金野于上述1、2、3、4号培养基中,然后放于恒温恒湿培养箱培养,记录菌丝生长情况。恒温恒湿培养箱内温度设定为24℃,相对湿度为50％,遮光培养。测定金针菇母种在每种培养基上，同一时间段产生羧甲基纤维素酶(CMC酶)、漆酶和淀粉酶活力。测试加了羧甲基纤维素钠和愈创木酚的3个培养基，哪一个培养基产生维素酶、漆酶的能力强，以此为后面交替保藏金针菇母种的配方。
交替使用效果评价：以常规的PDA培养基与选出的含羧甲基纤维素钠和愈创木酚的培养基为母种交替传代培养基，测试每一代培养后，金针菇母种维持分泌维素酶、漆酶的能力如果分泌二中与生产密切相关的酶的能力基本维持不变，则视为本方法在维持金针菇生产性能上有效，反之，则无效。
1.4金针菇母种在不同培养基中产酶酶活性测定
1.4.1粗酶液制备
试管培养4天后，每天定时刮下等量斜面菌丝，在无菌水中用玻璃珠打碎,用100mlPH4。8的0。2M乙酸盐缓冲液浸提1h后过滤，滤液经3500r/min离心10min，上清液即为粗酶液。
1.4.2羧甲基纤维素酶测定(CMC酶)活力测定
在试管中加入1％的羧甲基纤维素钠溶液(用PH4.8,0.2M乙酸盐缓冲溶液配制)1.8ml,加稀释10倍的粗酶液0.2ml,50℃水浴保温30min,再加入DNS试剂3ml,煮沸10min,取出冷却后加蒸馏水16.4ml,用721分光光度计测500nm波长处OD值，用沸水浴10min灭活的酶液作空白对照。
1.4.3漆酶活性测定
0.1mol/L pH 4.6的乙酸缓冲液3.4ml，加入3.36mM/l的邻联甲苯胺0.5ml，再加入粗酶液0.5ml,28℃保温30min,测600nm波长处的OD值。
1.4.4淀粉酶活力测定
在试管中加入1％的可溶性淀粉溶液(用PH4.8,0.2M乙酸盐缓冲溶液配制)0.5ml,40℃水浴保温30min,以后操作与CMC酶活力测定相同。
1.5数据处理
由于酶活性测定结果显示的数据接近，影响作图效果。所以，把淀粉酶数据放大10倍，CMC酶数据放大6倍，漆酶数据放大3倍，这样，图示效果美观，而不影响趋势。
2试验结果
2.1 2号培养基作为交替传代培养基效果最好
图1和图2表明川金3#和金野两个品种在1号培养基上3种酶活力从第4d开始总体呈现下降趋势，但是淀粉酶活力一直维持在一个较高水平，说明在1号培养基上菌种主要通过分解淀粉来维持生长。而CMC酶和漆酶活力不但低而且还在持续下降，说明长期在PDA培养基上生长可能导致菌种分解纤维素和木质素的能力下降甚至退化。这与1号培养基中的碳源以淀粉与糖有关。
图3和图4表明在川金3#和金野两个品种在2号培养基上淀粉酶活力呈现下降趋势，且下降幅度大，而CMC酶和漆酶的活力在逐渐上升。在0到7d内淀粉酶的活力高于CMC酶和漆酶，7d后CMC酶和漆酶活力超过了淀粉酶。说明在0到7d内菌种主要分解淀粉维持生长，7d后主要分解纤维素和木质素维持生长，从而导致CMC酶和漆酶活力逐渐升高。这与在2号培养基中提供了纤维素和木质素类似物有关。
图5和图6表明川金3#和金野两个品种在3号培养基上淀粉酶活力呈下降趋势而CMC酶和漆酶活力呈现上升趋势，与图4和图5比较而言CMC酶和漆酶活力超过淀粉酶活力的时间较早。说明淀粉含量减少，利用纤维素和木质素的的时间越早，且CMC酶和漆酶活力较培养基2上的更高。但如表1所示菌丝生长较慢，满管时间长，菌丝较疏。故淀粉含量不应过低。
表1菌丝生长情况表
综合上述6个酶活力图和菌丝生长情况表推测并得出以下结论：
(1)两个金针菇品种在只有纤维素和木质素作为碳源和氮源的4号培养基上不能生长。说明只有纤维素、木质素的培养基不能作为金针菇的母种培养基；
(2)综合前3个培养基的菌丝生长情况，我们从第4d开始取样测定菌丝的淀粉酶、CMC酶、漆酶活力，结果如图1到图6所示。将6个图的结果汇总发现两个金针菇品种在各个培养基上首先利用淀粉，淀粉量不足时才大量利用纤维素和木质素。所以要保持CMC酶和漆酶活力，培养基中淀粉含量要适中。
(3)金针菇母种利用PDA培养基长期传代保藏会使菌种的CMC酶和漆酶长期处于低活性状态，接种到原种培养基必然需要较长时间的适应期，加长了生长周期。而在培养基中添加羧甲基纤维素钠和愈创木酚可以保持CMC酶和漆酶的活性。图3到图6对比可以看出3号培养基上淀粉酶的活力低于CMC酶和漆酶活力的时间过早，不利于菌种淀粉酶活力的维持和传代培养。而2号培养基较适合。
为了使金针菇母种既能够长期传代保藏又不使其分解纤维素和木质素的能力退化，本研究设计了用2号培养基作为交替传代培养基，与PDA培养基进行交替传代培养。
2.2 2种培养基交替使用使金针菇母种能持续高产淀粉酶、纤维素酶、漆酶，保持菌种的优良生产性能。
图7、图8为川金3#以及金野两种母种交替使用2种母种培养基后，母种产生与生产性密切相关关键酶的曲线图。在淀粉酶曲线上，峰尖表示在PDA培养基上淀粉酶的活力，峰谷表示在2号培养基上的淀粉酶活力，从图中可看出通过交替培养淀粉酶活力波动较小，在同一种培养基上隔代测定结果也呈现出平稳现象。两图中CMC酶曲线和漆酶曲线，峰尖表示在2号培养基上的CMC酶和漆酶活力，峰谷表示在PDA培养基上的酶活力，从图中看出CMC酶和漆酶在不同培养基上活力波动较大，但峰谷随着传代次数的增加有上移现象，说明经过多次交替传代培养金针菇母种的CMC酶和漆酶活性在提高。
结论：2种保藏培养基交替使用来保藏金针菇母种，能维持主要酶之一的淀粉酶活性，长期采用该方法，还有略微提高CMC酶和漆酶活性的效果。说明，该方法用来保存金针菇母种的生产性能合适，可以推广采用。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

Claims (2)

1.一种金针菇母种保藏的培养基配方，其特征在于，土豆100g，葡萄糖10g，蛋白胨1g，酵母膏0.5g，羧甲基纤维素钠5g，愈创木酚0.5g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，琼脂粉20g，水1000ml。
2.一种金针菇母种保藏的培养基配方的制备方法，其特征在于，挑选新鲜的土豆，削皮，切成黄豆大小颗粒状；加水煮沸30min；过滤后取滤液，加入蛋白胨、酵母膏、羧甲基纤维素钠、愈创木酚、磷酸二氢钾、硫酸镁、琼脂熬煮沸腾并全部溶解后，再加入葡萄糖，搅拌均匀，分装试管；121℃灭菌20min，摆斜面；待培养基凝固后，即能传接母种。
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