CN103787768A - 一种食用菌母种培养基及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种食用菌母种培养基及其制备方法，该培养基包括以下成分：去皮马铃薯200克，硬杂木屑40克，葡萄糖10克，蔗糖10克，磷酸二氢钾2克，硫酸镁1.5克，赤霉素10-15毫克，2、4-D10-15毫克，琼脂18-20克，水1000毫升。本发明从不同食用菌菌种生物学特性进行研究，采用科学手段，在培养基中添加适量植物生长调节剂，在不影响食用菌菌种质量前提下，保护食用菌品种选育人的食用菌新品种短期内不被其他人扩繁，保护菌种选育人的知识产权不受他人侵害。本发明适用于平菇、香菇、黑木耳、滑菇、金针菇、猴头菌和灵芝母种。

Description

一种食用菌母种培养基及其制备方法

技术领域

本发明属于食用菌技术领域，涉及一种食用菌母种培养基及其制备方法。

背景技术

我国是食用菌生产大国，截止2002年12月末，我国食用菌年产量已超过2000万吨，占全世界食用菌总产量的70％以上。2006年6月，农业部颁布实施了农业行业法规——《食用菌菌种管理办法》，并开始实行食用菌新品种国家认定。食用菌新品种认定本着企业或科研单位自愿的原则，不是强制认定。企业或科研单位选育的食用菌新品种可以选择国家认定，也可以在当地省份进行省级认定。我国于1999年4月23日加入国际植物新品种保护联盟（UPOV），成为1978年版国际植物新品种保护公约的缔约国，并且成为国际植物新品种保护联盟的第39个成员国。2005年，我国首次公布食用菌保护物种——白灵菇，中国农业科学院农业资源研究所和农业部食用菌菌种质量监督检验测试中心研制了白灵菇新品种DUS测试指南，农业部植物新品种保护办公室已接受3个白灵菇新品种申请，这是我国食用菌品种权保护迈出的第一步。由于我国大多数食用菌菌种生产企业技术力量薄弱，不能进行复杂的食用菌新品种DUS测试。所以，我国许多食用菌新品种经过国家认定或省级认定后，大多数没有申报植物新品种保护。

虽然国际上有《植物新品种保护公约》，我国还是《植物新品种保护公约》的缔约国，但食用菌菌种生产具有特殊性。与大田作物使用的杂交品种不同，食用菌菌种生产90％为无性繁殖，即生产双核菌丝，菌种生产扩繁就是无限扩大双核菌丝体的数量。一个优良食用菌新品种需要科研人员投入大量的资金和人力才能获得，但这些食用菌新品种一旦上市销售，就被无证的小型菌种生产单位购入几只母种，然后重新命名进行生产和销售，这种侵权现象在国内普遍存在。食用菌菌种随意冠名、更名，导致同物异名严重，菌种管理极其混乱。

发明内容

为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明提供了一种食用菌母种培养基及其制备方法，从不同食用菌菌种生物学特性进行研究，采用科学手段，在培养基中添加适量植物生长调节剂，在不影响食用菌菌种质量前提下，保护食用菌品种选育人的食用菌新品种短期内不被其他人扩繁，保护菌种选育人的知识产权不受他人侵害。

其技术方案如下：

一种食用菌母种培养基，包括以下成分：去皮马铃薯200克，硬杂木屑40克，葡萄糖10克，蔗糖10克，磷酸二氢钾2克，硫酸镁1.5克，赤霉素10-15毫克，2、4-D10-15毫克，琼脂18-20克，水1000毫升。适用于平菇、香菇、黑木耳、滑菇、金针菇、猴头菌和灵芝母种。

一种食用菌母种培养基的制备方法，包括以下步骤：

（1）称量和配制：马铃薯去皮挖芽眼后按权利要求1所述配方称量后置容器内，加清水600毫升，文火煮沸20-30分钟，然后用4-6层湿纱布过滤取汁，木屑加清水800毫升，文火煮沸40-60分钟，然后用8层湿纱布过滤取汁，最后将马铃薯汁液与木屑滤液混合，并补足水量至1000毫升，然后将滤液放入不锈钢锅内，将不锈钢锅放在电炉上，并且加入葡萄糖、蔗糖、硫酸鎂、磷酸二氢钾等营养成分，当所有成分溶化后，再加入琼脂，待琼脂完全溶化后调节酸碱度；

（2）调节酸碱度：每种食用菌只在一定pH范围内生长，在制备培养基时必须测定并调整pH至所需范围，测定pH常用pH试纸或酸度计测定并加以矫正，用pH试纸为5.5-6.8的精密试纸测定，如果培养基pH值不在培养食用菌生长范围内要进行调整，培养基过酸可用10％氢氧化钠NaOH液调整，如果培养基过碱用稀酸HCl或乳酸液调整；

（3）加入琼脂，分装试管：将称好的琼脂剪成小块，加入配好的液体培养基中，边加热边搅拌，以防培养基沉锅底烧焦或溢出，烧糊的培养基营养物质遭破坏，且易产生对菌丝生长的有害物质，不宜再用，加热过程损失的水分应补足，待琼脂完全溶化后，纱布经热水浸后拧干，用湿纱布迅速过滤，以提高培养基的透明度，过滤后趁热分装，分装前准备好容器，分装试管时避免培养基粘附管口，如果不慎培养基粘着试管口用纱布擦净，以免培养基粘住棉塞影响接种，增加杂菌污染机率；制做斜面培养基装量为试管高度的1/5-1/4，分装时用漏斗置漏斗架上进行；

（4）塞棉塞：试管培养基分装好后加盖棉塞，棉塞用普通棉花制作，棉塞大小、松紧与试管口口径一致，塞入试管的棉塞紧贴管壁、不留缝隙，松紧度以提起棉塞后试管跟着提起而不脱落，拔出棉塞可听到轻微声音为宜；标准棉塞的塞头略大，不易变形，塞入试管部分占棉塞总长的2/3，露在试管外部为1/3，且不少于l厘米，塞好棉塞的试管培养基在棉塞外包扎一层牛皮纸或两层旧报纸，然后将试管培养基装入高压灭菌锅内，试管要竖直摆放，切勿倾斜或卧置。

进一步优选，步骤（3）中所述试管规格为20毫米×200毫米或25毫米×200毫米。

与现有技术相比，本发明的有益效果：常规食用菌试管母种，利用常规母种培养基再扩繁母种，在24℃-28℃条件培养，平菇母种6-7天长满斜面，黑木耳母种15天长满斜面，金针菇母种7-8天长满试管，猴头菌母种13-15天长满试管，灵芝母种10天长满试管斜面。而采用本发明母种培养基扩繁的母种，再采用常规食用菌培养基扩繁，不能在常规母种食用菌培养基上生长，只能在原种培养基上生长，然后进行食用菌栽培。

本发明从不同食用菌菌种生物学特性进行研究，采用科学手段，在培养基中添加适量植物生长调节剂，在不影响食用菌菌种质量前提下，保护食用菌品种选育人的食用菌新品种短期内不被其他人扩繁，保护菌种选育人的知识产权不受他人侵害。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。

一、食用菌母种培养基配方

马铃薯（去皮）200克，硬杂木屑40克，葡萄糖10克，蔗糖10克，磷酸二氢钾2克，硫酸镁1.5克，赤霉素10-15毫克，2、4-D10-15毫克，琼脂18-20克，水1000毫升。适用于平菇、香菇、黑木耳、滑菇、金针菇、猴头菌和灵芝母种。

二、培养基制作

1、称量和配制：马铃薯去皮挖芽眼后按配方称后置容器内，加清水600毫升，文火煮沸20-30分钟，然后用4-6层湿纱布过滤取汁，木屑加清水800毫升，文火煮沸40-60分钟，然后用8层湿纱布过滤取汁，最后将马铃薯汁液与木屑滤液混合，并补足水量至1000毫升。然后将滤液放入不锈钢锅内，将不锈钢锅放在电炉上，并且加入葡萄糖、蔗糖、硫酸鎂、磷酸二氢钾等营养成分，当所有成分溶化后，再加入琼脂，待琼脂完全溶化后调节酸碱度。

2、调节酸碱度：每种食用菌只在一定pH范围内生长，在制备培养基时必须测定并调整pH至所需范围。测定pH常用pH试纸或酸度计测定并加以矫正，用pH试纸为5.5-6.8的精密试纸测定。如果培养基pH值不在培养食用菌生长范围内要进行调整。培养基过酸可用10％氢氧化钠（NaOH）液调整。如果培养基过碱用稀酸（HCl）或乳酸液调整。

3、加入琼脂，分装试管：将称好的琼脂剪成小块，加入配好的液体培养基中，边加热边搅拌，以防培养基沉锅底烧焦或溢出，烧糊的培养基营养物质遭破坏，且易产生对菌丝生长的有害物质，不宜再用。加热过程损失的水分应补足。待琼脂完全溶化后，用湿纱布（纱布经热水浸后拧干）迅速过滤，以提高培养基的透明度，过滤后趁热分装。分装前准备好容器。制作母种常用试管规格有20毫米×200毫米或25毫米×200毫米等。分装试管时避免培养基粘附管口，如果不慎培养基粘着试管口用纱布擦净，以免培养基粘住棉塞影响接种，增加杂菌污染机率。制做斜面培养基装量为试管高度的1/5-1/4，分装时用漏斗置漏斗架上进行。

4、塞棉塞：试管培养基分装好后加盖棉塞。棉塞用普通棉花制作，棉塞大小、松紧与试管口口径一致，塞入试管的棉塞紧贴管壁、不留缝隙。松紧度以提起棉塞后试管跟着提起而不脱落，拔出棉塞可听到轻微声音为宜。标准棉塞的塞头略大，不易变形，塞入试管部分占棉塞总长的2/3，露在试管外部为1/3（且不少于l厘米）。塞好棉塞的试管培养基在棉塞外包扎一层牛皮纸或两层旧报纸，然后将试管培养基装入高压灭菌锅内，试管要竖直摆放，切勿倾斜或卧置。

三、高压灭菌

将母种试管培养基放入铁丝框，然后放入高压锅内，盖好高压灭菌锅后接通电源，待压力升至0.05兆帕（0.5千克/平方厘米）时，打开排气气阀，放尽冷空气，再加热至0.11（1.05千克/平方厘米）维持半小时后停止加热，使锅内压力自然下降。达到0.05兆帕时打开放气阀，锅内压力降至零后，再打开锅盖，利用余热烘干棉塞。灭菌时间过长，易破坏培养基中有效成分，增加酸度，致使凝固不良。

四、摆斜面冷却

1、摆斜面：高压锅内压力降至0后打开锅盖。温度降至60℃-65℃时摆斜面，以防止冷凝水在试管内积聚过多。摆放试管斜面时，试管下面垫1厘米厚木板，斜面长度为试管长度的1/2-2/3，待冷却后即成斜面培养基。冷天制作斜面或平板培养基时，在斜面或平板摆好后，马上覆盖一层洁净棉垫，以免斜面管壁和平板皿壁产生大量冷凝水珠，影响接种和培养。

2、无菌检查：灭菌结束后，在高压灭菌锅内不同位置抽取试管培养基若干支，贴好标签置25℃-30℃空白培养6天检查。如果所有试管培养基表面和内部均无任何变化，表明已达到灭菌目的，可供接种使用。

五、无菌接种

1、接种室消毒：接种室在接种前一天关好门窗，密闭接种室，每立方米空间用10毫升甲醛溶液与7克高锰酸钾混合熏蒸消毒，24小时后打开门窗，放出气体甲醛方可使用。接种前把母种培养基、菌种及接种工具放入接种室。先用3％煤酚皂水溶液喷雾消毒，使空气中微生物沉降。然后打开紫外线灯照射30分钟。接种人员进入接种室穿白大褂、拖鞋、戴帽子和口罩，操作前双手用75％酒精棉球擦洗消毒，动作轻缓，减少空气流动。

2、无菌接种

（1）接种前准备：接种前对接种室消毒，准备好接种工具，包括接种针针和接种钩。

（2）接种方法：接种前穿工作衣，用肥皂水洗手，擦干后用70％-75％酒精棉球擦拭双手和菌种管及接种钩。先在试管上贴标签，注明菌名、接种日期。然后点燃酒精灯，将母种和斜面培养基的两支试管用大拇指和其他四指握在左手中，使中指位于两试管间，斜面朝上，使它们处于水平状态。先将棉塞用右手拧转松动，右手像握笔一样拿接种钩，并在火焰上方灼烧灭菌。接种时要使试管口靠近酒精灯火焰旁。用右手小拇指、无名指、中指同时拔掉两支试管棉塞，并用手指夹紧。用火焰灼烧试管口，灼烧时不断转动试管口，烧死试管口沾染的杂菌。将灼烧灭菌的接种钩伸入菌种试管内，先接触没长菌丝的培养基部分冷却，然后轻轻挑取少许菌丝，迅速将接种钩抽出试管，在酒精灯火焰旁迅速将接种钩伸进另一支试管，将挑取的菌丝放在斜面培养基中央。抽出接种钩放入菌种试管内。然后灼烧试管口，在火焰旁将棉塞塞好后再接种下一支试管，1支试管母种转接30-40支。

六、恒温培养

1、恒温培养：接种后将试管放入22℃-26℃恒温培养箱中培养。在培养过程中，接种后菌种块上开始萌发新菌丝，7-10天菌种可长满斜面培养基。

2、检查杂菌：接种3-5天检查杂菌污染情况，在试管斜面培养基上发现有绿色、黄色、黑色等，不是白色、生长整齐一致斑点、块状杂菌，应立即剔除。并把长满试管的母种再次进行检查，挑出菌丝生长致密、洁白、健壮，无任何杂菌感染的试管菌种放于2℃-4℃冰箱中保存。

七、母种质量标准

1、平菇母种：菌丝生长粗壮整齐，洁白浓密，呈匍匐状，气生菌丝发达、爬壁力强，气生菌丝可布满试管空间；菌丝生长快，6-7天长满斜面，子实体原基尚未分化，培养基未收缩，无杂菌。

2、香菇母种：菌丝纯白色，粗壮，呈绒毛状，平伏生长，边缘呈不规则弯曲，长速中等，12-14天长满斜面，满管后略有爬壁，菌丝老化后培养基转为黄色，早熟种存放时间长易形成原基团。

3、黑木耳母种：菌丝白色，较细密，整齐，平贴于斜面培养基，不爬壁，生长速度较慢，15天长满斜面；有些品种可产生次生孢子，使培养基表面的菌丝体带有粉末状物；有些品种在斜面培养基上形成小原基均为正常菌种。

4、滑菇母种：菌丝白色，粗壮，浓密，绒毛状，平伏生长，不爬管，培养时间稍长，菌丝呈奶油色或红褐色，生长速度较慢，13-15天长满斜面。

5、金针菇母种

（1）黄色菌株：菌丝白色绒毛状，强壮、致密，紧贴培养基表面，生长速度快，7天长满试管培养基，长势均匀，粉孢子极少。在适宜温度条件下，培养基表面易出现淡黄白色的子实体。

（2）白色菌株：菌丝白色绒毛状，强壮、生长旺盛，气生菌丝爬壁，生长速度快，10天长满试管培养基。菌丝在琼脂斜面上长势均匀，接种块与生长菌丝间未见明显的分界线，粉孢子比黄色母种多，但未结成团状。

6、猴头菌母种：菌丝绒毛状，灰白色，浓密，紧贴斜面培养基，气生菌丝粗、短而稀疏，基内菌丝多，菌丝长速较慢，13-15天长满斜面，后期菌丝分泌棕褐色色素，培养基变为棕色至茶色，易形成珊瑚状子实体原基。

7、灵芝母种：菌丝白色，纤细，密集，棉絮状，匍匐生长，易形成菌膜，有韧性，不爬管，无色素，菌丝老化时呈淡黄色，菌丝生长速度中等，10天长满斜面。

八、母种短期保藏食用菌母种采用低温干燥条件冷藏，要求单独存放，防止菌种混杂。使用专门冷藏箱保藏，冷藏箱保藏温度2℃-4℃，保藏时间3-4个月。

以上所述，仅为本发明最佳实施方式，本发明的技术方案除了适用于平菇、香菇、黑木耳、滑菇、金针菇、猴头菌和灵芝母种外，还适用于其他菌类，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

Claims (3)

1.一种食用菌母种培养基，其特征在于，包括以下成分：去皮马铃薯200克，硬杂木屑40克，葡萄糖10克，蔗糖10克，磷酸二氢钾2克，硫酸镁1.5克，赤霉素10-15毫克，2、4-D10-15毫克，琼脂18-20克，水1000毫升。

2.一种食用菌母种培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）称量和配制：马铃薯去皮挖芽眼后按权利要求1所述配方称量后置容器内，加清水600毫升，文火煮沸20-30分钟，然后用4-6层湿纱布过滤取汁，木屑加清水800毫升，文火煮沸40-60分钟，然后用8层湿纱布过滤取汁，最后将马铃薯汁液与木屑滤液混合，并补足水量至1000毫升，然后将滤液放入不锈钢锅内，将不锈钢锅放在电炉上，并且加入葡萄糖、蔗糖、硫酸鎂、磷酸二氢钾，当所有成分溶化后，再加入琼脂，待琼脂完全溶化后调节酸碱度；

（2）调节酸碱度：用pH试纸为5.5-6.8的精密试纸测定，如果培养基pH值不在培养食用菌生长范围内要进行调整，培养基过酸可用10％氢氧化钠NaOH液调整，如果培养基过碱用稀酸HCl或乳酸液调整；

（3）加入琼脂，分装试管：将称好的琼脂剪成小块，加入配好的液体培养基中，边加热边搅拌，以防培养基沉锅底烧焦或溢出，烧糊的培养基营养物质遭破坏，且易产生对菌丝生长的有害物质，不宜再用，加热过程损失的水分应补足，待琼脂完全溶化后，纱布经热水浸后拧干，用湿纱布迅速过滤，以提高培养基的透明度，过滤后趁热分装，分装前准备好容器，分装试管时避免培养基粘附管口，如果不慎培养基粘着试管口用纱布擦净，以免培养基粘住棉塞影响接种，增加杂菌污染机率；制做斜面培养基装量为试管高度的1/5-1/4，分装时用漏斗置漏斗架上进行；

（4）塞棉塞：试管培养基分装好后加盖棉塞，棉塞用普通棉花制作，棉塞大小、松紧与试管口口径一致，塞入试管的棉塞紧贴管壁、不留缝隙，松紧度以提起棉塞后试管跟着提起而不脱落，拔出棉塞可听到轻微声音为宜；标准棉塞的塞头略大，不易变形，塞入试管部分占棉塞总长的2/3，露在试管外部为1/3，且不少于l厘米，塞好棉塞的试管培养基在棉塞外包扎一层牛皮纸或两层旧报纸，然后将试管培养基装入高压灭菌锅内，试管要竖直摆放，切勿倾斜或卧置。

3.根据权利要求1所述的食用菌母种培养基的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述试管规格为20毫米×200毫米或25毫米×200毫米。