CN109699682A

CN109699682A - 一种番茄生防种衣剂及其应用

Info

Publication number: CN109699682A
Application number: CN201910172228.1A
Authority: CN
Inventors: 王傲雪; 郑伟; 陈秀玲; 刘佳音; 张瑶
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2019-03-07
Filing date: 2019-03-07
Publication date: 2019-05-03
Anticipated expiration: 2039-03-07
Also published as: CN109699682B

Abstract

本发明涉及一种番茄生防种衣剂及其应用，属于生防菌应用技术领域。为解决针对番茄猝倒病和根腐病的农业防治效率低、化学防治污染大的问题，本发明提供了一种番茄生防种衣剂，包括复合菌剂和助剂，其中复合菌剂由贝莱斯芽孢杆菌WZ‑37、枯草芽孢杆菌WXCDD105、产氮假单胞菌WXCDD51、解淀粉芽孢杆菌Ba和枯草芽孢杆菌Bs wy‑1的发酵菌液复配制成；助剂包括赤霉素、增稠剂、分散剂、成膜剂和染色剂。本发明复合菌剂针对番茄猝倒病和根腐病的病原菌有稳定的抑菌效果，对两种病原菌菌丝生长的抑制率均达到100％。将本发明生防种衣剂应用于防治番茄猝倒病和根腐病，具有高效、经济、安全、残效期长的优点。

Description

一种番茄生防种衣剂及其应用

技术领域

本发明属于生防菌应用技术领域，尤其涉及一种番茄生防种衣剂及其应用。

背景技术

番茄苗期两种最常见的病害是番茄猝倒病和根腐病，这两种病害给番茄生产带来了巨大的经济损失。番茄猝倒病发病的主要表现为：出苗前猝倒烂种，种植初期幼苗靠土壤附近的茎上会长出大量水渍状斑痕，后期茎部缢缩导致番茄幼苗死亡，当土壤含水量较高时，表面生长出腐霉菌丝体，即白色絮状霉层。而番茄根腐病无论幼苗或大苗均可发病，但该病主要发生在定植后。在番茄根腐病发病初期，侧根逐渐腐烂，后期主根也产生褐色病斑，病斑扩大，根部腐烂，切开茎基部，韧皮部变褐，植株地上部分营养不良。

在番茄的种植和生产过程当中为了防止和控制番茄猝倒病和根腐病的发生，常用的措施之一是农业防治的办法，主要有选育抗病品种、轮作、调整种植时期、合理施肥、合理灌溉排水等方法，通过这些方法，可有效防治土传病害。但农业防治的方法费时费力，且效果有限。

与农业防治相比，化学防治的优点是更高效，广谱性强，更节约人力。但是，使用化学农药对环境造成的危害让人们无法忽视。农药在环境中无法降解，对土壤和水源造成污染，危害人类健康。若长期施用化学农药，病原菌也会产生抗药性，农药残留也会降低农产品品质，为农业生产带来危害。

发明内容

为解决针对番茄猝倒病和根腐病的农业防治效率低、化学防治污染大的问题，本发明提供了一种番茄生防种衣剂及其应用。

本发明的技术方案：

一种番茄生防种衣剂，包括复合菌剂和助剂，所述复合菌剂由贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)WZ-37、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WXCDD105、产氮假单胞菌(Pseudomonas azotoformans)WXCDD51、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)Ba和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Bs wy-1的发酵菌液复配制成。

进一步的，所述复合菌剂中贝莱斯芽孢杆菌WZ-37和枯草芽孢杆菌WXCDD105的活菌量均为10⁶cfu/mL，产氮假单胞菌WXCDD51、解淀粉芽孢杆菌Ba和枯草芽孢杆菌Bs wy-1的活菌量均为10⁴cfu/mL。

进一步的，所述贝莱斯芽孢杆菌WZ-37已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15766；枯草芽孢杆菌WXCDD105已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12496；产氮假单胞菌WXCDD51已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.12760；解淀粉芽孢杆菌Ba购自中国农业微生物保藏管理中心，保藏编号为ACCC10147；枯草芽孢杆菌Bs wy-1购自中国农业微生物保藏管理中心，保藏编号为ACCC10655。

进一步的，所述助剂包括如下重量份的组分：增稠剂0.5～1.5份、分散剂0.05～0.15份、成膜剂0.5～1.5份和染色剂0.5～0.8份。

进一步的，所述增稠剂为气相二氧化硅、硅藻土或高岭土中的一种或几种的组合；所述分散剂为木质素磺酸钠、十二烷基苯磺酸钠或拉开粉中的一种或几种的组合；所述成膜剂为聚乙烯吡咯烷酮、阿拉伯胶或聚乙烯醇中的一种或几种的组合；所述染色剂为红色珠光粉。

进一步的，所述复合菌剂与助剂的体积质量比为1mL：(0.5～1.0)g。

进一步的，还包括赤霉素溶液，所述赤霉素溶液由0.1g赤霉素GA3溶解至1mL体积分数为75％的乙醇配制而成，所述复合菌剂与赤霉素溶液的体积比为1mL：2～20μL。

进一步的，种衣剂的pH值为6～7。

进一步的，其组分包括5mL复合菌剂、33.3μL赤霉素溶液、1.3g气相二氧化硅、0.05g十二烷基苯磺酸钠、1g阿拉伯胶、0.5g珠光粉、100μL摩尔浓度为1mol/L的HCl和15mL无菌水。

本发明提供的一种番茄生防种衣剂在防治番茄猝倒病和根腐病中的应用。

本发明的有益效果：

本发明提供的由五株生防菌复配制成的复合菌剂针对番茄猝倒病和根腐病的病原菌有稳定的抑菌效果，对两种病原菌菌丝生长的抑制率均达到100％，显著优于单一生防菌的抑菌效果。本发明生防种衣剂对番茄猝倒病、根腐病均有较好的预防效果，显著优于现有农业防治和化学防治的效果。

本发明提供的五株生防菌均对番茄种子的萌发及胚根的生长有促进作用，但复合菌剂在单一生防菌的基础上使种子48h发芽率再提高4.5％。本发明在种衣剂配方中添加了赤霉素，进一步提高了番茄中的萌发率。

本发明将生防菌复合菌剂与助剂混合制成种衣剂，具有高效、经济、安全、残效期长的特点。在番茄种子外层形成一种保护膜，使药力集中，利用效率高，省工省时省料；种衣剂能显著提高种子质量，出苗齐、壮，节省种子，降低了生产成本。而生防种衣剂与化学防治相比属于隐蔽使用，对大气、土壤无污染，不伤天敌，不会发生药害，使用更加安全。本发明生防种衣剂播种后可防治土壤中病原菌的侵袭。同时，随着种子发芽出土，复合菌剂从种衣中逐渐释放，还可防治地上部病原菌的侵害。

附图说明

图1为生防菌WXCDD105的形态学图片，A为菌落形态，B为显微形态；

图2为生防菌WXCDD51的形态学图片，A为菌落形态，B为显微形态；

图3为生防菌WZ-37的形态学图片，A为菌落形态，B为显微形态；

图4为生防菌Ba的形态学图片，A为菌落形态，B为显微形态；

图5为生防菌Bs wy-1的形态学图片，A为菌落形态，B为显微形态；

图6为实施例2所得五株生防菌单一菌液和复合菌剂分别对番茄猝倒病抑菌效果图；

图7为实施例2所得五株生防菌单一菌液和复合菌剂分别对番茄根腐病抑菌效果图；

图8为实施例2所得五株生防菌单一菌液和复合菌剂分别对黄瓜炭疽病抑菌效果图；

图9为实施例2所得五株生防菌单一菌液和复合菌剂分别对番茄枯萎病抑菌效果图；

图10为实施例2所得五株生防菌单一菌液和复合菌剂分别对甜瓜枯萎病抑菌效果图；

图11为实施例2所得五株生防菌单一菌液和复合菌剂分别对番茄立枯病抑菌效果图；

图12为实施例2所得五株生防菌单一菌液和复合菌剂分别对瓜果腐霉菌菌丝生长量的抑制效果对比图；

图13为实施例2所得五株生防菌单一菌液和复合菌剂分别对镰刀菌菌丝生长量的抑制效果对比图；

图14为实施例2所得五株生防菌单一菌液和复合菌剂分别对番茄种子萌发的促进作用对比图；

图15为实施例2所得五株生防菌单一菌液和复合菌剂分别对番茄种子根长的促进作用对比图；

图16为实施例4种衣剂含有不同浓度的赤霉素对番茄番茄种子萌发的促进作用对比图；

图17为实施例4种衣剂含有不同浓度的赤霉素对番茄番茄种子根长的促进作用对比图；

图18为实施例5所得种衣剂成品和经种衣剂处理后的番茄种子；

图19为实施例5三种处理对番茄苗期生长的促进作用对比图；

图20为实施例5三种处理对番茄苗期根系的促进作用对比图；

图21为实施例5三种处理对番茄猝倒病发病的抑制情况对比图；

图22为实施例5三种处理对番茄猝倒病发病的发生趋势的影响对比图；

图23为实施例5三种处理对番茄根腐病发病的抑制情况对比图；

图24为实施例5种衣剂中的生防菌含量随保存时间的变化曲线；

图25为实施例5保存90天后种衣剂对番茄种子发芽的促进作用对比图；

图26为实施例5保存90天后种衣剂处理过的番茄胚根的生长情况对比图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。

实施例1

实施例2

其中贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)WZ-37已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15766。

将贝莱斯芽孢杆菌WZ-37菌株在LB平皿上三区划线，在37℃生化培养箱培养24h后，菌落透明，圆形，表面湿润，光滑，边缘整齐，培养48h后菌落呈灰白色，圆形，表面干燥，褶皱，不透明，边缘整齐，如图3A所示。挑取部分菌落进行革兰氏染色，使用光学显微镜观察，菌体呈紫色，表明该菌为革兰氏阳性菌，菌体呈杆状，单个或成对排列，大小0.5～0.7μm×1.6～5.0μm，如图3B所示。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WXCDD105已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12496。

将枯草芽孢杆菌WXCDD105在LB平皿上三区划线，37℃培养24h后，菌落呈淡黄色，表面干燥，平伏，边缘不整齐，如图1A所示。挑取部分菌落进行革兰氏染色，使用光学显微镜观察，菌体呈紫色，表明该菌为革兰氏阳性菌，菌体杆状，大小0.7～0.8μm×1.8～3.3μm，单个或成对排列，如图1B所示。

产氮假单胞菌(Pseudomonas azotoformans)WXCDD51已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12760。

将产氮假单胞菌WXCDD51在LB平皿上三区划线，在37℃生化培养箱培养24h后，菌落圆形，表面湿润，光滑，边缘整齐，微微凸起，如图2A所示。该菌分泌褐色色素，挑取部分菌落进行革兰氏染色，使用显微镜下观察，菌体红色，表明该菌为革兰氏阴性菌，菌体呈杆状，单个或成对排列，大小0.4-0.6μm×0.9-1.7μm，如图2B所示。

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Ba购自中国农业微生物保藏管理中心，保藏编号为ACCC10147。

将解淀粉芽孢杆菌Ba在LB平皿上三区划线，在37℃生化培养箱培养24h后，菌落透明，圆形，表面湿润，光滑，边缘整齐；48h后菌落呈米黄色，圆形，表面干燥，褶皱，不透明，边缘整齐，如图4A所示。挑取少量菌落进行革兰氏染色，使用光学显微镜观察，菌体呈紫色，表明该菌为革兰氏阳性菌，菌体杆状，单个或成对排列，大小0.3～2.2×1.2～7.0μm，如图4B所示。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Bs wy-1购自中国农业微生物保藏管理中心，保藏编号为ACCC10655。

将枯草芽孢杆菌Bs wy-1在LB平皿上三区划线，在37℃生化培养箱培养24h后，菌落平伏，边缘不整齐，如图5A所示。挑取部分菌落进行革兰氏染色，使用光学显微镜观察，菌体呈紫色，表明该菌为革兰氏阳性菌，菌体呈杆状，单个或成对排列，大小0.7～0.8μm×1.8～3.3μm，如图5B所示。

本实施例使用的培养基配方如下：

LB培养基：NaCl 10g，酵母浸粉5g，蛋白胨10g，琼脂15～20g，蒸馏水1000mL。

LB液体培养基：NaCl 10g，酵母浸粉5g，蛋白胨10g，蒸馏水1000mL。

PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，蒸馏水1000mL。

PDB培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，蒸馏水1000mL。

解淀粉芽孢杆菌Ba专用培养基：可溶淀粉44g，花生饼粉13.1g，磷酸二钠0.4g，无水氯化钙30g，磷酸二氢钾1.5g,蒸馏水1000mL。

枯草芽孢杆菌Bs wy-1专用培养基：磷酸二钠10g，丙三醇22g，花生饼粉12.4g，无水氯化钙0.9g，磷酸二氢钾10g，蒸馏水1000mL。

产氮假单胞菌WXCDD51专用培养基：49.7g，酵母粉14.8g，磷酸二氢钾0.6g，磷酸二钠1.5g，NaCl 3g，硫酸镁0.3g,蒸馏水1000mL。

枯草芽孢杆菌WXCDD105专用培养基：蔗糖44g，酵母粉13.2g，氯化钙0.8g，磷酸二氢钾1g，硫酸锰0.2g,蒸馏水1000mL。

本实施例中生防菌复合菌剂的制备方法如下：

(1)平皿培养：取出4℃冰箱中保存的无株生防菌的试管斜面，挑取菌苔分别在倒好的平板培养基上三区划线，28℃恒温箱中培养24h。

(2)液体培养：取平皿上的单菌落分别接种至液体培养基中，28℃，200r/min培养120h，使发酵液中活菌数达到10⁹cfu/mL以上并且产生芽孢量大于90％。

(3)根据发酵液中的活菌数对发酵液进行稀释，取相应体积的五株生防菌的发酵液混合制得复合菌剂，使本实施例复合菌剂中贝莱斯芽孢杆菌WZ-37和枯草芽孢杆菌WXCDD105的活菌量均为10⁶cfu/mL，产氮假单胞菌WXCDD51、解淀粉芽孢杆菌Ba和枯草芽孢杆菌Bs wy-1的活菌量均为10⁴cfu/mL。

以下实验分别验证了五株生防菌单一菌液和复合菌剂H对番茄猝倒病、番茄根腐病、黄瓜炭疽病、番茄枯萎病、甜瓜枯萎病和番茄立枯病的病原菌抑制效果：

实验方法：使用牛津杯法进行对峙试验。将病原菌接种至PDA平皿中央，边缘选取三个点放置三个牛津杯。牛津杯中分别加入100μL进行液体培养24h后的生防菌Ba、WZ-37、Bs wy-1、WXCDD105、WXCDD51的单一菌液及五种生防菌等量混合制备的复合菌剂，设置一组只接种病原菌的对照组，每组3次重复，7d后观察生防菌抑制病原菌生长的效果。

图6为本实施例所得五株生防菌单一菌液和复合菌剂分别对番茄猝倒病抑菌效果图；PA表示番茄猝倒病的病原菌瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)，由图6可以看出复合菌剂H对番茄猝倒病病原菌的抑制效果最好，其次为WXCDD51>WXCDD105>WZ-37>Ba>Bs wy-1。

图7为本实施例所得五株生防菌单一菌液和复合菌剂分别对番茄根腐病抑菌效果图；FS表示番茄根腐病的病原菌镰刀菌(Fusarium sp.)，由图7可以看出复合菌剂H对番茄根腐病病原菌的抑制效果最好，其次为WZ-37>Bs wy-1>WXCDD105>Ba>WXCDD51。

图8为本实施例所得五株生防菌单一菌液和复合菌剂分别对黄瓜炭疽病抑菌效果图；由图8可以看出复合菌剂H对黄瓜炭疽病病原菌的抑制效果最好，其次为WXCDD105>Ba>WZ-37>Bs wy-1>WXCDD51。

图9为本实施例所得五株生防菌单一菌液和复合菌剂分别对番茄枯萎病抑菌效果图；由图9可以看出复合菌剂H对番茄枯萎病病原菌的抑制效果最好，其次为WXCDD105>Ba>WZ-37>WXCDD51>Bs wy-1。

图10为实施例2所得五株生防菌单一菌液和复合菌剂分别对甜瓜枯萎病抑菌效果图；由图10可以看出复合菌剂H对甜瓜枯萎病病原菌的抑制效果最好，其次为WZ-37>Ba>WXCDD105>Bs wy-1>WXCDD51。

图11为实施例2所得五株生防菌单一菌液和复合菌剂分别对番茄立枯病抑菌效果图；由图11可以看出复合菌剂H对番茄立枯病病原菌的抑制效果最好，其次为Ba>WZ-37>WXCDD105>Bs wy-1>WXCDD51。

以下实验分别验证了五株生防菌单一菌液和复合菌剂H对番茄猝倒病病原菌PA和番茄根腐病病原菌FS菌丝生长的抑制作用：

实验方法：按照1％接种量，将28℃、200r/min培养24h的五株生防菌菌液、复合菌剂(H)分别接种至75mL PDB培养基中，随后分别放入直径5mm的病原菌菌块，对照组只接种病原菌。在28℃、200r/min培养7d，用无菌滤纸过滤菌液，收集菌丝，在60℃烘箱内烘干，称重。每组3次重复。菌丝抑制率公式如1所示：

实验结果如图12、图13和表1所示：

图12为本实施例所得五株生防菌单一菌液和复合菌剂分别对番茄猝倒病病原菌瓜果腐霉菌菌丝生长量的抑制效果对比图；图13为本实施例所得五株生防菌单一菌液和复合菌剂分别对番茄根腐病病原菌镰刀菌菌丝生长量的抑制效果对比图；由图12和图13分别可以看出，五株生防菌单一菌液和复合菌剂H对两种病原菌的菌丝生长均有明显的抑制作用，其中复合菌剂H的抑制作用最好。

收集菌丝后，经烘干、称重、计算得出的菌丝干重和菌丝抑制率如表1所示：

表1

由表1可知，WZ-37、WXCDD105、WXCDD51、Bs wy-1、Ba、H对番茄猝倒病病原菌PA的菌丝抑制率分别达到92.96％、91.55％、100.00％、91.08％、93.90％、100.00％；对番茄根腐病FS的菌丝抑制率分别为100.00％；100.00％；96.66％；95.55％；94.71％；100.00％。本实验不仅能证实复合菌剂的抑菌效果优于单一生防菌，还可证明五株生防菌互不抑制生长，菌株进行混合培养后，其原本的优势不受影响，复配菌液的抑菌范围更加广泛。

以下实验分别验证了五株生防菌单一菌液和复合菌剂H对番茄种子的促生作用：

实验方法：供试番茄品种为东农713。将番茄种子按以下方法消毒：55℃温水中浸种，冷却至室温。用2％次氯酸钠浸种15min，无菌水冲洗6次，再用75％乙醇浸种30s，无菌水冲洗6次，待用。将五株生防细菌(原菌液10⁹cfu/mL)均稀释200倍，并设置一组将菌液混合的处理(H)，一组无菌水对照，将消毒后的种子在七组处理中浸泡，3h后将番茄种子置于铺有一层无菌滤纸的平皿中，每皿30粒种子，用2mL无菌水浸湿。48h时记录种子萌发率，4d时测量胚根生长量。每组处理3次重复，实验结果如图14、图15所示：

图14为实施例2所得五株生防菌单一菌液和复合菌剂分别对番茄种子萌发的促进作用对比图；由图14可知，48h时单一菌株对种子萌发的促进效果依次为WXCDD105>Bs wy-1>WZ-37>WXCDD51>Ba，均高于无菌水(CK)，WXCDD105显著高于其他组。将五种菌液等比例复合后，复合菌剂H的萌发率高于WXCDD105，说明菌液复合后没有降低WXCDD105促进种子萌发的能力，且效果优于WXCDD105。

图15为实施例2所得五株生防菌单一菌液和复合菌剂分别对番茄种子根长的促进作用对比图；由图15可知，生防菌处理组的根长均高于CK，复合菌剂H组对根系发育的促进效果更好，说明生防菌有利于植物生的长发育。

实施例3

其中复合菌剂中贝莱斯芽孢杆菌WZ-37和枯草芽孢杆菌WXCDD105的活菌量均为10⁶cfu/mL，产氮假单胞菌WXCDD51、解淀粉芽孢杆菌Ba和枯草芽孢杆菌Bs wy-1的活菌量均为10⁴cfu/mL。

本实施例助剂包括如下重量份的组分：增稠剂0.5～1.5份、分散剂0.05～0.15份、成膜剂0.5～1.5份和染色剂0.5～0.8份。

本实施例中复合菌剂与助剂的体积质量比为1mL：(0.5～1.0)g。

其中增稠剂为气相二氧化硅、硅藻土或高岭土中的一种或几种的组合；分散剂为木质素磺酸钠、十二烷基苯磺酸钠或拉开粉中的一种或几种的组合；成膜剂为聚乙烯吡咯烷酮、阿拉伯胶或聚乙烯醇中的一种或几种的组合；染色剂为红色珠光粉。

经菌量变化实验显示，本实施例选用的助剂对各生防菌的生长均无不良影响，增稠剂可增加种衣剂粘度，粘度适宜会增加悬浮液的稳定性；分散剂的作用是防止液体中的颗粒发生沉降和絮凝，使悬浮液性质稳定；成膜剂能形成稳定的膜结构，在番茄种子外层形成一种保护膜。本实施例将复合菌剂与助剂制作成种衣剂使复合菌剂药力集中，利用效率高，省工省时省料；种衣剂能显著提高种子质量，出苗齐、壮，节省种子，降低了生产成本。而生防种衣剂与化学防治相比属于隐蔽使用，对大气、土壤无污染，不伤天敌，不会发生药害，使用更加安全。本发明生防种衣剂播种后可防治土壤中病原菌的侵袭。同时，随着种子发芽出土，复合菌剂从种衣中逐渐释放，还可防治地上部病原菌的侵害。

实施例4

其中复合菌剂与助剂的体积质量比为1mL：(0.5～1.0)g；增稠剂为气相二氧化硅、硅藻土或高岭土中的一种或几种的组合；分散剂为木质素磺酸钠、十二烷基苯磺酸钠或拉开粉中的一种或几种的组合；成膜剂为聚乙烯吡咯烷酮、阿拉伯胶或聚乙烯醇中的一种或几种的组合；染色剂为红色珠光粉。

本实施例种衣剂配方中还包括赤霉素溶液，赤霉素溶液由0.1g赤霉素GA3溶解至1mL体积分数为75％的乙醇配制而成，复合菌剂与赤霉素溶液的体积比为1mL：2～20μL。

以下实验分别验证了加入赤霉素后种衣剂配方对番茄种子萌发和植物生长的影响：

实验方法：将0.1g GA3溶解至1mL 75％乙醇中，取100μL、40μL、33.3μL、10μL加入种衣剂，将消毒后的番茄种子进行包衣，以无菌水处理，仅种衣剂处理为对照，置于铺有一层无菌滤纸的平皿中，每皿30粒种子，用2mL无菌水浸湿。以48h发芽率为指标，挑选最佳GA3浓度，4d后测胚根生长量差异，实验结果由图16和图17所示：

图16为本实施例种衣剂含有不同浓度的赤霉素对番茄番茄种子萌发的促进作用对比图，图中S表示未加赤霉素的种衣剂处理组，1、2、3、4为加入100μL、40μL、33.3μL、10μL赤霉素的种衣剂处理组；由图16可知，含有赤霉素的种衣剂对番茄种子的萌发有促进作用，发芽率显著高于其他处理。

图17为本实施例种衣剂含有不同浓度的赤霉素对番茄番茄种子根长的促进作用对比图，图中S表示未加赤霉素的种衣剂处理组，1、2、3、4为加入100μL、40μL、33.3μL、10μL赤霉素的种衣剂处理组；由图17可知，含有赤霉素的种衣剂对番茄种子胚根的生长有促进作用，胚根的长度也优于其他处理，并显著高于未加入赤霉素的种衣剂处理及CK处理，说明加入赤霉素的种衣剂，可以提高种衣剂促进种子萌发、植物生长的能力。

实施例5

本实施例生防种衣剂的组分具体包括5mL复合菌剂、33.3μL赤霉素溶液、1.3g气相二氧化硅、0.05g十二烷基苯磺酸钠、1g阿拉伯胶、0.5g珠光粉、100μL摩尔浓度为1mol/L的HCl和15mL无菌水，种衣剂的pH值为6～7。

本实施例种衣剂的具体制备步骤：

(1)将五株生防菌按1％接种量接种至各菌专用培养基中，当菌量达到10⁹cfu/mL，芽孢数占90％以上时(约5d)备用。

(2)向无菌三角瓶中加入阿拉伯胶1g、十二烷基苯磺酸钠0.05g、气相二氧化硅1.3g、1mol/LHCl 100μL、15mL无菌水，震荡，使固体在水中均匀分散。

(3)取2μLWXCDD51，2.5μL Ba，1.4μLWZ-37，1.4μLWXCDD105，2.5μLBs wy-1的菌液加入配方中，混匀。

本实施例制备的生防种衣剂相关技术指标：

(1)外观：包括颜色，状态等；艳红色，可流动的悬浮液，无结块。长期静置会出现少量沉淀，轻微摇晃后恢复悬浮状态。包衣后种子呈粉色；图18为实施例5所得种衣剂成品和经种衣剂处理后的番茄种子。

(2)有效成分；主要为微生物，含菌量为7×10⁵cfu/mL，取10粒包衣后的番茄种子溶于1mL无菌水中，得出含菌量约为5.6×10⁵cfu/mL。

(3)使用雷磁PHS-25酸度计测量种衣剂Ph；五种生防菌生长的最适pH为3～7，番茄种子萌发的最适的pH为6～7，赤霉素不与碱性溶液混用，因此，控制种衣剂pH应控制在6～7之间。

(4)种衣剂含固量：取一块玻璃片称重(W₀)，取1mL种衣剂滴加至玻璃片称量质量(W₁)，将滴有种衣剂的玻璃片置于60℃烘箱，30min后称重(W₂)。含固量按2公式计算：

取1mL种衣剂烘干后计算得知种衣剂含固量为12.73％。

(5)成膜时间：包衣后室温下放置待完全晾干需要20min。

以下实验验证了本实施例制备的生防种衣剂S对番茄苗期的促生效果：

实验方法：

(1)营养土灭菌：在灭菌袋中装入2/3体积的营养土，封口，使用高压蒸汽灭菌锅维持压力0.1MPa，121℃灭菌60min，晾凉备用。

(2)用多菌灵、无菌水、本实施例制备的生防种衣剂分别处理番茄种子，将处理后的番茄种子播种到装有灭菌土育苗盘中，保持水分充足，15d后分苗，移至营养钵，每处理15棵苗，移苗21d后用MNT-300T锌合金数显游标卡尺测量根长、株高、鲜重。用锡纸包好，在60℃烘箱烘干3d后测量植株干重。每组三次重复；实验结果如图19和图20所示：

图19为实施例5三种处理对番茄苗期生长的促进作用对比图；由图19可知，使用多菌灵(D)及无菌水(CK)为对照，可见生防种衣剂(S)处理的种子在分苗21d后，表现出了明显的生长优势，S组的幼苗发育更快，地上部分更为茂盛。

图20为实施例5三种处理对番茄苗期根系的促进作用对比图；使用生防种衣剂(S)处理后的番茄种子在苗期，根部发育明显优于其他两种处理，主根更长，侧根更茂盛。本实施例生防种衣剂(S)对番茄幼苗的促生作用如表2所示：

表2

由表2中数据可知，比较三种处理的株高、根长、鲜重、干重结果均为S＞D＞CK；三种处理的茎粗S＞CK＞D。该结果说明本实施例由复合菌剂制备的生防种衣剂对番茄幼苗有明显的促生效果，起到了调节植物生长的作用。

以下实验验证了本实施例制备的生防种衣剂(S)对番茄根腐病和猝倒病的温室防效：

(1)对番茄猝倒病的防效

实验方法：用多菌灵(D)、无菌水(CK)、种衣剂(S)分别处理番茄种子，将处后的番茄种子播种到装有灭菌土的育苗盘中，保持水分充足。播种7d时将PA-4接种至PDB，28℃、180r/min培养7d后按1：10(v/w)的比例拌土。将育苗盘中的幼苗移栽至装有拌菌土的营养钵中，每钵10棵，48h后调查幼苗死亡率。每组3次重复，结果如图21和图22所示：

图21为实施例5三种处理对番茄猝倒病发病的抑制情况对比图；由图21可知，使用病原菌侵染番茄幼苗，96h后，无菌水处理组(CK)幼苗猝倒严重，多菌灵对照(D)也有部分幼苗发生猝倒，而种衣剂(S)处理的幼苗仅少量发病。

图22为实施例5三种处理对番茄猝倒病发病的发生趋势的影响对比图；由图22可知，前72h幼苗死亡率CK＞S＞D；在第96h以后，幼苗死亡率CK＞D＞S；在第144h后，幼苗不再死亡，此时CK、D、S处理的幼苗的死亡率分别为90％、83.33％、63.33％。此实验结果说明，本实施例制备的生防种衣剂(S)处理的番茄种子在幼苗阶段有更好的抗番茄猝倒病的能力，可以有效防止番茄猝倒病病原菌瓜果腐霉的侵染。

(2)对番茄根腐病的防效

实验方法：用多菌灵(D)、无菌水(CK)、种衣剂(S)分别处理番茄种子，将处后的番茄种子播种到装有灭菌土的育苗盘中，保持水分充足。播种15d时将RS-1接种至PDB，28℃、180r/min培养7d后按1：10(v/w)的比例拌土。将育苗盘中的幼苗移栽至装有拌菌土的营养钵中，每钵5棵，两钵一组，每组三次重复，结果如图23。

经过各种处理后，25～30℃保湿培养，20d观察发病情况。依照根腐病根茎部病斑面积分级，番茄根腐病程较长，普遍分为以下几级：

0级根系无腐烂变褐；

1级根系腐烂占根部1/3以下；

3级根系腐烂占根部1/3～1/2；

5级根系腐烂占根部1/2～3/4；

7级根系腐烂占根部3/4以上。

统计病情指数和防治效果。按照公式3、4计算。

结果表3所示：

表3

图23为实施例5三种处理对番茄根腐病发病的抑制情况对比图；使用番茄根腐病病原菌侵染番茄幼苗，21d后，无菌水处理组(CK)幼苗根腐严重。无菌水处理组(CK)的须根基本全部腐烂，主根上生长大片病斑，下部叶片变黄。如表3所示，病情指数CK＞S＞D，多菌灵(D)相对防治效果为40％，本实施例制备的生防种衣剂(S)达到84.54％，显著高于多菌灵。

以下实验测试了本实施例制备的生防种衣剂S的保质期：

测试方法：将微生物种衣剂保存至4℃冰箱。每隔30d测定种衣剂的含菌量，生防菌含量随保存时间的变化曲线如图24所示，在0-30d菌数下降明显，下降了23.9％。30d后，菌量趋于稳定。此时种衣剂中微生物的浓度为5.37×10⁵cfu/mL。

用保存90天后的种衣剂进行番茄促生实验，结果如图25所示，第90d使用种衣剂对番茄种子进行包衣，与无菌水(CK)相比，种子包衣剂(S)对种子萌发仍有明显的促进作用。

图26为本实施例保存90天后种衣剂处理过的番茄胚根的生长情况对比图，由图26可知，本实施例提供的生防种衣剂(S)处理后的番茄胚根的生长明显优于CK。

实施例6

本实施例生防种衣剂的组分具体包括5mL复合菌剂、40μL赤霉素溶液、0.5g气相二氧化硅、0.05g十二烷基苯磺酸钠、0.5g阿拉伯胶、0.5g珠光粉、100μL摩尔浓度为1mol/L的HCl和15mL无菌水，种衣剂的pH值为6～7。

实施例7

本实施例生防种衣剂的组分具体包括5mL复合菌剂、30μL赤霉素溶液、1.0g气相二氧化硅、0.1g十二烷基苯磺酸钠、1g阿拉伯胶、0.6g珠光粉、100μL摩尔浓度为1mol/L的HCl和15mL无菌水，种衣剂的pH值为6～7。

实施例8

本实施例生防种衣剂的组分具体包括5mL复合菌剂、20μL赤霉素溶液、1.5g气相二氧化硅、0.15g十二烷基苯磺酸钠、1.5g阿拉伯胶、0.7g珠光粉、100μL摩尔浓度为1mol/L的HCl和15mL无菌水，种衣剂的pH值为6～7。

Claims

1.一种番茄生防种衣剂，其特征在于，包括复合菌剂和助剂，所述复合菌剂由贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)WZ-37、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WXCDD105、产氮假单胞菌(Pseudomonas azotoformans)WXCDD51、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)Ba和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Bs wy-1的发酵菌液复配制成。

2.根据权利要求1所述一种番茄生防种衣剂，其特征在于，所述复合菌剂中贝莱斯芽孢杆菌WZ-37和枯草芽孢杆菌WXCDD105的活菌量均为10⁶cfu/mL，产氮假单胞菌WXCDD51、解淀粉芽孢杆菌Ba和枯草芽孢杆菌Bs wy-1的活菌量均为10⁴cfu/mL。

3.根据权利要求1或2所述一种番茄生防种衣剂，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌WZ-37已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.15766；枯草芽孢杆菌WXCDD105已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12496；产氮假单胞菌WXCDD51已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12760；解淀粉芽孢杆菌Ba购自中国农业微生物保藏管理中心，保藏编号为ACCC10147；枯草芽孢杆菌Bs wy-1购自中国农业微生物保藏管理中心，保藏编号为ACCC10655。

4.根据权利要求3所述一种番茄生防种衣剂，其特征在于，所述助剂包括如下重量份的组分：增稠剂0.5～1.5份、分散剂0.05～0.15份、成膜剂0.5～1.5份和染色剂0.5～0.8份。

5.根据权利要求4所述一种番茄生防种衣剂，其特征在于，所述增稠剂为气相二氧化硅、硅藻土或高岭土中的一种或几种的组合；所述分散剂为木质素磺酸钠、十二烷基苯磺酸钠或拉开粉中的一种或几种的组合；所述成膜剂为聚乙烯吡咯烷酮、阿拉伯胶或聚乙烯醇中的一种或几种的组合；所述染色剂为红色珠光粉。

6.根据权利要求5所述一种番茄生防种衣剂，其特征在于，所述复合菌剂与助剂的体积质量比为1mL：(0.5～1.0)g。

7.根据权利要求6所述一种番茄生防种衣剂，其特征在于，还包括赤霉素溶液，所述赤霉素溶液由0.1g赤霉素GA₃溶解至1mL体积分数为75％的乙醇配制而成，所述复合菌剂与赤霉素溶液的体积比为1mL：2～20μL。

8.根据权利要求7所述一种番茄生防种衣剂，其特征在于，种衣剂的pH值为6～7。

9.根据权利要求8所述一种番茄生防种衣剂，其特征在于，其组分包括5mL复合菌剂、33.3μL赤霉素溶液、1.3g气相二氧化硅、0.05g十二烷基苯磺酸钠、1g阿拉伯胶、0.5g珠光粉、100μL摩尔浓度为1mol/L的HCl和15mL无菌水。

10.权利要求1-9任一所述一种番茄生防种衣剂在防治番茄猝倒病和根腐病中的应用。