CN117535178A - 一种细菌性软腐病生防复合菌及应用 - Google Patents
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- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
- A01N63/27—Pseudomonas
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01P—BIOCIDAL, PEST REPELLANT, PEST ATTRACTANT OR PLANT GROWTH REGULATORY ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR PREPARATIONS
- A01P1/00—Disinfectants; Antimicrobial compounds or mixtures thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract
本发明涉及生物防治技术领域，公开了一种细菌性软腐病生防复合菌及应用。本发明生防复合菌包括假单胞菌XD8‑1和贝莱斯芽孢杆菌SF18‑3，所述假单胞菌XD8‑1的保藏编号为CCTCC NO:M 2023737，所述贝莱斯芽孢杆菌SF18‑3的保藏编号为CCTCC NO:M 2023736。两者的发酵液境混合后对细菌性软腐病起到协同增效的防治效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物防治技术领域，具体涉及一种细菌性软腐病生防复合菌及应用。
背景技术
近年在蔬菜上由细菌引起的软腐病发生十分普遍，其中由果胶杆菌属(Pectobacterium ectobacterium)中的胡萝卜软腐果胶杆菌(P.carotovorum)引起的病害较为严重，如番茄、黄瓜、茄子、辣椒软腐病是由胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(P.carotovora subsp.carotovora)引起的细菌性病害，主要危害茎和果实，从植物生长期到果实成熟期均可发病，错误的农事易导致病害传播，发病严重地块病株率可达40％以上，品质和产量损失严重。目前细菌性软腐病的防治依然依赖于化学药剂，生产上最常用的化学农药是铜制剂，如：竹醋液复合铜、氨基酸铜、络合铜A和络合铜B。但由于常年使用与大量使用，致使抗药性产生，防治效果下降。生物防治因其安全有效、无污染成为化学农药的有效替代技术。
目前针对蔬菜细菌性软腐病的生物防治国内外专利与研究，包括芽孢杆菌、假单胞菌等在内的几类生防菌，但均为单剂使用，防效不高，稳定性差。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种细菌性软腐病生防复合菌，两种菌联合使用能够协同防治细菌性软腐病，提高防治效果。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种生防复合菌，所述生防复合菌包括假单胞菌XD8-1和贝莱斯芽孢杆菌SF18-3，所述假单胞菌XD8-1的保藏编号为CCTCC NO:M 2023737，所述贝莱斯芽孢杆菌SF18-3的保藏编号为CCTCC NO:M2023736。
本发明还包括上述生防复合菌的发酵产物，所述发酵产物优选的包括抑制细菌性软腐病的某一或某些活性成分，如蛋白酶、几丁质酶、木聚糖酶、纤维素酶、溶菌酶和乙酰辅酶A。
本发明还提供了一种生防复合菌剂，包括假单胞菌XD8-1发酵液和贝莱斯芽孢杆菌SF18-3发酵液。
优选的，所述发酵液中，假单胞菌XD8-1和贝莱斯芽孢杆菌SF18-3的浓度为1×106-1×108cfu/mL。
作为一种实施方式，所述生防复合菌剂为将所述假单胞菌XD8-1和贝莱斯芽孢杆菌SF18-3分别发酵，所得发酵液进行混合。
进一步的，制备所述假单胞菌XD8-1发酵液的发酵条件为：以NA液体培养基为底物，初始pH值为4.0-10.0、发酵时间为10-72h、温度为17-36℃、摇床转速为100-200rpm。
进一步的，制备所述贝莱斯芽孢杆菌SF18-3发酵液的发酵条件为：以NA液体培养基为底物，初始pH值为4.0-10.0、发酵时间为8-64h、温度为17-36℃、摇床转速为100-200rpm。
优选的，所述假单胞菌XD8-1发酵液和所述贝莱斯芽孢杆菌SF18-3发酵液的体积比为1-2：8-9。
本发明还提供了上述生防复合菌、上述发酵产物或上述生防复合菌剂在以下任一方面的应用：
(1)防治细菌性软腐病；
(2)抑制细菌性软腐病病原菌；
(3)制备防治细菌性软腐病或抑制细菌性软腐病病原菌产品。
作为一种实施方式，所述生防复合菌剂为原液或稀释100倍以内使用。
作为一种实施方式，所述使用方式为茎叶喷雾法，全株喷施。
作为一种实施方式，施药间隔7-10天，整个生长期施药2次。
相对于现有技术，本发明具有如下技术效果：
本发明筛选出对细菌性软腐病病原菌有抑制作用的生防菌：假单胞菌XD8-1和贝莱斯芽孢杆菌SF18-3。本发明分别将假单胞菌XD8-1粗酶液与贝莱斯芽孢杆菌SF18-3粗酶液分别进行发酵后再混合，能获得比单菌培养更多的抑菌物质，对细菌性软腐病起到协同增效的防治效果，且不会产生营养竞争作用。
生物保藏信息：
本发明假单胞菌(Pseudomonassp.)XD8-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为：2023年05月11日，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO:M 2023737。
本发明贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)SF18-3，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为：2023年05月11日，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学，保藏编号为：CCTCCNO:M 2023736。
附图说明
图1为生防菌抑菌效果(透明圈法)，其中菌碟内为致病菌Pcb BZA12，从左至右依次为生防菌XD8-1、SF18-3及XD8-1与SF18-3的联合抑菌效果；
图2为XD8-1菌株的16s rDNA序列与网上已知序列的比对结果；
图3为SF18-3菌株的16s rDNA序列与网上已知序列的比对结果；
图4为发酵时间对XD8-1抑菌效果的影响；
图5为发酵温度对XD8-1抑菌效果的影响；
图6为转速对XD8-1抑菌效果的影响；
图7为初始pH值对XD8-1抑菌效果的影响；
图8为发酵时间对SF18-3抑菌效果的影响；
图9为发酵温度对SF18-3抑菌效果的影响；
图10为转速对SF18-3抑菌效果的影响；
图11为初始pH值对SF18-3抑菌效果的影响；
图12为XD8-1和SF18-3粗酶液中酶活性测定结果；其中，蛋白酶活性、木聚糖酶、纤维素酶活性单位为U/L，几丁质酶、溶菌酶、乙酰辅酶A单位为IU/L；
图13为2：8体积比复配的XD8-1和SF18-3复合菌剂在不同稀释倍数下对Pcb BZA12生长量影响(平板计数法)；
图14为黄瓜叶片防治试验，从左至右依次为复合菌剂500×、100×、50×、10×和原液；
图15为茄子叶片防治试验，从左至右依次为复合菌剂500×、100×、50×、10×和原液；
图16为辣椒叶片防治试验，从左至右依次为复合菌剂500×、100×、50×、10×和原液；
图17为复合菌剂对黄瓜细菌性软腐病田间防治效果。
具体实施方式
本发明提供了一种细菌性软腐病生防复合菌，所述生防复合菌包括假单胞菌XD8-1和贝莱斯芽孢杆菌SF18-3，所述假单胞菌XD8-1的保藏编号为CCTCC NO:M 2023737，所述贝莱斯芽孢杆菌SF18-3的保藏编号为CCTCC NO:M 2023736。
上述生防复合菌为从辽宁省蔬菜及其他农作物主产区的植物根际土壤和腐熟动物粪肥中筛选得到。两株生防菌对细菌性软腐病病原菌均有一定抑制作用。将上述两株生防菌进行发酵，所得发酵液进行混合后，在一定配比下对细菌性软腐病能起到协同增效的防治效果。
本发明还包括上述生防复合菌的发酵产物，所述发酵产物起到防治细菌性软腐病的防治效果。分别用试剂盒法测定XD8-1与SF18-3发酵原液中蛋白酶(Protease)、几丁质酶(Chitinase)、木聚糖酶(Xylanase)、纤维素酶(CE)、溶菌酶(LYS)和乙酰辅酶A(A-CoA)水平，抑菌机理试验结果表明，XD8-1与SF18-3发酵过程中产生的蛋白酶与木聚糖酶活性是抑菌的主要物质，其次是几丁质酶与乙酰辅酶A(图12)。
本发明还提供了一种细菌性软腐病生防复合菌剂，包括上述假单胞菌XD8-1的发酵液和贝莱斯芽孢杆菌SF18-3的发酵液。
作为一种实施方式，制备所述假单胞菌XD8-1发酵液的发酵条件为：以NA液体培养基为底物，将上述假单胞菌XD8-1母液接种至NA液体培养基中。所述NA液体培养基的初始pH值为4.0-8.0，设置发酵温度为17-36℃、摇床转速为100-200rpm，发酵10-72h即得假单胞菌XD8-1发酵液。作为一种优选的实施方式，所述假单胞菌XD8-1母液的浓度为1×106-1×108cfu/mL。作为一种优选的实施方式，NA液体培养基的初始pH值为6.0-9.0，设置发酵温度为24-32℃、摇床转速为120-180rpm，发酵时间为48-64h。本领域技术人员可根据实际发酵情况调整发酵参数，使发酵液中抑菌物质积累最多，达到最好抑菌效果。优选所述假单胞菌XD8-1发酵液的浓度为1×106-1×108cfu/mL。
作为一种实施方式，制备所述贝莱斯芽孢杆菌SF18-3发酵液的发酵条件为：以NA液体培养基为底物，将上述贝莱斯芽孢杆菌SF18-3母液接种至NA液体培养基中。所述NA液体培养基的初始pH值为4.0-10.0，设置发酵温度为17-36℃、摇床转速为100-200rpm，发酵8-64h即得贝莱斯芽孢杆菌SF18-3发酵液。作为一种优选的实施方式，所述贝莱斯芽孢杆菌SF18-3母液的浓度为1×106-1×108cfu/mL。作为一种优选的实施方式，NA液体培养基的初始pH值为8.0-9.0，设置发酵温度为28-36℃、摇床转速为120-180rpm，发酵时间为48-56h。本领域技术人员可根据实际发酵情况调整发酵参数，使发酵液中抑菌物质积累最多，达到最好抑菌效果。优选所述贝莱斯芽孢杆菌SF18-3发酵液的浓度为1×106-1×108cfu/mL。
作为一种实施方式，将所述假单胞菌XD8-1和贝莱斯芽孢杆菌SF18-3分别发酵，所得发酵液进行混合，即得生防复合菌剂。优选的，所述发酵液中，假单胞菌XD8-1和贝莱斯芽孢杆菌SF18-3的浓度为1×106-1×108cfu/mL。优选所述假单胞菌XD8-1和贝莱斯芽孢杆菌SF18-3的发酵液以体积比1-2：8-9混合，对细菌性软腐病起到最大的协同增效作用。
本发明的生防复合菌、发酵产物及生防复合菌剂能够用于以下任一方面：
(1)防治细菌性软腐病；
(2)抑制细菌性软腐病病原菌；
(3)制备防治细菌性软腐病或抑制细菌性软腐病病原菌产品。
作为一种实施方式，所述细菌性软腐病包括蔬菜上的细菌性软腐病，例如黄瓜、茄子、辣椒的细菌性软腐病。
作为一种实施方式，所述细菌性软腐病病原菌包括胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(P.carotovora subsp.carotovora)。
作为一种实施方式，所述产品包括可湿性粉剂、水分散粒剂、微胶囊剂、水剂、悬浮剂、乳化剂、水乳剂等。
本发明的生防复合菌、发酵产物及生防复合菌剂适宜施药时期为在蔬菜软腐病发病前期或初期进行施药。作为一种实施方式，将所述生防复合菌剂原液或稀释100倍以内使用，如稀释5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍至100倍以及中间任意稀释倍数。推荐使用方式为茎叶喷雾法，全株喷施；推荐施药间隔7-10天，整个生长期施药2次，对细菌性软腐病有较好防效，可用于茄子、黄瓜、辣椒等蔬菜的细菌性软腐病防治。
下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
生防菌的筛选
1.致病菌及菌悬液的制备
胡萝卜软腐果胶杆菌巴西亚种Pcb BZA12菌株(Pectobacterium caroto vorumsubsp.carotovorum)，来源于辽宁省农业科学院植物保护研究所园艺作物病害研究室分离、鉴定并保存。
将纯化的Pcb BZA12菌株接种至NA平板上25℃下静置培养48h后，10000rpm/min离心后，用无菌水配制成1×107cfu/mL的菌悬液，现用现配。
2.有益微生物的分离与纯化
从辽宁省蔬菜及其他农作物主产区，如新民、法库、锦州、鞍山、葫芦岛13个等地区共采集植物根际土壤73份与4种腐熟动物粪肥。分别称取土壤/粪肥5.0g，各放入45mL含玻璃珠的无菌水中，140rpm振荡10min后静置20min，此为10-1土壤稀释液，取10-1土壤稀释液1mL加至9mL无菌水中，此为10-2稀释液，依次配制10-3、10-4、10-5、10-6、10-7系列土壤稀释液。取10-5、10-6、10-7三个梯度土壤稀释液各100μL涂布于NA培养基上，28℃培养1d；取10-4、10-5、10-6土壤稀释液各100μL分别涂布于马丁氏培养基与高氏Ⅰ号培养基，28℃培养5-7d。将平板特征表现不同的菌株进行纯化并4℃保存备用。
3.有益微生物的初筛
利用含毒介质透明圈法。将步骤1.配好的Pcb BZA12的菌悬液(1×107cfu/mL)1mL倒入晾至45℃100mL固体NA培养基中，制成含有1×106cfu/mL菌体的含毒平板，无菌条件下放置牛津杯放置平板中央，28℃培养4-5天后观察结果。最终获得2株对致病菌Pcb BZA12有抑制作用的有益微生物，分别命名为XD8-1与SF18-3(图1)。
4.生防菌形态学观察
菌株XD8-1革兰氏染色呈阴性、不产芽胞，杆状或微弯杆状。菌落前期乳白色，透明，湿润，有光泽，边缘整齐，易挑取，后期菌落分泌红褐色色素，培养基呈现红褐色；菌株SF18-3为革兰氏染色结果为阳性菌、呈杆状，有芽孢。菌落乳白色、不湿润、无光泽、不透明、有褶皱、边缘不整齐。
5.生理生化试验
菌株XD8-1甲基红阳性，V-P、过氧化酶、氧化酶、硝酸盐还原、吲哚产生均为阴性；SF18-3甲基红阳性、过氧化酶、氧化酶弱阳性，V-P、硝酸盐还原、吲哚产生均为阴性。
6.16S rDNA序列分析
利用CTAB法提取生防细菌基因组，将提取产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳，并用紫外分光光度计测定OD260/280值检测其浓度及纯度。PCR扩增使用北京鼎国昌盛2×Taq PCRMasterMix试剂盒，产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳后，利用NEP025-1切胶回收溶胶，将产物由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司测序。将获得细菌菌株的16s rDNA序列与网上已知序列比对并用BioEdit及MEGA7.0进行聚类分析。
PCR体系：Mix 12.5μL，DNA 1.0μL，引物各0.5μL，无菌蒸馏水定容到25μL。
PCR程序：94℃预变性3min，94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，30cycles，72℃延伸5min。
最终确定XD8-1为假单胞菌(Pseudomonas sp.)，SF18-3为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)(图2、3)。
利用脂肽类物质合成基因检测引物，扩增XD8-1与SF18-3功能基因。结果表明，XD8-1菌株扩增出硝吡咯菌素合成调控基因(PRNC)条带，条带清晰，共389bp，经与NCBI比对，与Pseudomonasfluorescens strainDR133(Sequence ID:CP048607.1)，同源率为98.74％。SF18-3菌株则扩增出伊枯草菌素合成酶基因(ITUA)、丰原素合成酶基因(FENB)、抗霉枯草菌素合成酶基因(.MYCB)、硝吡咯菌素合成调控基因(PRNC)和藤黄绿脓菌素合成调控基因(PLTC)。
实施例2
XD8-1粗酶液抑菌效果确定
采用含毒介质牛津杯法进行抑菌试验，优化不同发酵条件(发酵时间、温度、pH、转数)对抑菌物质产生的影响。
NA培养基：蛋白胨10.0g，牛肉粉3.0g，氯化钠5.0g。
①生防菌XD8-1母液的制备：
具体如下：XD8-1菌株接种至NA平板上25℃下静置培养48h后，无菌条件下用接种环挑取至无菌水中配制成1×107cfu/mL的母液，现用现配。
②发酵时间对XD8-1产生抑菌物质的影响
用移液器抽取XD8-1菌悬液(1x107cfu/mL)1mL接种于NA液体培养基中，140rpm 25℃分别培养8h、16h、24h、32h、40h、48h、56h、64h、72h，取不同时间处理的XD8-1发酵液注入放置于含毒介质NA平板的牛津杯内(200μL)，置于25℃恒温培养5d，测量抑菌带宽度，3次重复。
试验结果表明(图4)，XD8-1对Pcb BZA12菌株的抑菌活性物质随着培养时间的延长而提高：64h为时间拐点，8～64h抑菌率呈直线上升，抑菌带宽达1.0cm。
③发酵温度对XD8-1产生抑菌物质的影响
用移液器抽取XD8-1菌悬液(1x107cfu/mL)1mL接种于NA液体培养基中于16℃、20℃、24℃、28℃、32℃、36℃摇床中恒温培养(140rpm，pH 7)培养64h，取不同处理的XD8-1发酵液置于注入放置于含毒介质NA平板的牛津杯内(200μL)，置于25℃恒温培养5d，测量抑菌带宽度，3次重复。
温度梯度试验结果明(图5)，16℃～32℃范围内随着温度的升高，抑菌物质活性上升较快，28℃时抑菌带最宽，为1.1cm。
④摇床转速对XD8-1产生抑菌物质的影响
用移液器抽取XD8-1菌悬液(1x107cfu/mL)1mL接种于NA液体培养基中于28℃摇床中，分别选择100rpm、120rpm、140rpm、160rpm、180rpm、200rpm、恒温培养(pH 7)培养56h，取不同处理的XD8-1发酵液置于注入放置于含毒介质NA平板的牛津杯内(200μL)，置于25℃恒温培养5d，测量抑菌带宽度，3次重复。
转速梯度试验结果表明(图6)，在100rpm-200rpm之间，抑菌物质随着摇床转速的升高而增加，140rpm是抑菌带宽度的拐点，抑菌带宽1.03cm，转速高于140rpm之后抑菌带宽度变化幅度不大。
⑤初始pH值对XD8-1产生抑菌物质的影响
配制不同初始pH值2、3、4、5、6、7、8、9、10NA液体培养基，接种1mL XD8-1菌悬液(1x107cfu/mL)于28℃摇床中140rpm恒温培养5d，取不同处理的XD8-1发酵液置于注入放置于含毒介质NA平板的牛津杯内(200μL)，置于25℃恒温培养5d，测量抑菌带宽度，计算抑菌率，3次重复。
酸碱梯度试验结果表明(图7)，pH从5开始抑菌带宽度增加，直至pH 7-8时抑菌效果最好，宽度为1.0cm，之后抑菌效果急剧下降。
得到最佳抑菌效果发酵条件的最优组合为：以NA液体培养基为底物，最佳初始pH值为7.0、发酵时间为64h、温度为28℃、摇床转速为140rpm。
实施例3
SF18-3粗酶液抑菌效果确定
采用含毒介质牛津杯法进行抑菌试验，优化不同发酵条件(发酵时间、温度、pH、转数)对抑菌物质产生的影响。
NA培养基：蛋白胨10.0g，牛肉粉3.0g，氯化钠5.0g。
①生防菌SF18-3母液的制备：
具体如下：SF18-3菌株接种至NA平板上25℃下静置培养48h后，无菌条件下用接种环挑取至无菌水中配制成1×107cfu/mL的母液，现用现配。
②发酵时间对SF18-3产生抑菌物质的影响
用移液器抽取SF18-3菌悬液(1x107cfu/mL)1mL接种于NA液体培养基中，140rpm25℃分别培养8h、16h、24h、32h、40h、48h、56h、64h，取不同时间处理的SF18-3发酵液置于注入放置于含毒介质NA平板的牛津杯内(200μL)，置于25℃恒温培养5d，测量抑菌带宽度，3次重复。
试验结果表明(图8)，SF18-3对Pcb BZA12菌株的抑菌活性物质随着培养时间的延长而提高：56h为时间拐点，8h～56h抑菌活性物质呈直线上升，抑菌带宽达0.70cm；第56h后缓慢上升，抑菌效果趋于平缓。因此，试验选择第56h为最佳发酵时间。
③发酵温度对SF18-3产生抑菌物质的影响
用移液器抽取SF18-3菌悬液(1x107 cfu/mL)1mL接种于NA液体培养基中于16℃、20℃、24℃、28℃、32℃、36℃摇床中恒温培养(140rpm，pH 7)培养56h，取不同处理的SF18-3发酵液置于注入放置于含毒介质NA平板的牛津杯内(200μL)，置于25℃恒温培养5d，测量抑菌带宽度3次重复。
温度梯度试验结果明(图9)，16℃～36℃范围内随着温度的升高SF18-3抑菌物质活性上升较快，28℃时抑菌带度为0.78cm。
④摇床转速对SF18-3产生抑菌物质的影响
用移液器抽取SF18-3菌悬液(1x107 cfu/mL)1mL接种于NA液体培养基中于28℃摇床中，分别选择100rpm、120rpm、140rpm、160rpm、180rpm、200rpm、恒温培养(pH 7)培养56h，取不同处理的SF18-3发酵液置于注入放置于含毒介质NA平板的牛津杯内(200μL)，置于25℃恒温培养5d，测量抑菌带宽度，3次重复。
转速梯度试验结果表明(图10)，在100rpm-200rpm之间，抑菌活性物质随着摇床转速的升高而增加，140rpm是抑菌带宽度的拐点，抑菌带宽1.03cm，转速高于140rpm之后抑菌带宽度变化幅度不大。
⑤初始pH值对SF18-3产生抑菌物质的影响
配制不同初始pH值2、3、4、5、6、7、8、9、10NA液体培养基，接种1mL SF18-3菌悬液(1x107 cfu/mL)于28℃摇床中140rpm恒温培养5d，取不同处理的SF18-3发酵液置于注入放置于含毒介质NA平板的牛津杯内(200μL)，置于25℃恒温培养5d，测量抑菌带宽度，3次重复。
酸碱梯度试验结果表明(图11)，pH从5开始抑菌带宽度增加，直至pH 8时抑菌效果最好，宽度为0.75cm，之后抑菌效果急剧下降。
得到最佳抑菌效果发酵条件的最优组合为：以NA液体培养基为底物，最佳初始pH值为8.0、发酵时间为56h、温度为28℃、摇床转速为140rpm。
实施例4
XD8-1与SF18-3联合抑菌效果
①XD8-1粗酶液的制备：将实施例2中的XD8-1母液接种于NA液体培养基中(初始pH值为7.0)28℃于恒温摇床140rpm培养64h，菌体浓度达1×1010cfu/mL，即为XD8-1粗酶液原液。
②SF18-3粗酶液的制备：将实施例3中的SF18-3母液接种于NA液体培养基中(初始pH值为8.0)28℃于恒温摇床140rpm培养56h，菌体浓度达1×1010cfu/mL，即为SF18-3粗酶液原液。
③致病Pcb BZA12菌悬液的制备：将纯化的Pcb BZA12菌株接种至NA平板上28℃下静置培养48h后，刮取菌体放入无菌水中，配制成1×107cfu/mL的菌悬液，现用现配。
④XD8-1 EC50的测定
防治效果采用平板菌落计数法。将上述制好的XD8-1粗酶液用无菌水配置成1×1010cfu/mL、5×109cfu/mL、1×109cfu/mL、5×108cfu/mL、1×108cfu/mL、5×107cfu/mL、1×107cfu/mL酶液，现配现用。
分别吸取上述不同浓度的XD8-1酶液5mL加入至晾至45℃的45mL含有Pcb BZA12菌悬液(终浓度为1×106cfu/mL)NA培养基中倒平板(50mL倒3个平板)，此时XD8-1浓度分别为1×109cfu/mL(1×原液)、5×108cfu/mL(2×)、1×108cfu/mL(10×)、5×107cfu/mL(20×)、1×107cfu/mL(100×)、5×106cfu/mL(200×)、1×106cfu/mL(1000×)，28℃下静置培养72h后，调查菌落数。计算XD8-1不同浓度下病菌菌落的抑制率(公式1)，并转为抑制率几率值，以XD8-1浓度对数为横坐标，以抑制率几率值为纵坐标，利用Excel数据处理系统求出毒力回归方程、相关系数和EC50值。
⑤SF18-3 EC50的测定
防治效果采用平板菌落计数法。具体的测定方法同④XD8-1 EC50的测定。
⑥XD8-1与SF18-3不同配比联合抑菌效果
防治效果采用平板菌落计数法。将XD8-1粗酶液与SF18-3粗酶液分别进行不同比例进行混合(体积比)：1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1。具体为：1:9即为1mL的XD8-1粗酶液与9mL SF18-3粗酶液混合均匀，其余比例依次类推，分别制成不同配比的混合液。
无菌条件下吸取不同配比的混合液5mL加入至事先制好的45mL含有Pcb BZA12菌悬液(终浓度为1×106cfu/mL)的NA培养基中倒平板(50mL倒3个平板)，28℃下静置培养72h后，调查菌落数。按照公式(1)计算混剂的实测EC50，并根据公式(2)计算混剂的理论EC50，根据公式(3)计算增效指数R，根据公式(4)计算共毒系数。
公式(1)：抑制率(％)＝(空白对照菌落数-处理菌落数)/空白对照菌落数×100
公式(2)：EC50理论值＝(a+b)/[(a/EC50A)+(b/EC50B)]
公式(3)：R＝EC50理论值/EC50实测值
公式(4)：共毒系数CTC＝(A含量比率/EC50A+B含量比率/EC50B)/混剂EC50理论值×100
其中，A、B分别代表SF18-3和XD8-1，a、b分别代表表SF18-3和XD8-1在混剂中含量的比率；当R≤0.5时，表示拮抗作用；当R≥1.5时，表示增效作用；当R＝0.5-1.5时，表示加和作用；当CTC<80为拮抗作用，80≤CTC≤120为相加作用，CTC＞120为协同增效作用。
表1 XD8-1与SF18-3不同浓度梯度抑菌效果
表2 XD8-1与SF18-3的联合抑菌效果
结果表明，SF18-3与XD8-1粗酶液以体积比8:2与体积比9:1比例混合具有增效作用，其中体积比8:2共毒系数为172.8919，增效指数为1.7289，增效明显。
实施例5
XD8-1与SF18-3复合菌剂对黄瓜、茄子、辣椒叶片防治效果评价
致病菌Pcb BZA12菌悬液的制备：将纯化的Pcb BZA12菌株接种至NA平板上25℃下静置培养72h后，10000rpm/min离心后，用无菌水配制成1×109cfu/mL的菌悬液，现用现配。
XD8-1与SF18-3复合菌剂原液的制备：取20mL XD8-1粗酶液原液与80mL SF18-3粗酶液原液混合均匀，即为试验用复合菌剂(1×109cfu/mL)，现用现配。
使用剂量：使用时用无菌水分别稀释至10倍(1×108cfu/mL)、50倍(2×107cfu/mL)、100倍(1×107cfu/mL)、500倍(2×106cfu/mL)、1000倍(1×106cfu/mL)进行离体防治效果验证性试验。
接种方法：首先将XD8-1与SF18-3复合菌剂原液、10倍、50倍、100倍、500倍、1000倍稀释液喷至健康的黄瓜、茄子、辣椒叶片上，翌日(24h)后将致病菌Pcb BZA12菌悬液(1×107cfu/mL)以针刺点滴注射的方法接种到处理过的黄瓜、茄子和辣椒的叶片上。同时，以清水替代XD8-1与SF18-3复合菌剂作为空白对照(CK)，每处理3次重复。
结果观察：于接种致病菌Pcb BZA1248小时后观察接菌结果。清水对照在致病菌接种48h后已经引起寄主植物产生软腐病症状，喷施生防复合菌剂原液、10倍液、50倍液的黄瓜叶片尚未发病；100倍液处理的黄瓜叶片稍有褪绿；500倍液处理的则褪绿现象明显、具有水侵状(图14)；喷施生防复合菌剂原液、10倍液、50倍液的茄子叶片尚未发病；100倍液处理的茄子叶片稍有褪绿；500倍液处理的则褪绿现象明显(图15)；喷施生防复合菌剂原液、10倍液、50倍液的辣椒叶片尚未发病，100倍液处理的辣椒叶片稍有褪绿，500倍液处理的则褪绿现象明显(图16)。故选择100倍液作为田间使用浓度。
实施例6
XD8-1与SF18-3复合菌剂田间防效评价
1.试验用菌剂的制备：将实施例2和实施例3中获得的XD8-1母液与SF18-3母液加入至NA液体培养基中(无琼脂)，每150mL/250mL三角瓶接入1mL母液，分别用最佳发酵条件进行发酵，获得粗酶液(1×109cfu/mL)。将两种粗酶液按照XD8-1:SF18-3＝2:8体积混合，即为复合菌剂原液。
2.田间防治试验
田间防治效果试验针对黄瓜叶部危害开展，采用生防菌叶面喷雾、致病菌人工接种的方法进行(图17)。
盆栽试验于辽宁省农业科学院连栋温室内进行，设9个处理，分别为复合菌剂原液，10倍稀释液(1×108cfu/mL)，50倍稀释液(2×107cfu/mL)、100倍稀释液(1×107cfu/mL)、500倍(2×106cfu/mL)、1000倍(1×106cfu/mL)、2％春雷霉素可湿性粉剂100-150克/亩(山西新源华康化工股份有限公司)、20％噻菌铜悬浮剂75-100克/亩(浙江龙湾化工有限公司)，只接种病原菌的处理为空白对照，每处理为20株苗，4次重复，采用生防菌叶面喷雾、致病菌人工接种的方法进行。翌日针刺接种致病菌Pcb BZA12菌悬液(1×107cfu/mL)，接种后正常管理；7天后第2次喷施生防复合菌剂，置于25℃培养室内培养，14天后进行防治效果调查。
3.分级方法与数据统计分析
第2次喷施生防复合菌剂后第7天观察黄瓜叶片发病情况，每天记录病级数，分级标准参照《GB/T 17980.110-2004农药田间药效试验准则(二)第110部分：杀菌剂防治黄瓜细菌性角斑病》，利用SPSS22.4软件，利用Duncan’s新复极差法对试验数据进行统计分析及检测。
分级方法如下：
0级:无病斑
1级:病斑面积占整个叶面积的5％以下；
3级:病斑面积占整个叶面积的6％-10％；
5级:病斑面积占整个叶面积的11％-20％:
7级:病斑面积占整个叶面积的21％-50％；
9级:病斑面积占整个叶面积的51％。
病情指数＝[∑(各级病叶数×相对级数值)/(调查总叶数×9)]×100表3生防复合菌剂对黄瓜细菌性软腐病防治效果
结果表明：在F＝0.05水平，复合菌剂发酵原液、复合菌剂10倍稀释液、50倍液与生防对照药剂2％春雷霉素可湿性粉剂125克/亩对细菌性软腐病防治效果无显著性差异，复合菌剂发酵原液、复合菌剂10倍稀释液与化学农药对照药剂20％噻菌铜悬浮剂87.5克/亩对黄瓜细菌性软腐病的防治效果无显著差异；复合菌剂发酵稀释液100×与稀释稀释液50×对黄瓜细菌性软腐病的防治效果无显著差异，但防效大于70％，因此剂量可以选择复合菌剂发酵稀释液100×以内。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种生防复合菌，其特征在于，所述生防复合菌包括假单胞菌XD8-1和贝莱斯芽孢杆菌SF18-3，所述假单胞菌XD8-1的保藏编号为CCTCC NO:M 2023737，所述贝莱斯芽孢杆菌SF18-3的保藏编号为CCTCC NO:M2023736。
2.权利要求1所述生防复合菌的发酵产物。
3.一种生防复合菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述假单胞菌XD8-1的发酵液和所述贝莱斯芽孢杆菌SF18-3的发酵液。
4.根据权利要求3所述的生防复合菌剂，其特征在于，所述发酵液中，假单胞菌XD8-1和贝莱斯芽孢杆菌SF18-3的浓度为1×106-1×108cfu/mL。
5.根据权利要求3或4所述的生防复合菌剂，其特征在于，制备所述假单胞菌XD8-1发酵液的发酵条件为：以NA液体培养基为底物，初始pH值为4.0-10.0、发酵时间为10-72h、温度为17-36℃、摇床转速为100-200rpm。
6.根据权利要求3或4所述的生防复合菌剂，其特征在于，制备所述贝莱斯芽孢杆菌SF18-3发酵液的发酵条件为：以NA液体培养基为底物，初始pH值为4.0-10.0、发酵时间为8-64h、温度为17-36℃、摇床转速为100-200rpm。
7.根据权利要求3或4所述的生防复合菌剂，其特征在于，所述假单胞菌XD8-1发酵液和所述贝莱斯芽孢杆菌SF18-3发酵液的体积比为1-2：8-9。
8.权利要求1所述生防复合菌，或权利要求2所述的发酵产物，或权利要求3-7任意一项所述的生防复合菌剂在以下任一方面的应用：
(1)防治细菌性软腐病；
(2)抑制细菌性软腐病病原菌；
(3)制备防治细菌性软腐病或抑制细菌性软腐病病原菌产品。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述生防复合菌剂为原液或稀释100倍以内使用。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述使用方式为茎叶喷雾法，全株喷施。
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