CN105624047A - 一种薏苡内生真菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种薏苡内生真菌，它是从禾本科薏苡属植物薏苡(Coix？lacryma-jobi？L.var.mayuen(Roman.)Stapf)植物活体中采用内生真菌分离纯化技术分离获得的，经微生物分类学鉴定为香柱菌属Epichloe？bromicola。该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC？No.11410。本发明通过薏苡内生真菌菌株与薏苡和拟南芥共培养，促进了薏苡和拟南芥的生长，抑制主根长促进侧根的发育，更利于植物摄取养分和生长，且提高了拟南芥的生物量，是促进薏苡、拟南芥及其他禾本科植物生长的重要微生物。

Description

一种薏苡内生真菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别涉及薏苡内生真菌及其在促进拟南芥或薏苡生长中的应用。

背景技术

薏苡(Coixlacryma-jobiL.var.mayuen.(Roman.)Stapf)属于禾本科(Gramineae)，薏苡属(CoixL.)植物，为中国药典收载品种。营养价值极高，具有多种保健功效，是世界范围内倍爱亲睐的药食两用作物资源。薏苡是常用的中药，有利尿、健脾、补肺、祛湿热、消水肿、排脓、止泻等功效。现代研究证明薏苡具有抗肿瘤、增强免疫力和抗炎作用。对薏苡的研究集中在对其化学成分、药理活性、提取工艺和临床应用等方面。目前，薏苡的生长主要依靠外源激素和化学肥料及土壤养分来维持，很大程度上限制了薏苡的生长周期和质量。虽然薏苡资源区域广阔，且已进行大量的人工栽培；但是其分布星散，资源更新周期长，且人工栽培技术要求高，药材质量参差各异。随着薏苡众多药理活性的发现，其市场需求增大，通过直接采收薏苡天然和人工资源将不能满足中药材市场的需求。另一方面，通过施肥和化学试剂促进薏苡的生长也会影响薏苡的药材质量，同时影响薏苡的临床疗效。因此，为薏苡人工种植添施内生真菌菌肥提供理论依据和技术支持已成为人们关注的课题。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种新的薏苡内生真菌。

本发明的再一的目的是，提供一种菌剂。

本发明的另一的目的是，提供如上所述薏苡内生真菌的用途。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

一种薏苡内生真菌，命名为香柱菌属E.bromicola。所述的薏苡内生真菌是从禾本科薏苡属植物薏苡(Coixlacryma-jobiL.var.mayuen(Roman.)Stapf)植物活体中采用内生真菌分离纯化技术分离获得的，经微生物分类学鉴定为香柱菌属E.bromicola。该菌株已保藏，保藏日期为2015年11月27日，保藏号为CGMCCNo.11410，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。

所述薏苡内生真菌显微形态为：在显微镜下可观察到大量成熟的分生孢子，分生孢子椭圆形或肾形，单个顶生，分生孢子及孢子梗无色透明，孢子梗顶端变尖，基部无隔膜；所述薏苡内生真菌在PDA培养基上25℃培养，3周后，得到细小的白色菌落，菌落直径10-20mm，菌落正面白色，棉质，质地紧密，边缘平整，中央隆起或稍有皱褶，背面黄色至深褐色，从中央到周围颜色逐渐变浅。

所述薏苡内生真菌的tef1基因序列如SEQIDNO.1所示，所述薏苡内生真菌的tub2基因序列如SEQIDNO.2所示。

本发明所述的薏苡内生真菌的共培养特征为：

(1)所述薏苡内生真菌与薏苡共培养的特征：内生真菌固体菌种培养基：麦麸250g，棉籽壳250g，葡萄糖20g，KH₂PO₄3g，MgSO_4·7H₂O1.5g，1L去离子水；内生真菌与薏苡共培养盆栽土基质：腐殖土：蛙石＝3：l；每日光照培养16h，光照度2000Ix，温度25±1℃；薏苡内生真菌与薏苡组培苗共培养120d后收获植株，测定薏苡组培苗的各项生长指标，包括株高、鲜重和干重，结果表明，在同样生长条件及采收后处理条件下，和对照组相比，薏苡内生真菌处理组的薏苡组培苗的各项生长指标均具有显著性差异，处理组的株高是对照组的108.89％，全株的鲜重和干重分别达到对照组的118.71％和166.55％；

(2)所述薏苡内生真菌与拟南芥共培养特征：培养基1/2MS，光照培养9-15d，每日光照16h，光照度2000Ix，温度25±1℃；培养第9d拟南芥有大量须根出现；培养第10d，须根迅速增多且叶片变大，薏苡内生真菌处理组的侧根数是对照组的10.30倍；培养第15d，须根伸长、加粗，叶片肥大变绿，开花；此时薏苡内生真菌处理组的主根长是对照组的83.14％，处理组的叶片数、苗高、鲜重和开花率分别是对照组的1.14、4.29、1.55和5.25倍。

本发明所述的薏苡内生真菌分离纯化方法如下：

(1)冲洗采集到的新鲜薏苡叶、茎、种仁，除去表面的泥土和灰尘后，用去离子水洗3次；

(2)按以下程序进行表面消毒：75％乙醇浸泡30s；1％次氯酸钠浸泡5min；75％乙醇浸泡30s；无菌去离子水洗3次；

(3)吸干残留水分，将叶、茎切成0.5cm×0.5cm的组织块，种仁切成0.1cm×0.1cm的组织块，

(4)分别从3个部位中各随机挑取8个组织块，每4个组织块为一组放在加有青霉素(50mg/L)的PDA培养基的培养皿中。培养皿用封口膜(Pechiney,Chicago,IL)密封后，于26±2℃培养7-14d，待菌落从组织块周围长出后，挑取菌丝尖端转移到新的PDA培养基上纯化培养，并按形态合并，既得。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

一种菌剂，它的活性成分可以为如上任一所述的薏苡内生真菌。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：

如上任一所述薏苡内生真菌在促进拟南芥或薏苡生长中的应用。

其工艺步骤如下：

菌种活化→固体菌种的制备→薏苡组培苗的培养→菌苗共培养→统计薏苡组培苗的形态指标；

菌种活化→拟南芥苗的培育→菌苗共培养→统计拟南芥无菌苗的形态指标。

其中培养基原料为马铃薯培养基(PDA)、1/2MS和MS培养基，培养方式为菌块与拟南芥共培养，固体菌种与薏苡组培苗共培养；菌种活化采用培养皿固体培养基，培养基为PDA；拟南芥种子培养为1/2MS培养基；拟南芥与E.Bromicola共培养培养基为1/2MS培养基；诱导薏苡种子形成愈伤组织为诱导愈伤培养基(MS+3％蔗糖+500mg/LCH(水解酪蛋白)+2mg/L2，4-D)；培养薏苡诱导丛生芽为诱导丛生芽培养基(MS+0.1mg/LNAA(萘乙酸)+0.5mg/L6-BA(6-苄基嘌呤))；薏苡组培苗的继代培养为MS培养基。培养时间：菌种活化1-4周，拟南芥种子先春化48h，再在室温下培育4d，薏苡组培苗从组培瓶中移栽至已灭菌的盆栽土基质中进行炼苗1周，薏苡内生真菌与薏苡、拟南芥的共培养均每天光照16h，光照强度为2000Ix。培养温度：拟南芥种子春化培养为4℃，拟南芥种子春化后培育和与薏苡内生真菌共培养为25±1℃，苡内生真菌与薏苡共培养为25±1℃。形态指标测定：拟南芥与E.Bromicola共培养第9d，统计拟南芥无菌苗的侧根数；共培养第15d收获植株，统计接菌后的拟南芥无菌苗的生长指标：叶片数、苗高、鲜重、开花率和主根长；薏苡与E.Bromicola固体菌种共培养120d，测定薏苡组培苗的各项生长指标，包括株高、鲜重和干重。

所述薏苡内生真菌促进薏苡生长包括下列步骤：

(1)配置固体菌种培养基：麦麸250g、棉籽壳250g、葡萄糖20g、KH₂PO₄3g、MgSO_4·7H₂O1.5g、1L去离子水，121℃高压灭菌2h；将已基本长满PDA培养皿的目标菌种E.bromicola用接种针划成1×1cm小方块，接种到固体菌种培养基表面上，培养2周至菌丝长满表面，得固体菌种；

(2)将薏苡种子放入75％酒精中浸泡并猛晃3min，转入2.5％NaClO浸泡15min，重复一次，每隔5min猛摇一次，用无菌水冲洗3-4次，用无菌水浸泡40min，最后用无菌水冲洗种子10遍；灭菌薏苡种子后，将种子放置在不附加任何激素的MS培养基上无菌培养，产生无菌苗；待无菌苗长至4-5cm高时，取无菌苗的幼叶及根将其切成2-3cm长的切断，将切段接种到诱导愈伤培养基进行初代培养，诱导形成愈伤组织，然后将愈伤组织转入诱导丛生芽培养基中培养诱导丛生芽，待丛生芽长至3cm左右，转入MS培养基中培养分化出不定根，得组培苗，将得到的组培苗接种于MS培养基中进行继代培养；

(3)配置盆栽土基质：腐殖土：蛙石＝3：l；将薏苡组培苗移栽至已灭菌的盆栽土基质中进行炼苗1周，待其生长稳定后，将组培苗进行移栽，在薏苡组培苗根部接触基质的地方均匀撒20g固体菌种，用灭菌的盆栽土基质将薏苡组培苗根部埋好，用无菌水将植株浇透，每盆种1株薏苡组培苗，将花盆移入温室，前1周用保鲜膜拱膜保湿，7d后移去；培养120d。

所述薏苡内生真菌促进拟南芥生长包括下列步骤：

(1)取薏苡内生真菌菌种，在无菌条件下，用接种针挑取少量菌丝，接入已灭菌的固体PDA培养基，于25±1℃活化培养1-4周；

(2)将拟南芥野生型种子置于已消毒的1.5mLeppendorf管中，加入75％乙醇消毒5min，再用无菌枪头吸取无菌去离子水反复冲洗拟南芥种子3-5遍，将种子转至无菌滤纸上吸干水分，在每个培养皿的底部宽度约7cm线处，每个培养皿划线处均匀接种6粒拟南芥种子，接种完毕后，将培养皿放入4℃冰箱低温处理，48h后取出，将其竖立放置于恒温培养室中培养，4d后拟南芥种子萌发(两片子叶长出)；

(3)待拟南芥种子萌发后4d，拟南芥苗长基本长势一致，分别将培养皿内的内生真菌E.bromicola用接种针划成1×1cm左右大小的菌块，接种至共培养基中和拟南芥无菌苗共培养，菌块接种位置距离拟南芥根尖3cm处，每个培养皿中接种1个菌块；

(4)共培养第9d，统计拟南芥无菌苗的侧根数；共培养第15d收获植株，统计接菌后的拟南芥无菌苗的生长指标：叶片数、苗高、鲜重、开花率和主根长。

本发明优点在于：

本发明所述的薏苡内生真菌，通过菌株促进植物生长，是寻找促进拟南芥和薏苡生长新资源的重要微生物，具有较大的应用价值。

生物材料样品的保藏信息：

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2015年10月28日

保藏编号：CGMCCNo.11410

分类命名：Epichloebromicola。

附图说明

附图1为本发明的薏苡内生真菌在PDA培养基上的形态图。

附图2为本发明的薏苡组培苗和E.Bromicola共培养的过程。

附图3为本发明的薏苡内生真菌与拟南芥无菌苗共培养15d后对照组(A)与处理组(B)的对比图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

本发明的薏苡内生真菌为浙江泰顺栽培的薏苡根中得到的菌株。本发明的薏苡内生真菌按以下步骤分离获得：自来水冲洗采集到的新鲜薏苡叶、茎、种仁，除去表面的泥土和灰尘后，用去离子水洗3次。用无菌滤纸吸干表面水分，按以下程序进行表面消毒：75％乙醇，30s→1％次氯酸钠，5min→75％乙醇，30s→无菌去离子水洗3次。无菌滤纸吸干残留水分后，用消毒后的医用剪刀或枝剪分别将叶、茎、种仁切成小的组织块(茎、叶约0.5cm×0.5cm，种仁约0.1cm×0.1cm)，分别从3个部位中各随机挑取8个组织块，每4个组织块为一组放在加有青霉素(50mg/L)的PDA(马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，蒸馏水1L，自然pH)培养基的培养皿中。培养皿用封口膜(Pechiney,Chicago,IL)密封后，于26±2℃培养7-14d，观察内生真菌菌落生长情况。待菌落从组织块周围长出后，挑取菌丝尖端转移到新的PDA培养基上纯化培养，并按形态合并，最终得到本发明的薏苡内生真菌菌株。

实施例2

(1)取薏苡内生真菌菌种，在无菌条件下，用接种针挑取少量菌丝，接入已灭菌的固体PDA培养基试管，于25±1℃活化培养1-4周。薏苡内生真菌(第18天)在PDA培养基上的形态如图1所示；

(2)将麦麸与棉籽壳按质量比为1：1混合均匀，按料水比为1：2加入已配好的营养液中搅匀，121℃高压灭菌2h，将已基本长满PDA培养皿的目标菌种E.bromicola用接种针划成小方块(1×1cm)，接种到固体菌种培养基表面上，培养2周至菌丝长满表面，即得固体菌种；

如图1所示，本发明所述的薏苡内生真菌在固体PDA培养基上25℃培养，3周后，得到细小的白色菌落。菌落直径10-20mm，菌落正面白色，棉质，质地紧密，边缘平整，中央隆起或稍有皱褶，背面黄色至深褐色，从中央到周围颜色逐渐变浅。

实施例3

(1)将薏苡种子放入75％酒精中浸泡并猛晃3min，转入2.5％的NaClO浸泡15min，重复一次，每隔5min猛摇一次，用无菌水冲洗3-4次，用无菌水浸泡40min，最后用无菌水冲洗种子10遍。灭菌薏苡种子后，将种子放置在不附加任何激素的MS培养基上无菌培养，产生无菌苗(如图2-a所示)。待无菌苗长至4-5cm高时(如图2-b)，取无菌苗的幼叶及根将其切成2-3cm长的切断，将切断接种到诱导愈伤培养基(MS+3％蔗糖+500mg/LCH(水解酪蛋白)+2mg/L2，4-D)进行初代培养，诱导形成愈伤组织(如图2-c)。然后将愈伤组织转入诱导丛生芽培养基(MS+0.1mg/LNAA+0.5mg/L6-BA)中培养诱导丛生芽(如图2-d)，待丛生芽长至3cm左右，转入MS培养基中培养分化出不定根，即可得组培苗。再将得到的组培苗接种于MS培养基中进行继代培养(如图2-e)；

(2)将长势基本一致的薏苡组培苗(高度5cm左右)从组培瓶中移栽至已灭菌的盆栽土基质中进行炼苗1周(如图2-f)，待其生长稳定后，将组培苗进行再次移栽，在薏苡组培苗根部接触基质的地方均匀撒20g固体菌种，对照组撒20g不加菌的固体菌种培养基。用灭菌的盆栽土基质将薏苡组培苗根部埋好，用无菌水将植株浇透，每盆种1株薏苡组培苗。将花盆移入温室，前1周用保鲜膜拱膜保湿，7d后移去(如图2-g)；

(3)共培养120d后(如图2-h)，统计薏苡组培苗的各项生长指标，包括株高、鲜重和干重。

(4)结果表明，和对照组相比，E.bromicola处理组的薏苡组培苗的各项生长指标均具有显著性差异。处理组的株高是对照组的108.89％，全株的鲜重和干重分别达到对照组的118.71％和166.55％。

实施例4

(1)将拟南芥野生型种子置于已消毒的1.5mLeppendorf管中，加入75％乙醇消毒5min，再用无菌枪头吸取无菌去离子水反复吹洗拟南芥种子3-5遍，消毒后的种子转至无菌滤纸上吸干水分，在每个培养皿的底部宽度约7cm处划一条横线，用消毒牙签将种子挑至划线处，每个培养皿划线处均匀接种6粒拟南芥种子，接种完毕后，将培养皿放入4℃冰箱低温处理，48h后取出，将其竖立放置于恒温培养室中培养，4d后拟南芥种子萌发(两片子叶长出)；

(2)待拟南芥种子萌发(两片子叶长出)后4d，拟南芥苗长基本长势一致，分别将培养皿内的内生真菌E.bromicola用接种针划成1×1cm左右大小的菌块，接种至共培养基中和拟南芥无菌苗共培养(菌块接种位置距离拟南芥根尖3cm处)，每个培养皿中接种1个菌块；

(3)共培养第9d，统计拟南芥无菌苗的侧根数；共培养第15d收获植株，统计接菌后的拟南芥无菌苗的生长指标：叶片数、苗高、鲜重、开花率和主根长。

(4)通过无菌对照组和E.bromicola处理组的对比试验，结果表明，E.bromicola能促进拟南芥生长，共培养第9d，处理组的根数是对照组的10.30倍；共培养第15d，处理组的叶片数、苗高、鲜重和开花率分别是对照组的1.14、4.29、1.55和5.25倍，且处理组的主根长是对照组的83.14％。如图3所示，内生真菌E.bromicola能显著促进拟南芥的生长。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种薏苡内生真菌，其特征在于，它的命名为香柱菌属E.bromicola，保藏登记号为CGMCCNo.11410。

2.根据权利要求1所述的薏苡内生真菌，其特征在于，所述薏苡内生真菌显微形态为：在显微镜下可观察到大量成熟的分生孢子，分生孢子椭圆形或肾形，单个顶生，分生孢子及孢子梗无色透明，孢子梗顶端变尖，基部无隔膜；所述薏苡内生真菌在PDA培养基上25℃培养，3周后，得到细小的白色菌落，菌落直径10-20mm，菌落正面白色，棉质，质地紧密，边缘平整，中央隆起或稍有皱褶，背面黄色至深褐色，从中央到周围颜色逐渐变浅。

3.根据权利要求1所述的薏苡内生真菌，其特征在于，所述薏苡内生真菌的tef1基因序列如SEQIDNO.1所示，所述薏苡内生真菌的tub2基因序列如SEQIDNO.2所示。

4.根据权利要求1所述的薏苡内生真菌，其特征在于，

(1)所述薏苡内生真菌与薏苡共培养的特征：内生真菌固体菌种培养基：麦麸250g，棉籽壳250g，葡萄糖20g，KH₂PO₄3g，MgSO₄·7H₂O1.5g，1L去离子水；内生真菌与薏苡共培养盆栽土基质：腐殖土：蛙石＝3：l；每日光照培养16h，光照度2000Ix，温度25±1℃；薏苡内生真菌与薏苡组培苗共培养120d后收获植株，测定薏苡组培苗的各项生长指标，包括株高、鲜重和干重，结果表明，在同样生长条件及采收后处理条件下，和对照组相比，薏苡内生真菌处理组的薏苡组培苗的各项生长指标均具有显著性差异，处理组的株高是对照组的108.89％，全株的鲜重和干重分别达到对照组的118.71％和166.55％；

(2)所述薏苡内生真菌与拟南芥共培养特征：培养基1/2MS，光照培养9-15d，每日光照16h，光照度2000Ix，温度25±1℃；培养第9d拟南芥有大量须根出现；培养第10d，须根迅速增多且叶片变大，薏苡内生真菌处理组的侧根数是对照组的10.30倍；培养第15d，须根伸长、加粗，叶片肥大变绿，开花；此时薏苡内生真菌处理组的主根长是对照组的83.14％，处理组的叶片数、苗高、鲜重和开花率分别是对照组的1.14、4.29、1.55和5.25倍。

5.根据权利要求1所述的薏苡内生真菌，其特征在于：所述薏苡内生真菌分离纯化方法如下：

(1)冲洗采集到的新鲜薏苡叶、茎、种仁，除去表面的泥土和灰尘后，用去离子水洗3次；

(2)按以下程序进行表面消毒：75％乙醇浸泡30s；1％次氯酸钠浸泡5min；75％乙醇浸泡30s；无菌去离子水洗3次；

(3)吸干残留水分，将叶、茎切成0.5cm×0.5cm的组织块，种仁切成0.1cm×0.1cm的组织块，

(4)分别从3个部位中各随机挑取8个组织块，每4个组织块为一组放在加有青霉素(50mg/L)的PDA培养基的培养皿中。培养皿用封口膜(Pechiney,Chicago,IL)密封后，于26±2℃培养7-14d，待菌落从组织块周围长出后，挑取菌丝尖端转移到新的PDA培养基上纯化培养，并按形态合并，既得。

6.一种菌剂，它的活性成分为权利要求1-4任一所述的薏苡内生真菌。

7.权利要求1-4任一所述薏苡内生真菌在促进拟南芥或薏苡生长中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，薏苡内生真菌促进薏苡生长包括下列步骤：

(1)配置固体菌种培养基：麦麸250g、棉籽壳250g、葡萄糖20g、KH₂PO₄3g、MgSO₄·7H₂O1.5g、1L去离子水，121℃高压灭菌2h；将已基本长满PDA培养皿的目标菌种E.bromicola用接种针划成1×1cm小方块，接种到固体菌种培养基表面上，培养2周至菌丝长满表面，得固体菌种；

(2)将薏苡种子放入75％酒精中浸泡并猛晃3min，转入2.5％NaClO浸泡15min，重复一次，每隔5min猛摇一次，用无菌水冲洗3-4次，用无菌水浸泡40min，最后用无菌水冲洗种子10遍；灭菌薏苡种子后，将种子放置在不附加任何激素的MS培养基上无菌培养，产生无菌苗；待无菌苗长至4-5cm高时，取无菌苗的幼叶及根将其切成2-3cm长的切断，将切段接种到诱导愈伤培养基进行初代培养，诱导形成愈伤组织，然后将愈伤组织转入诱导丛生芽培养基中培养诱导丛生芽，待丛生芽长至3cm左右，转入MS培养基中培养分化出不定根，得组培苗，将得到的组培苗接种于MS培养基中进行继代培养；

(3)配置盆栽土基质：腐殖土：蛙石＝3：l；将薏苡组培苗移栽至已灭菌的盆栽土基质中进行炼苗1周，待其生长稳定后，将组培苗进行移栽，在薏苡组培苗根部接触基质的地方均匀撒20g固体菌种，用灭菌的盆栽土基质将薏苡组培苗根部埋好，用无菌水将植株浇透，每盆种1株薏苡组培苗，将花盆移入温室，前1周用保鲜膜拱膜保湿，7d后移去；培养120d。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，薏苡内生真菌促进拟南芥生长包括下列步骤：

(1)取薏苡内生真菌菌种，在无菌条件下，用接种针挑取少量菌丝，接入已灭菌的固体PDA培养基，于25±1℃活化培养1-4周；

(2)将拟南芥野生型种子置于已消毒的1.5mLeppendorf管中，加入75％乙醇消毒5min，再用无菌枪头吸取无菌去离子水反复冲洗拟南芥种子3-5遍，将种子转至无菌滤纸上吸干水分，在每个培养皿的底部宽度约7cm线处，每个培养皿划线处均匀接种6粒拟南芥种子，接种完毕后，将培养皿放入4℃冰箱低温处理，48h后取出，将其竖立放置于恒温培养室中培养，4d后拟南芥种子萌发(两片子叶长出)；

(3)待拟南芥种子萌发后4d，拟南芥苗长基本长势一致，分别将培养皿内的内生真菌E.bromicola用接种针划成1×1cm左右大小的菌块，接种至共培养基中和拟南芥无菌苗共培养，菌块接种位置距离拟南芥根尖3cm处，每个培养皿中接种1个菌块；

(4)共培养第9d，统计拟南芥无菌苗的侧根数；共培养第15d收获植株，统计接菌后的拟南芥无菌苗的生长指标：叶片数、苗高、鲜重、开花率和主根长。