CN101338290B - 一种培养兰花的方法及其专用菌株 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种培育兰科植物的方法及其专用菌株。本发明菌株名称为GDB181，保藏编号为CGMCC No.2574。本发明方法包括将本发明菌株与所述兰科植物根共培养的步骤。本发明菌株适合于兰花菌根化培养，是与兰花建立有效共生的优良菌根真菌菌株。本发明培养兰花的方法，能很好的控制接种量，并能固定接种位置，充分保证了兰花组培苗与优良菌根真菌建立共生关系，同时还简化了接种步骤，减少了接种次数，接种一次就可达到一劳永逸，避免了人为多次接种造成的死苗现象，从而提高了移栽的成活率，得到了生长旺盛健壮的菌根化兰花苗。因此，本发明菌株、菌培养基、兰花培养基质及兰花培养方法具有重要的经济价值，适合于推广应用。

Description

一种培养兰花的方法及其专用菌株

技术领域

本发明涉及一种培养兰花的方法及其专用菌株。

背景技术

兰科植物是植物界最大的类群之一，广泛分布于温带、亚热带及热带区域，其中多数种是名贵药用植物和著名的观赏花卉。兰花集观赏和药用于一身，不仅拥有广大爱好者，而且还成为中国传统文化的一个重要组成部分——兰花文化。

兰科植物是典型的内生菌根植物，通过与其共生的菌根真菌菌丝从周围环境中吸收矿质营养和水分等，再通过菌丝内部的原生质环流快速地将营养转运到兰花根系内部，从而为其生长提供所需。兰花本身还可以通过消解侵染到其细胞内部的菌根真菌菌丝来吸收营养。菌根真菌能够增加兰花植株的抗性，增强其根的吸收能力。因此，兰花的正常生长发育离不开菌根真菌。

近年来，随着兰花市场需求的日益增长，兰花组织培养技术迅速发展。但是，目前的问题是，组培苗移栽后的成活率低，生长缓慢，开花迟缓，花小甚至不开花，这严重影响了后续的兰花成活数量，从而不能满足市场的需要。存在以上问题的根本原因在于兰花组培苗的菌根化技术不成熟，具体如下：一、缺少优良的与兰花共生的菌根真菌，不能形成有效的菌根，导致兰花营养吸收的匮乏；二，缺少有效的菌根真菌接种菌剂，接种后不能保证真菌的营养来源，需多次接种，对兰花苗的根系破坏较大；三，接菌时机及接菌量不容易控制，易造成人为接种导致的兰花苗死亡现象。

发明内容

本发明的一个目的是提供一株菌，该菌可用于兰科植物的培养。

本发明所提供的菌株为瘤菌根菌(Epulorhiza sp.)GDB181。该菌株GDB181已于2008年07月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心地址是：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编是100101，保藏编号为CGMCC No.2574。

本发明所提供的菌株GDB181属于瘤菌根菌属(Epulorhiza)，其菌丝为有隔菌丝，隔间距长，隔膜明显，近直角分枝，分支处部分缢缩，菌丝直径约3.46-3.79μm，为多核菌丝；菌落白色近无色，正反面颜色一致，较稀疏，不易观察，菌落边缘不规则，菌丝稍长且向外延伸，老菌丝打结，占的面积较大，气生菌丝较多白色卷曲。

本发明的又一个目的是提供一种培养基，该培养基可用于培养瘤菌根菌。

本发明所提供的瘤菌根菌培养基，是由PDA液体培养基、蛭石和支持物组成；所述支持物可以是胡桃科植物树叶剪成的面积为20-30mm²的块状物；所述PDA液体培养基、所述蛭石和所述支持物的体积比可以为0.8-1.2∶1-2∶0.5-1.5；优选为1∶1∶1；所述胡桃科植物具体可以是胡桃、枫杨或黄杞。

每升所述PDA液体培养基是由200g去皮马铃薯、20g葡萄糖和1L水组成。

本发明的另一个目的是提供一种培养基质，该基质可用于兰科植物的培养。

本发明所提供的兰科植物培养基质，是由沙子、蛭石和苔藓组成；所述沙子、所述蛭石和所述苔藓的体积比可以为0.51∶0.81.2∶1-2，优选为1∶1∶1。

其中，苔藓具有透气和保持水份的功能，蛭石有透水性，沙子有一定的保水性。

本发明的最后一个目的是提供一种培育兰科植物的方法。

本发明所提供的培育兰科植物的方法，是将上述瘤菌根菌(Epulorhiza sp.)GDB181与兰科植物的根共培养。

在所述共培养中，可以使用上述兰科植物培养基质。

在所述共培养中，可以通过调节接种时所述菌与所述植物根的距离，来控制所述菌侵染所述组培苗根的时机，具体可以在共培养起始时，将菌放置在距离所述兰科植物根1-3cm处，优选为1.5-2cm处。

所述菌具体可以是用上述瘤菌根菌培养基在25-27℃的温度下避光培养10-20天后得到的位于支持物上的菌；每条所述兰科植物根所对应的所述支持物的面积可以为20-60mm²，所述支持物的面积优选为25mm²。

所述共培养过程中要补充营养液；所述营养液具体是由终浓度为120mg/L的Ca(NO₃)₂，终浓度为80mg/L的(NH₄)₂SO₄，终浓度为100mg/L的KH₂PO₄，终浓度为50mg/L的MgSO₄，终浓度为0.5mg/L的H₃BO₃，终浓度为0.17mg/L的MnSO₄，终浓度为0.28mg/L的ZnSO₄，终浓度为0.025mg/L的CuSO₄，终浓度为1.1mg/L的FeC₆·H₅O₇组成，用水定容。

补充营养液的方法为常规方法即可，如叶面喷洒、根部洒施等，补充营养液的次数及频率可因苗的大小、生长情况等灵活选择。

所述共培养的条件为：温度为25-27℃、湿度为75-85％、光强为2000-3000Lux、光照明暗周期为12-14h光照/10-12h黑暗；所述温度优选为25℃、所述湿度优选为85％、所述光强优选为2000Lux、所述光照明暗周期优选为14h光照/10h黑暗。

上述方法适合于一般的兰花的培养，具体可如春兰(Cymbidium goeringii)。

本发明菌株适合于兰花菌根化培养，是与兰花建立有效共生的优良菌根真菌菌株。本发明的瘤菌根菌培养基质地疏松，透气性好，营养分布均匀，适合菌丝生长和蔓延，是培养菌根真菌的最佳培养基，而且在人工接种组培苗的时候可以有效控制接种量。本发明的盆栽兰花的基质成本低、原料易于获得，还具有疏松、透气透水性好、保水能力强的特点，在接菌的时候能很好的支撑利固定染菌菌支持物，使接菌位置保持不变，有利于以后内生真菌对兰花根部的入侵和建立共生关系，而且能与兰花幼嫩的根紧密结合，使兰花从基质中吸收到水分等营养。

本发明培养兰花的方法，能很好的控制接种量，并能固定接种位置，充分保证了兰花组培苗与优良菌根真菌建立共生关系，同时还简化了接种步骤，减少了接种次数，接种一次就可达到一劳永逸，避免了人为多次接种造成的死苗现象，从而提高了移栽的成活率，得到了生长旺盛健壮的菌根化兰花苗。因此，本发明菌株、菌培养基、兰花培养基质及兰花培养方法具有重要的经济价值，适合于推广应用。

附图说明

图1为菌株GDB181CGMCC No.2574的生长情况。

图2为接菌后苗的生长情况。

图3为未接菌的苗的生长情况。

图4为接菌与未接菌苗的对比。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明均为常规方法。

实施例1、利用组培苗菌根化技术培养兰花

实施例中用到的兰花营养液的组成如下：Ca(NO₃)₂ 120mg/L，(NH₄)₂SO₄ 80mg/L，KH₂PO₄ 100mg/L，MgSO₄ 50mg/L，H₃BO₃ 0.5mg/L，MnSO₄ 0.17mg/L，ZnSO₄ 0.28mg/L，CuSO₄ 0.025mg/L，FeC₆ H₅O₇ 1.1mg/L，其余为水。

一、菌的分离及培养

1、菌的分离

从采自安徽岳西的蕙兰(Cymbidium faberi)中分离菌株GDB181，其方法如下：选取长势健壮旺盛的野生蕙兰的新鲜营养根段，流水冲洗掉根表面的泥土和腐殖质后，在超净工作台上将根段浸入1％的次氯酸钠(NaC1O)溶液中8-10min进行表面灭菌，然后用无菌水冲洗4-5次，将根段切成2-3mm的薄片，放置在1/5的PDA培养基上，25-27℃避光培养，待菌丝从根片中长成菌落后，挑取菌丝转移至PDA培养基上进行纯化，没有污染，转入PDA斜面培养基，4℃短期保存。

每升1/5PDA培养基是由40g去皮马铃薯、4g葡萄糖、56g琼脂和1L水组成。

本发明所提供的菌为瘤菌根菌(Epulorhiza sp.)GDB181。该菌株GDB181已于2008年07月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心地址是：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编是100101，保藏编号为CGMCC No.2574。

2、菌的培养

(1)一级菌种培养：将保存在斜面培养基上的菌株GDB181移接到PDA平板培养基上，25-27℃避光培养，待菌丝长满平板后作为一级菌种。

(2)二级菌种培养：将充分生长的一级菌种接种到二级菌种培养基上，25-27℃避光培养，定期观察记录，待菌丝长满整个培养基后转入冰箱保存备用。

二级菌种培养基是由枫杨树叶、蛭石和PDA液体培养基组成，其体积配比为1∶1∶1；二级菌种培养基的制备方法如下：采集新鲜的枫杨树叶，洗净，剪成5×5mm的小块，灭菌1h；蛭石冲洗干净，灭菌2h；然后将1L的剪成5×5mm的新鲜幼嫩枫杨树叶与1L蛭石混合均匀后，边搅拌边加入1LPDA液体培养基，混匀后，灭菌30min。

结果表明，二级菌种的培养中，菌很快从接种点向四周蔓延，半个月后，菌丝已布满整个培养基中的蛭石和枫杨树叶(图1)。

二、兰花的培养

本实施例中以春兰(Cymbidium goeringii)的组培苗为实验材料，组培苗是按照常规方法获得的。

本实施例中所用的兰花的盆栽基质是由河砂、蛭石和苔藓组成，其体积比为1∶1∶1；该基质的配制方法为：将苔藓充分浸泡，拧干，剪成1-2cm长的小段；将约1L河砂和1L蛭石混合均匀，然后加入1L的剪成1-2cm的小段苔藓，充分搅拌混匀(可用特定大小的容器量取上述基质)，装袋密封，灭菌2h，在无菌条件下分装到花盆中。

兰花培养方法如下：

炼苗：将待移栽的组培苗从恒温光照培养室移到光照较弱，温度为18-20℃的环境培养1周左右，出瓶前24-48h打开封口膜。

盆栽：从瓶中取出组培苗洗去粘附在根上的琼脂，然后在无菌条件下栽入兰花盆栽基质中，每盆4株，25℃恒温培养，光照强度为2000Lux，光照明暗周期为14h光照/10h黑暗，每天向苗的叶面喷洒蒸馏水，保持室内湿度在85％以上，定植2周后开始补充营养液，每隔半个月补充一次，每次每株定量10ml，定期观察记录。待苗适应外部环境后(大约一个月)，进行接菌。

接菌：选取按照步骤一2中菌培养方法培养菌GDB181，培养10-20天后，培养基中的枫杨树叶上有菌，将约5×5mm的方形枫杨树叶，放置在距苗新鲜营养根1.5-2cm处，每条根各放1-2片树叶，继续培养，培养条件同上，定期观察记录。同时以不接菌的组培苗为对照。培养6个月后，将苗取出并再次称重，计算平均鲜重增长率。平均鲜重增长率(％)＝(处理后鲜重一处理前鲜重)×100/处理前鲜重。每种处理重复3次。

三、结果

1、组培苗接菌后的生长状况

组培苗在基质中生长势一直很旺盛，叶色翠绿，叶舒展，总体很健壮，高生长迅速，旧根伸长生长明显，仅在旧根的中上部形成角质层，产生大量新生根，新伸长的根嫩绿色，有的根先端出现分叉(图2，图4A)，死亡率低；未接菌的对照苗生长缓慢，高生长不明显，外围叶发黄干枯，新生根极少(图3和图4B)。图4A为接菌苗，图4B为未接菌苗。

2、接菌后的春兰苗生长量(即成活率和鲜重增长率)的变化

对接菌并培养6个月后的春兰兰花苗及对照(未接菌的春兰苗)进行生长量的测定，成活率(％)＝处理后植株数×100/处理前植株数；平均鲜重增长率(％)＝(处理后鲜重-处理前鲜重)×100/处理前鲜重；再对接菌苗的营养根进行重分离。

实验设3次重复，结果取平均数。结果如表1所示，表明接菌的兰花苗的成活率高于对照，平均鲜重增长率高于对照，应用SPSS统计软件分析，与对照差异已达到显著水平；并且接菌苗的营养根重分离获得了原接种菌株GDB181。

表1、菌株对兰花组培苗生长量的影响

“^*”表示与对照在α＝0.05水平有显著差异；，“-”表示未分离到原菌株；“+”表示分离到了原菌株。

3、接菌后的春兰苗矿质元素含量的测定

以接菌后培养6个月的春兰苗及未接菌的苗为样品。

采用HNO₃∶HClO₄为5∶1混合酸消煮法从苗内提取矿质元素。将烘干磨碎并过60目筛的样品准确称取0.5000g(精确至0.0001)，置于洁净的三角瓶中，加混合酸25ml，瓶口放置小的曲颈漏斗，切勿摇动，将其放在85℃左右的电热板上过夜。第二天将温度调高，使消煮液保持微沸腾，待大量白烟冒尽，溶液变为无色透明时，取下三角瓶，用去离子水定容至25ml，同时做两个试剂空白实验，以校正误差。以不接菌的春兰苗为对照。采用ICP(电感耦合等离子体发射光谱仪)测定。

实验设三次重复，结果取平均数。结果如表2所示，表明接菌后的春兰苗矿质元素含量高于不接菌的对照苗，其中B、S、Cu、Zn元素的含量在对照苗中太低(低于检测线)未检测出来，而在接菌苗内都能检测到；接菌苗的K元素含量太高(高于检测线)未检测出来，而对照苗的在检测线内；另外，接菌苗的P、Ca、Na、Mg、Fe、Mn元素含量分别比对照苗增加2.9％、405.5％、278.6％、335.7％、240％、2367.7％。

表2、春兰苗的矿质元素含量(mg/g)

注：^*含量低于检测线未检出，^**含量高于检测线未检出。

综上表明，GDB181菌株接种的春兰盆栽苗，不仅生长势旺盛，苗色翠绿，叶舒展健壮，新生根多，根系发达，在苗生物量和各矿质元素含量上也有明显提高；重分离基本获得原接种菌株，它是春兰在盆栽条件下的共生菌根真菌。菌根真菌还诱导兰花产生大量新根，不仅有利于真菌的大量入侵，而且兰花也能吸收到更多的菌提供的营养，从而达到互惠互利的共生目的。

Claims (1)

1.瘤菌根菌(Epulorhiza sp.)GDB181，其保藏编号为CGMCC No.2574。

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