CN110915356A - 植物种子的促萌发方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种植物种子的促萌发方法，用显齿蛇葡萄内生菌的菌悬液对植物种子进行浸种处理，所述植物种子为具有机械休眠的植物种子。该方法采用显齿蛇葡萄内生菌的菌悬液对植物种子进行浸种处理，操作简单，省时省力；显齿蛇葡萄中富含二氢杨梅素等具有良好抑菌作用的物质，因此，从显齿蛇葡萄中挑选出来的内生菌活性很高，既可通过显齿蛇葡萄内生菌的侵蚀作用来打破植物种子的机械休眠，又有利于打破植物种子的种胚生理性休眠，促进种子的萌发，有效提高种子萌发率。

Description

植物种子的促萌发方法
技术领域
本发明涉及植物种植技术领域，特别是涉及一种植物种子的促萌发方法。
背景技术
薏苡(Coix lacryma-jobi)是禾本科一年或多年生草本植物，具有较高的营养价值及药用价值，其干燥成熟的种仁(薏苡仁)具有利水渗湿、健脾止泻等功效，薏苡仁中的薏苡仁酯、薏苡仁油等有很强的抗肿瘤作用，对肉瘤、肝癌、胃癌、肺癌等均具有较好的疗效。虽然薏苡驯化时期很早，人工栽培历史长，但是，野生种与栽培种在形态、生理等方面均有较大差异。野生种在生理生化等方面更适应所处的生态环境，有栽培种不具有的优良基因，是薏苡品种选育的优良种质库。
种植、研究薏苡需要对其进行播种繁殖，但薏苡种子具有休眠特性，在常温下具有出苗率较低、发芽时间长等特点，为提高薏苡种子的萌发率，有报道用激素、双氧水、温水等方法处理种子，如2.80％H2O2处理薏苡种子萌发率最高为60.40％，1000mg/L GA+0.2％KCl处理后的薏苡种子发芽率最高为83.33％，60℃的温水处理种子也能有效提高发芽率。但这些处理均用于栽培种的薏苡种子，并不适合野生薏苡种子。与栽培种相比，通过上述处理的野生薏苡种子的发芽率显著低于栽培种。
因此，有必要寻找一种植物种子的促萌发方法。
发明内容
基于此，有必要针对野生薏苡种子萌发率低的问题，提供一种植物种子的促萌发方法。
一种植物种子的促萌发方法，用显齿蛇葡萄内生菌的菌悬液对植物种子进行浸种处理，所述植物种子为具有机械休眠的植物种子。
上述方法采用显齿蛇葡萄内生菌的菌悬液对植物种子进行浸种处理，操作简单，省时省力；显齿蛇葡萄中富含二氢杨梅素等具有良好抑菌作用的物质，因此，从显齿蛇葡萄中挑选出来的内生菌活性很高，既可通过显齿蛇葡萄内生菌的侵蚀作用来打破植物种子的机械休眠，又有利于打破植物种子的种胚生理性休眠，促进种子的萌发，有效提高种子萌发率。
在其中一个实施例中，所述显齿蛇葡萄内生菌为对镰刀菌具有抑制作用的显齿蛇葡萄内生真菌。
在其中一个实施例中，所述显齿蛇葡萄内生菌选自显齿蛇葡萄叶内生菌和显齿蛇葡萄茎内生菌中的至少一种。
在其中一个实施例中，所述显齿蛇葡萄内生菌为显齿蛇葡萄叶内生菌。
在其中一个实施例中，所述的促萌发方法还包括所述菌悬液的制备步骤：
获取所述显齿蛇葡萄内生菌；
培养所述显齿蛇葡萄内生菌、制成所述菌悬液；
其中，所述浸种处理的条件为于25℃～30℃培养20h～30h；
还包括所述在所述浸种处理之前，对成熟的所述植物种子进行表面消毒处理的步骤。
在其中一个实施例中，所述菌体悬液浓度为2.5×107～3.5×107cfu/mL。
在其中一个实施例中，所述获取所述显齿蛇葡萄内生菌的步骤为：
取新鲜的显齿蛇葡萄的叶和/或茎，进行表面消毒后，将所述叶和/或茎粉碎，接种于培养基上，进行菌种分离和纯化，得到多种显齿蛇葡萄内生菌；
分别将所述多种显齿蛇葡萄菌与镰刀菌进行对峙培养，挑选得到对镰刀菌具有明显抑制作用的显齿蛇葡萄内生菌。
在其中一个实施例中，所述对峙培养的温度为25℃～30℃。
在其中一个实施例中，所述培养所述显齿蛇葡萄内生菌、制成所述菌悬液的步骤为：
将所述显齿蛇葡萄内生菌接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基上，于25℃～30℃培养40h～50h后，加入无菌水，振荡，得到所述菌悬液。
在其中一个实施例中，所述植物种子为薏苡种子。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
野生薏苡种子的总苞更坚硬，呈骨质，阻隔了水分及空气进入种子，存在明显的机械休眠，严重影响野生薏苡种子的萌发。本申请发明人通过实验发现，野生薏苡的种子去掉总苞后，发芽率可以从原来的10％上升至80％左右。采用机械去总苞操，容易破坏种胚，因此考虑通过化学手段如浓硫酸、双氧水、温水浸泡等方法解除机械休眠，可是在实验中发现，野生薏苡种子的总苞不是完全封闭的，其一端有较大的孔口，浓硫酸等液体物质容易从孔口进入种胚，腐蚀破坏种胚的结构，浸泡时间不够不足以解除机械休眠，但是随着浸泡时间延长或溶液浓度的增加，野生薏苡种子的发芽率反而越来越低。
同时，野生薏苡种子除了机械休眠外，还存在生理休眠，采用细胞分裂素、赤霉素等激素处理可以在一定程度上提高野生薏苡种子的发芽率，比如以2000mg/L 6-BA+0.1％KCl处理野生薏苡种子，发芽率可以达到50％左右，但是效果仍不理想。
植物内生菌是指在一定阶段或全部阶段生活在健康植物的组织和器官内部的真菌或细菌。目前已有采用植物内生菌来促进植物种子萌发的研究，但是采用显齿蛇葡萄内生菌、以及适用于野生薏苡种子的植物内生菌还未见报道；野生薏苡种子目前的自然萌发率仅为15％左右。
本发明一实施方式提供一种植物种子的促萌发方法，用显齿蛇葡萄内生菌的菌悬液对植物种子进行浸种处理，所述种子为具有机械休眠的植物种子。
上述方法通过采用显齿蛇葡萄内生菌的菌悬液对植物种子进行浸种处理，能够打破植物种子的机械休眠的同时，可以促进种胚生理休眠的打破，促进种子萌发；尤其是能够很好的打破野生薏苡种子的休眠，促进野生薏苡种子萌发，提高野生薏苡种子的萌发率。
进一步地，显齿蛇葡萄内生菌为对镰刀菌(Fusarium spp.)具有抑制作用的显齿蛇葡萄内生真菌。
进一步地，显齿蛇葡萄内生菌选自显齿蛇葡萄叶内生菌和显齿蛇葡萄茎内生菌中的至少一种。
进一步地，显齿蛇葡萄内生菌为显齿蛇葡萄叶内生菌。
在一实施例中，上述方法包括以下步骤S1～S5。
S1、获取显齿蛇葡萄内生菌。
进一步地，取新鲜的显齿蛇葡萄的叶和/或茎，进行表面消毒后，将所述叶和/或茎粉碎，接种于培养基上，进行菌种分离和纯化，得到多种显齿蛇葡萄内生菌；
分别将多种显齿蛇葡萄菌与镰刀菌(Fusarium spp.)进行对峙培养，挑选得到对镰刀菌具有明显抑制作用的显齿蛇葡萄内生菌。
进一步地，取新鲜的显齿蛇葡萄叶，进行表面消毒后，加无菌水研磨、静置分层，取上清液涂布在培养基上，进行菌种分离和纯化，得到多种显齿蛇葡萄内生菌。
进一步地，取新鲜的显齿蛇葡萄叶和/或茎，进行表面消毒后，分割成小块，接种于培养基上，进行菌种分离和纯化，得到多种显齿蛇葡萄内生菌。
进一步地，表面消毒的步骤为：洗去叶和/或茎表面灰尘后，用70％～75％的乙醇浸泡50s～90s，再用0.1％的氯化汞溶液浸泡30s～60s，无菌水漂洗干净。
进一步地，菌种分离和纯化所用的培养基为牛肉膏蛋白胨固体(NB)培养基或马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基，培养的温度为25℃～30℃。
进一步地，对峙培养的温度为25℃～30℃，对峙培养的培养基为PDA培养基。
进一步地，对镰刀菌具有明显抑制作用的显齿蛇葡萄内生菌为显齿蛇葡萄内生真菌。
具体地，分别将分离、纯化得到的多种显齿蛇葡萄内生真菌的5mm左右的菌块接种于PDA培养基的一侧，将镰刀菌(Fusarium spp.)的5mm左右的菌块接种于PDA培养基的另一侧，两菌块间的距离为25mm左右，于28℃±1℃培养，计算抑制率，筛选出对镰刀菌(Fusarium spp.)具有明显抑制效果的显齿蛇葡萄内生真菌菌株，备用。
进一步的，挑选好的菌株可长期保存，使用前只需提前1～2天活化培养。
S2、培养显齿蛇葡萄内生菌、并制成菌悬液。
进一步地，将显齿蛇葡萄内生菌接种于牛肉膏蛋白胨固体(NB)培养基上，于25℃～30℃培养40h～50h后，加入无菌水，振荡，得到所述菌悬液。
具体地，将步骤S1中挑选的显齿蛇葡萄内生菌接种在NB培养基上，于25℃～30℃培养40h～50h后，加入适量无菌水，振荡2min～3min，并用无菌水调整菌液浓度，得到菌悬液。
进一步地，所述菌体悬液浓度为2.5××107～3.5×107cfu/mL。
进一步地，所述菌体悬液浓度为3×107cfu/mL。
S3、取成熟的植物种子，进行表面消毒处理。
需要说明的是，步骤S1～S2与步骤S3没有明确的先后顺序要求，可以先进行步骤S1～S2，也可与步骤S3同时进行。
进一步地，植物种子为野生薏苡种子或栽培薏苡种子。
具体地，采集成熟的薏苡种子，自来水冲洗干净后，用0.1％的氯化汞溶液浸泡30s～60s，再用无菌水或清水冲洗3～6次，待用。
S4、将经过表面消毒处理后的植物种子浸泡在所述菌悬液中，于25℃～30℃培养20h～30h，得到经过浸种处理的植物种子。
进一步地，将经过表面消毒处理后的植物种子浸泡在所述菌悬液中，于28℃培养24h。
进一步地，在浸泡过程中不断振荡。
S5、将经过浸种处理的植物种子进行播种或培养，萌发。
具体地，将经过步骤S4浸种处理的种子，撒播在苗床上，覆盖腐殖土，厚为1.5cm～2.5cm，再盖上0.8cm～1.5cm的干草或干树叶，保水保湿。
本发明上述方法操作简单方便，与机械去总苞相比，不会破坏种胚，节省了大量的人力和物力，又可以避免硫酸、双氧水浸泡去壳对种胚造成的不良影响，且比植物生长调节剂处理的效果更佳；采用显齿蛇葡萄内生菌的菌悬液进行浸种处理，可以使野生薏苡种子的萌发率提高到90％以上，而且出芽整齐一致。
以下为具体实施例
实施例1一种野生薏苡种子的促萌发方法
1)、显齿蛇葡萄叶片的准备：采集新鲜的显齿蛇葡萄叶片3g，洗去表面灰尘和泥土后，自然晾干表面水分，然后在超净工作台中，用75％的乙醇浸泡1min，再用0.1％的氯化汞溶液浸泡30s～45s，最后用无菌水漂洗4次，最后的洗涤水按0.1mL每皿分别涂布到NB(牛肉膏蛋白胨)培养基和PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)培养基上，检测表面消毒是否彻底，确保以表面消毒彻底的显齿蛇葡萄叶进行后续的内生菌分离和纯化实验。
2)、挑选显齿蛇葡萄叶片中的内生菌：将显齿蛇葡萄叶加10ml无菌水进行充分研磨，静置15min，取上清液分别涂布于NB培养基和PDA培养基上，于28℃恒温培养72h，每天定期观察，期间如发现新菌长出，立即接出并进行纯化。
3)、挑选内生菌：内生真菌与病原真菌——镰刀菌(Fusarium spp.)采用对峙培养法，挑取直径为5mm内生真菌菌块接种于PDA培养基一侧，挑取直径为5mm病原真菌(Fusarium spp.)菌块接种于此平板另一侧，两菌饼距离为25mm，28℃培养，计算抑制率，筛选出具有明显抑制效果的显齿蛇葡萄内生真菌菌株，保藏备用。
4)培养内生菌悬液：将挑选好的显齿蛇葡萄内生真菌菌株转移至NB培养基试管斜面，于28℃培养d，然后在每支试管斜面中加入10ml无菌水，在试管振荡器上振荡2min，获得内生菌菌悬液，悬液的浓度为3×107cfu/mL。
5)、野生薏苡种子的准备：采集成熟好的野生薏苡种子，用自来水冲洗表面灰尘，再用0.1％HgCl2消毒30s，最后用清水冲洗5～6次，待用。
6)、浸泡催芽：将消毒后的野生薏苡种子浸泡在内生菌的悬浮液中，28℃培养箱中浸种24h。
7)、播种：取出浸泡后的薏苡种子，撒在苗床上，覆细腐殖土2cm，盖上1cm厚的枯草，浇透苗床，保水保湿。
7天后整齐出芽，统计出芽率为90.8％。
实施例2一种野生薏苡种子的促萌发方法
1)取实施例1保藏的显齿蛇葡萄内生真菌，活化后接种至NB的斜面培养基上，于30℃的恒温培养箱中培养2d，然后加入适量无菌水，振荡洗脱后，用无菌水调菌体悬液浓度为3.5×107cfu/mL。
2)采集成熟好的野生薏苡种子，用自来水冲洗表面灰尘，再用0.1％HgCl2浸泡消毒30s，浸泡过程中轻轻振荡，最后用清水冲洗5～6次，待用。
3)、浸泡催芽：将消毒后的野生薏苡种子浸泡在内生菌的悬浮液中，30℃培养箱中浸种20h。
4)、播种：取出浸泡后的野生薏苡种子，撒在苗床上，覆细腐殖土2cm，盖上1cm厚的枯草，浇透苗床，保水保湿。
7天后整齐出芽，统计出芽率为90.1％。
实施例3一种野生薏苡种子的促萌发方法
1)取实施例1保藏的显齿蛇葡萄内生真菌，活化后接种至NB的斜面培养基上，于25℃的恒温培养箱中培养2d，然后加入适量无菌水，振荡洗脱后，用无菌水调菌体悬液浓度为2.5×107cfu/mL。
2)采集成熟好的野生薏苡种子，用自来水冲洗表面灰尘，再用0.1％HgCl2浸泡消毒30s，浸泡过程中轻轻振荡，最后用清水冲洗5～6次，待用。
3)、浸泡催芽：将消毒后的野生薏苡种子浸泡在内生菌的悬浮液中，25℃培养箱中浸种30h。
4)、播种：取出浸泡后的野生薏苡种子，撒在苗床上，覆细腐殖土2cm，盖上1cm厚的枯草，浇透苗床，保水保湿。
7天后整齐出芽，统计出芽率为89.5％。
对比例1
采集成熟的野生薏苡种子，用自来水冲洗表面灰尘，再用0.1％HgCl2消毒30s，最后用清水冲洗5～6次，待用。
将消毒后的薏苡种子撒在苗床上，覆细腐殖土2cm，盖上1cm厚的枯草，浇透苗床，保水保湿。
观察种子发芽情况，于播种后20天开始出芽，统计出芽率为10.9％，并继续观察至播种后的27天，合计出芽率仅为11.2％。
对比例2
采集成熟的野生薏苡种子，用自来水冲洗表面灰尘，再用0.1％HgCl2消毒30s，最后用清水冲洗5～6次，待用。
按照破眠催芽剂(购自博海农业)的使用方法，配制催芽溶液，将消毒后的野生薏苡种子浸泡在催芽溶液中，28℃培养箱中浸种24h。
取出浸泡后的薏苡种子，撒在苗床上，覆细腐殖土2cm，盖上1cm厚的枯草，浇透苗床，保水保湿。
观察，播种后第7天的出芽率约为8.5％，至第14天，统计出芽率为50.6％。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种植物种子的促萌发方法，其特征在于，用显齿蛇葡萄内生菌的菌悬液对植物种子进行浸种处理，所述植物种子为具有机械休眠的植物种子。
2.根据权利要求1所述的促萌发方法，其特征在于，所述显齿蛇葡萄内生菌为对镰刀菌具有抑制作用的显齿蛇葡萄内生真菌。
3.根据权利要求1所述的促萌发方法，其特征在于，所述显齿蛇葡萄内生菌选自显齿蛇葡萄叶内生菌和显齿蛇葡萄茎内生菌中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的促萌发方法，其特征在于，所述显齿蛇葡萄内生菌为显齿蛇葡萄叶内生菌。
5.根据权利要求1所述的促萌发方法，其特征在于，还包括所述菌悬液的制备步骤：
获取所述显齿蛇葡萄内生菌；
培养所述显齿蛇葡萄内生菌、制成所述菌悬液；
其中，所述浸种处理的条件为于25℃～30℃培养20h～30h；
还包括所述在所述浸种处理之前，对成熟的所述植物种子进行表面消毒处理的步骤。
6.根据权利要求5所述的促萌发方法，其特征在于，所述菌体悬液浓度为2.5×107～3.5×107cfu/mL。
7.根据权利要求5所述的促萌发方法，其特征在于，所述获取所述显齿蛇葡萄内生菌的步骤为：
取新鲜的显齿蛇葡萄的叶和/或茎，进行表面消毒后，将所述叶和/或茎粉碎，接种于培养基上，进行菌种分离和纯化，得到多种显齿蛇葡萄内生菌；
分别将所述多种显齿蛇葡萄菌与镰刀菌进行对峙培养，挑选得到对镰刀菌具有明显抑制作用的显齿蛇葡萄内生菌。
8.根据权利要求7所述的促萌发方法，其特征在于，所述对峙培养的温度为25℃～30℃。
9.根据权利要求5所述的促萌发方法，其特征在于，所述培养所述显齿蛇葡萄内生菌、制成所述菌悬液的步骤为：
将所述显齿蛇葡萄内生菌接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基上，于25℃～30℃培养40h～50h后，加入无菌水，振荡，得到所述菌悬液。
10.根据权利要求1～9任一项所述的促萌发方法，其特征在于，所述植物种子为野生薏苡种子。
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