KR102248585B1

KR102248585B1 - 고사리 신규 마름병균의 길항 미생물을 이용한 천연 미생물 방제제 개발

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Publication number: KR102248585B1
Application number: KR1020190161789A
Authority: KR
Inventors: 정영륜; 이정은
Original assignee: (주)제일그린산업
Priority date: 2019-12-06
Filing date: 2019-12-06
Publication date: 2021-05-06

Abstract

고사리 신규 마름병식물 병원균인 디디멜라 속(Didymella sp.)에 대한 항진균 활성뿐만 아니라, 식물 생육 촉진 효과를 가진 바실러스 속 미생물 및 이를 이용한 환경 친화적인 미생물 제제가 제공된다. 본 발명은 신규 미생물 바실러스 써브틸리스(Bacillus subtilis) JG46(수탁번호: KACC92271P) 균주 및 이를 이용한 미생물 제제를 제공한다.

Description

고사리 신규 마름병균의 길항 미생물을 이용한 천연 미생물 방제제 개발{Development of a natural biopesticide using an antagonistic microorganism for the control of a new bracken blight pathogen}

본 발명은 항진균 활성을 갖는 미생물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 고사리 신규 마름병을 일으키는 병원균을 억제하는 길항 미생물에 관한 것이다.

본 발명은 2019년 농림축산식품부에서 지원하는 '농생명산업기술개발사업'의 일환으로 수행된 연구로부터 도출된 것이다.

[과제고유번호: 118029-02, 과제명: 고사리 신규 마름병의 병원균 규명 및 친환경 방제제 개발]

고사리(bracken, Pteridium aquilinum Kuhn)는 열대지방에서부터 온대지방에 이르기까지 광범위하게 분포되어 있는 고사리과의 다년생 양치식물로 배수가 잘 되고 다소 그늘지며 비옥한 곳이면 어디든지 잘 자라는 특성을 가지고 있어 우리나라 전국 산야에 자생하고 있다(비특허문헌 1 및 2 참조). 고사리는 우리 민족이 즐겨먹던 나물의 하나로 무기물이 풍부하고 아스파라긴(asparagine), 글루탐산(glutamic acid)과 같은 필수 아미노산과 비타민 및 식이섬유를 다량 함유하고 있고, 여러 가지 기능성이 알려지면서 건강식품으로 그 수요가 급격히 늘어나고 있다.

단위 면적당 생산량과 소득도 재배지역, 출하시기 및 농가의 기술 수준에 따라 차이가 있으나 비교적 재배가 쉽고, 일단 식재한 후에는 동일 포장에서 장기간 재배할 수 있어 매년 경운 식재가 필요하지 않다. 또한, 병해충에도 강하고 타작물에 비해 비교적 관리가 용이하다고 알려져 농가들의 새로운 소득원으로 부상하였고 앞으로 재배 면적은 더욱 증가될 것으로 전망되고 있다.

전국적으로 고사리 재배 면적은 2,196 ha, 생산량은 9,244톤(생산액 524억원, 2015년 기준)이며, 경남 남해군의 경우 국내 최대 고사리 주산지로서 전국 생산량의 37%를 차지하고 있으며, 단일 품목으로 연간 100억 원 이상의 고소득을 창출하고 있다. 특히, 남해군 창선면에서는 1,500여 농가가 460 ha 규모로 재배하고 있으며, 해풍과 따뜻한 기후의 영향으로 향이 진하고 식감이 부드러워 남해군 고사리 대표 브랜드로 자리잡고 있다(비특허문헌 3 및 4 참조).

그러나, 최근 몇 년 동안 남해군 창선면의 고사리 재배 농가에서 잎과 줄기가 붉게 말라 죽는 증상이 대대적으로 발생되었고, 2014년 약 2,000톤(생산액 약 99억 원)이었던 남해군 고사리 생산량이 2017년에는 1,276톤(생산액 약 60억 원)으로 감소하는 심각한 경제적 피해가 발생되었다. 이로 인하여 남해군이 2016년까지 고사리 주산지이었으나, 2017년 이후부터는 전라남도 구례군으로 주산지가 바뀌었다(비특허문헌 5 및 6 참조). 이 마름병은 남해군 전역으로 퍼지고 있는 상황으로 남해군 농가뿐만 아니라 다른 지역의 고사리 재배 농가에도 급속히 발병이 증가되어 전국적으로 피해가 늘어날 것으로 우려된다.

현재까지 국내에서 보고된 고사리의 병·해충은 뿌리썩음병(Pythium sp.), 줄기마름병(Rhizoctonia sp.), 선충 및 진딧물에 의한 피해만이 간략히 소개되어 있고, 그 외 병해충이나 방제법에 대한 구체적인 연구는 아직 보고된 바 없다.

그러나, 최근 연구 결과에 의하면 남해군에 발생한 고사리 신규 마름병을 일으키는 병원균이 디디멜라 속(Didymella sp.)에 의한 것으로 밝혀졌으나(비문헌특허 7 참조), 구체적인 방제법이 알려지지 않고 있어 더 이상의 피해를 막을 수 있는 친환경적인 방제제 개발이 시급히 요구된다.

현재까지 개발되어 판매되고 있는 식물병 방제용 미생물 제제는 국내외적으로 수십여 종에 이르고 있는데, 이들 중 효과가 있다고 인정된 것은 주로 세균 바실러스(Bacillus)와 곰팡이인 트리코데르마(Trichoderma)를 이용하여 만든 제품이다(비특허문헌 8 내지 11 참조). 바실러스(Bacillus) 제품에 사용된 종류는 바실러스 오리지콜라(B. oryzicola), 바실러스 서브틸리스(B. subtilis), 바실러스 푸밀러스(B. pumilus) 및 바실러스 아밀로리퀘페이션스(B. amyloliquefaciens)가 있다.

바실러스는 내생포자(endospore)를 형성하여 좋지 않은 자연 환경에서도 오랜 기간 생존할 수 있고, 항균 능력이 좋은 이유로 많은 연구자들이 식물병의 생물학적 방제를 위하여 연구 결과를 발표하고 있다(비특허문헌 11 및 12 참조).

그러나, 분리된 바실러스 종류에 대하여 많은 연구가 진행되었지만 실제로 상품화되어 식물병 방제에 효과적으로 사용되는 것은 몇 종에 불과하다(비특허문헌 13 및 14 참조). 이것은 길항 세균을 분리할 때 단순히 병원균을 억제하는 기작만을 기준으로 삼았기 때문에 상대적으로 방제 효과가 낮은 것이 한 원인일 것으로 생각된다. 따라서, 새롭게 분리되는 균주는 다양한 병원균 억제뿐만 아니라 생육 촉진 효과 및 식물 면역력 증가 등을 동시에 가지고 있는 길항 미생물로서, 이를 이용하여 병발생으로 인한 문제점을 해소함으로써 농가 소득 향상에 실질적인 도움을 줄 수 있는 우수한 미생물 제제 개발이 필요하다.

[비특허문헌]

비특허문헌 1: Jo, J.S. (1978). Physico-chemical properties of bracken (Pteridium aquilinum) root starch. Kor. J. Food Sci. Technol. 10:57-62.

비특허문헌 2: Kim, J.R. (2001). Bracken cultivation technology. Institute of wild edible greens of experimentral station in Kangwon province.

비특허문헌 3: Lee, S.S., Jeong J.G., Choi, C.H. and Kim, C.H. (2008). A herbalogical study on the plants of pteridaceae in Korea. Kor. J. Herbal. 23:33-40.

비특허문헌 4: Sim, H.J., Hwang, C.R., Kang, J.R., Kanf, K.M. and Sin, J.H. (2015). Physicochemical characteristics and antioxidant activity of bracken (Pteridium aquilinum Kuhn) in Namhae. Kor. J. Food Cook Sci. 31:288-295.

비특허문헌 5: Korea Forest Service, (2015). Production of forest service, Daejeon, Korea. 34pp(in Korean).

비특허문헌 6: Korea Forest Service, (2017). Production of forest service, Daejeon, Korea. 31pp(in Korean).

비특허문헌 7: Lee, J.E., Kim, K.B, Park, J.E., Kim, D.W., Shin, Y. K., Yun, S.H. and Chung, Y.R. (2019). First report of a bracken blight disease caused by Didymella sp. Res. Plant Dis. 25:143-148.

비특허문헌 8: Bibi, F., Yasir, M., Song, G. C., Lee, S. Y. and Chung, Y. R. (2012). Diversity and characterization of endophytic bacteria associated with tidal flat plants and their antagonistic effects on oomycetous plant pathogens. Plant Pathol. J. 28:20-31.

비특허문헌 9: Cao, C., Park, S. and McSpadden, G. (2010). Biopesticide controls of plant diseases: resources and products for organic farmenrs in Ohio. Fact Sheet, Agricultural and Natural Resources. SAG-18-10 The Ohio State Univeristy.

비특허문헌 10: Lee, S. K., Sohn, H. B., Kim, G. G. and Chung, Y. R. (2006). Enhancement of biological control of Botrytis cinerea on cucumber by foliar sprays and bed potting mixes of Trichoderma harzianum YC459 and its application on tomat in the greenhouse. Plant Pathol. J. 22:283-288.

비특허문헌 11: Hossain, M. D., Khan, A., Chung, E. J., Rashid, M. H., and Chung, Y. R. (2016). Biological control of rice bakanae by an endophytic Bacillus oryzicola YC7007. Plant Pathol. J. 32:228-241.

비특허문헌 12: 박경석. (2011). 미생물 농약의 개발 현황과 바실러스 미생물의 중요성. 공업화학 전망 14(4):1-11.

비특허문헌 13: Gatson, J. W., Benz, B. F., Chandrasekaran, C., Satomi, M., Venkateswaran, K. and Hart, M. E. (2006). Bacillus tequilensis sp. nov., isolated from a 2000-year-old Mexican shaft-tomb, is closely related to Bacillus subtilis. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 56:1475-1484.

비특허문헌 14: Sumpavapol, P., Tongyonk, L., Tanasupawat, S., Chokesajjawatee, N., Luxananil, P. and Visessanguan, W. (2011). Bacillus siamensis sp. nov., isolated from salted crab (poo-khem) in Thailand. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 60:2364-2370.

이에, 본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 고사리 신규 마름병식물 병원균인 디디멜라 속(Didymella sp.)에 대한 항진균 활성뿐만 아니라, 식물 생육 촉진 효과를 가진 바실러스 속 미생물 및 이를 이용한 환경 친화적인 미생물 제제를 제공하고자 한다.

상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, 신규 미생물 바실러스 써브틸리스(Bacillus subtilis) JG46(수탁번호: KACC 92271P) 균주를 제공한다.

또한, 상기 균주는 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 16S rRNA 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 바실러스 써브틸리스(Bacillus subtilis) JG46(수탁번호: KACC 92271P) 균주를 제공한다.

또한, 상기 균주는 고사리 신규 마름병균인 디디멜라 속(Didymella sp.) 병원균에 대해 길항력을 갖는 것을 특징으로 하는 바실러스 써브틸리스(Bacillus subtilis) JG46(수탁번호: KACC 92271P) 균주를 제공한다.

또한, 상기 균주는 배추 무사마귀병균(Plasmodiophora brassicae), 수박 줄기마름병균(Didymella bryoniae), 인삼 균핵병균(Sclerotinia minor), 인삼 탄저병균(Colletotrichum gloeosporioides), 인삼 반점병균(Alternaria panax) 및 딸기 시들음병균(Fusarium oxysporum)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 병원균에 대한 항진균 활성을 더욱 갖는 것을 특징으로 하는 바실러스 써브틸리스(Bacillus subtilis) JG46(수탁번호: KACC 92271P) 균주를 제공한다.

또한, 상기 균주는 바나나 시들음병균(Xanthomonas campestris) 또는 딸기 세균모무늬병균(Xanthomonas fragariae)에 대한 항균 활성을 더욱 갖는 것을 특징으로 하는 바실러스 써브틸리스(Bacillus subtilis) JG46(수탁번호: KACC 92271P) 균주를 제공한다.

또한, 상기 균주는 식물 생육 촉진능을 더욱 갖는 것을 특징으로 하는 바실러스 써브틸리스(Bacillus subtilis) JG46(수탁번호: KACC 92271P) 균주를 제공한다.

상기 또 다른 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, 상기 미생물, 이의 배양액 또는 배양 추출액을 유효성분으로 함유하는 미생물 제제를 제공한다.

본 발명에 따르면, 고사리 신규 마름병균인 디디멜라 속(Didymella sp.) 병원균을 포함한 작물의 중요한 식물병원 진균 및 세균의 생장을 동시에 억제할 수 있고, 기주 식물의 생육 촉진 효과를 모두 갖는 세균 바실러스 써브틸리스 (Bacillus subtilis) JG46을 이용하여 식물 병원균을 직접 억제할 뿐만 아니라 식물 생육 촉진 효과를 모두 지닌 우수한 미생물 제제를 제공할 수 있다.

도 1은 JG46 균주의 16S rRNA 유전자의 염기서열을 나타낸 도면,
도 2는 JG46 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 통한 Bacillus subtilis JG46의 계통수를 나타낸 도면,
도 3은 JG46 균주의 유전자 분석(BOX-PCR)을 이용한 유사 균주 대비 유전자 비교 분석 결과를 나타낸 사진,
도 4는 JG46 균주의 주요 식물병원 진균에 대한 항균 활성 조사 결과를 나타낸 사진,
도 5는 JG46 균주의 주요 식물병원 세균에 대한 항균 활성 조사 결과를 나타낸 사진,
도 6은 JG46 균주의 배추 무사마귀병 억제 효과를 나타낸 사진,
도 7은 JG46 균주 제제에 의한 고사리 신규 마름병균 (Didymella sp.)에 대한 억제 효과를 나타낸 사진,
도 8는 JG46 균주 제제 처리에 의한 각 작물별 식물 생육 촉진 효과를 나타낸 사진.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 실시예의 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원 시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.

본 발명자들은 고사리 신규 마름병균인 디디멜라 속(Didymella sp.) 병원균을 포함한 작물의 중요한 식물병원 진균 및 세균의 생장을 동시에 억제할 수 있고, 기주 식물의 생육 촉진 효과를 모두 갖는 신규 바실러스 써브틸리스(Bacillus subtilis) 균주를 발견하였다.

따라서, 본 발명은 신규 미생물 바실러스 써브틸리스(Bacillus subtilis) JG46(수탁번호: KACC 92271P) 균주를 개시한다.

이하, 실시예를 들어 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.

실시예 1 : JG46 균주의 분리 및 동정

(1) JG46 균주의 분리

JG46 균주는 ㈜제일그린산업 앞마당의 흙으로부터 분리되었다. 먼저, 길항 미생물을 분리하기 위하여 채집된 토양을 멸균수 100 ㎖가 들어있는 삼각 플라스크에 20 g을 넣은 후 30분간 진탕 배양한 후 희석 평판법에 의거하여 1/10⁸까지 희석하였다. 토양 희석액 1 ㎖를 트립틱 소이 한천(TSA, Tryptic soy agar) 배지 위에 도말한 후 25℃ 배양기에서 7일간 배양 후 자라나는 수백 개의 미생물 콜로니 중 형태적 특성에 따라 145개 균주를 순수 분리하였다.

고사리 신규 마름병균 디디멜라(Didymella sp.)에 대한 길항 효과를 나타내는 미생물을 분리하기 위하여 토양에서 분리된 145개의 미생물 균주를 이용하여 고사리 마름병의 병원균 억제 정도를 조사하였다. 이 중 감자설탕한천(PDA, Potato dextrose agar) 및 1/10TSA 배지에서 병원균의 균사 생장을 5 내지 15 mm 정도 억제하는 길항 미생물 56개 균주를 1차 선발하였다.

선발된 미생물 균주들을 순수 배양하여 고사리 마름병균에 대한 억제 효과를 다시 확인하고, 동시에 고사리 마름병균 외에 주요 식물 병원균에 대한 억제 효과와 고추 모종을 이용하여 식물 생육 촉진 효과와 미생물 제제화에 용이한 조건을 모두 만족하는 균주 1종을 최종 선발하여 JG46 균주로 명명하였다.

(2) JG46 균주의 동정

상기 분리된 JG46 균주의 동정을 위하여, 미생물 균체 배양액으로부터 DNA를 추출하여 16S rRNA 유전자의 염기서열(1460bp, 도 1 참조)을 분석 후 GenBank/EMBL/DDBJ의 데이터베이스와 상동성 검색을 수행하여 계통학적 위치를 검토한 결과, 바실러스 써브틸리스(Bacillus subtilis)와 99.93%의 높은 유사성을 나타냈다. 도 2에서는 JG46 균주의 16S rRNA 유전자 서열 분석으로 만든 계통수를 나타내고 있다. 도 2에서 교점 숫자는 1,000 반복에서 나온 부트스트랩 값(bootstrap value)을 나타낸다. 상기 분리된 균을 바실러스 써브틸리스(Bacillus subtilis) JG46으로 명명하였다.

한편, JG46 균주와 근연종과의 상이성을 확인하기 위하여 도 3과 같이, JG46 균주의 유전자 분석(BOX-PCR)을 이용한 근연종 균주 대비 유전자 비교 분석을 수행하였다. 유전자 분석을 위한 폴리머라제(polymerase)는 GoTaq Green Mater Mix(Promega), 프라이머(primer)는 BOXAR1(5'-CATCGGCAAGGCGACGCTGACG-3')을 사용하였다. PCR 조건은 초기 변성(initial denaturation)은 95

에서 7분, 35회 반복되는 과정인 변성(denaturation), 어닐링(annealing), 연장(extension)은 각각 90℃에서 30초, 40℃에서 1분, 72℃에서 3분, 최종 연장(final extension)은 72℃에서 10분간 반응시켜 증폭시켰다. 이러한 과정을 거쳐 얻은 PCR 산물에 대해 1% LE agarose gel(Seakem)을 이용하여 증폭 유무를 확인하였다. 도 3에서 M은 1 kb 마커(marker), 1은 JG46 균주, 2는 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis subsp. subtilis) KACC17798 균주, 3은 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis subsp. inaquosorum) KACC17047 균주를 나타낸다.

도 3에 나타낸 바와 같이, JG46 균주와 학명이 같은 표준 균주에 대하여 보다 세부적인 비교를 위해 유전자 분석(BOX-PCR)을 수행한 결과, JG46 균주는 근연종 균주들과는 다른 밴드 패턴을 보였으며, 이에 2019년 08월 22일자로 국립농업과학원 농업유전자원센터(Korean Agricultural Culture Collection, KACC)에 기탁 후 수탁번호 KACC 92271P를 부여받았다.

실시예 2: JG46 균주의 식물 병원 진균 및 세균에 대한 억제 효과

JG46 균주가 고사리 마름병 및 다른 식물 병원성 진균과 세균에 대한 억제 효능을 나타내는지 검정하기 위하여, 하기와 같이 항균 활성을 조사하였다.

JG46 균주의 항균 활성은 중요한 식물병원 진균 6종(Didymella sp.(고사리 마름병), Didymella bryoniae(수박 줄기마름병), Colletorichum gloeosporidides(인삼 탄저병), Sclerotinia minor(인삼 균핵병), Alternaria panax(인삼 반점병), Fusarium oxysporum(딸기 시들음병)) 및 병원 세균 2종(Xanthomonas campestris(바나나 시들음병), Xanthomonas fragariae(딸기 세균모무늬병)에 대한 병원균 생장의 억제 정도를 한천 배지상 대치 배양법으로 확인하였다. 상기 병원균 중 Didymella sp., Fusarium oxysporum 및 Xanthomonas fragariae는 본 발명자들이 감염된 작물로부터 직접 분리한 병원균이다.

상기 식물병원 진균에 대해서는 PDA 배지에서 2주간 배양한 균사체 디스크를 PDA와 1/10TSA 배지의 중앙에 놓은 후, 균사체 디스크로부터 3 cm 떨어진 곳에 1/10TSB 배지에서 28℃, 48시간 동안 진탕배양(120 rpm)한 JG46 균주 배양액 100 ㎕를 떨어뜨렸다. 병원균에 따라 24 내지 28℃에서 2 내지 4일간 배양 후 균사 생장 억제 정도를 조사하였고, 그 결과를 하기 표 1 및 도 4에 나타내었다.

또한, 상기 식물병원 세균 억제 효과 조사를 위하여, JG46 균주는 1/10TSB와 1/2TSB 배지에서, 병원 세균은 1/10TSB 배지에서 28℃, 48시간 동안 진탕 배양하여 사용하였다. 배양된 병원 세균을 1/10TSA 배지에 도말하고 배지에 작은 구멍을 2군데 뚫어 1/10TSB와 1/2TSB 배지에서 배양된 각각의 JG46 균주 배양액을 100㎕씩을 떨어뜨린 후 28℃에서 24 내지 48시간 동안 배양한 후 억제 정도를 조사하였고, 그 결과를 하기 표 2 및 도 5에 나타내었다.

병원 진균 (병명)	KACC No.	병원균 배지
병원 진균 (병명)	KACC No.	PDA (mm)	1/2 TSA (mm)
Didymella sp. (고사리 마름병)	48792	5	9
Didymella bryoniae (수박 줄기마름병)	40669	6	10
Colletotrichum gloeosporioides (인삼 탄저병)	40003	8	8
Sclerotinia minor (인삼 균핵병)	41066	8	12
Alternaria panax (인삼 반점병)	42461	12	10
Fusarium oxysporum (딸기 시들음병)	-	6	7

병원 세균 (병명)	KACC No.	JG46 배양 배지
병원 세균 (병명)	KACC No.	1/10 TSB (mm)	1/2 TSB (mm)
Xanthomonas campestris (바나나 시들음병)	10377	4	6
Xanthomonas fragariae (딸기 세균성 모무늬병)	-	4	6

표 1을 참조하면, JG46 균주의 고사리 마름병균과 식물병원 진균에 대한 항균 활성은 배지에 따라 약간 다르지만 5 내지 12㎜ 정도 균사 생장억제 효과를 나타내었고, 표 2를 참조하면, 1/10 TSB와 1/2 TSB 배지에서 배양한 JG46 균주 배양액의 바나나 시들음병과 딸기 세균모무늬병을 일으키는 병원 세균에 대한 항균 활성은 병원 세균이 배양된 1/10 TSA 배지에서 각각 4 mm 및 6 mm의 생장억제 효과를 나타낸 것을 알 수 있다.

실시예 3: JG46 균주의 배추 무사마귀병에 대한 억제 효과

JG46 균주가 배추 무사마귀병에 대한 억제 효과를 나타내는지 검정하기 위하여 하기와 같이 항균 활성을 조사하였다.

얼갈이 배추 종자를 1% NaOCl 용액과 70% 에탄올을 이용하여 각각 1분씩 침지 후 표면 살균하고 멸균수로 세척한 후 플라스틱 배양기에 넣어 습도를 유지하면서 생육상(28 내지 30℃, 상대습도 80% 이상)에서 5일간 발아시켰다.

배추 무사마귀병균은 인공배양이 어려우므로 진주 인근에서 배추 무사마귀병이 심하게 발생한 토양을 채취하여 포트에 담고 발아된 얼갈이 배추 종자를 심은 후 유묘기(2 내지3엽)가 될 때까지 실온(약 23℃)에서 재배하였다. 각 처리구는 3반복으로 하였고, 처리당 3주를 심어서 준비하였다. 처리구는 JG46 균주를 1/10TSB 배지에서 3일간 배양한 배양액(2x10⁸ cfu/g) 5 ㎖를 관주 처리하였고, 무처리구는 멸균된 1/10TSB 배양액 5 ㎖를 관주 처리하였다. JG46 균주 처리 후 한 달동안 매일 물을 주면서 재배 후 뿌리에서 혹 형성 정도를 관찰하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6을 참조하면, JG46 배양액 관주 처리 한 달 후 배추 뿌리에 혹이 발생하였는지 관찰한 결과, JG46 배양액을 처리한 처리구에서는 무처리구와 달리 뿌리혹이 발생되지 않은 것을 확인할 수 있다.

실시예 4: JG46 균주의 제제화

JG46 균주의 활성 유지와 보관 중 밀도 유지를 위하여, 하기와 같이 분말 형태로 제제화하였다.

JG46 균주를 대형 발효기(1 톤 이상)에서 배양하여 얻은 세균 배양액을 원심분리한 후 얻은 균체를 고온 건조시켰다. 건조된 균체에 카올린(kaolin), 장석(feldspar group minerals) 등의 점토 광물과 균일하게 혼합하여 분말 형태의 고상제로 제조하였다.

상기와 같이 제제화한 시료의 밀도를 조사한 결과 모든 제제에서 10⁹ cfu/g 이상 포함된 것을 확인하였다.

실시예 5: JG46 균주 제제의 고사리 신규 마름병에 대한 억제 효과

JG46 균주를 이용한 미생물 제제가 고사리 신규 마름병에 대한 억제 효과가 있는지 검증하기 위하여 그 예방 효과와 치료 효과를 하기와 같이 조사하였다.

병원균으로 순수 분리된 고사리 마름병 병원균(Didymella sp.)을 PDA 배지에 접종하고 25℃에서 10일 동안 배양하여 형성된 포자를 긁어 멸균수를 첨가하여 수확하고, 포자 농도가 2 x 10⁵ cfu/㎖가 되도록 포자 현탁액을 준비하였다.

먼저, 병 예방 효과 조사를 위하여 JG46 균주 제제를 1,000배와 2,000배로 희석하여 건전한 고사리 잎에 흘러 내리도록 분무한 후 1일 동안 항온항습실(25℃, 75% RH)에 둔 후, 병균 포자 현탁액을 분무 접종하여 10일간 둔 후 발병 정도를 조사하였다.

또한, JG46 균주 제제의 병 치료 효과 조사를 위하여 병균 포자 현탁액을 건전한 고사리 잎에 분무접종하고 이를 습실상(25℃에 넣고 1일 동안 항온항습실에서 발병시킨 후 JG46 균주를 이용한 미생물 제제를 1,000배와 2,000배로 희석하여 분무한 후 10일 후 발병 정도를 조사하였다.

고사리 신규 마름병의 발병 조사는 5단계 발병도(0 : 정상, 1 : 1 내지 25%, 2 : 26 내지 50%, 3 : 51 내지 75%, 4 : 76 내지 100%)로 병이 들어 검게 변하는 정도로 구분하였으며, 방제가는 하기 수학식 1에 따라 계산하여 산출하였다.

[수학식 1]

방제가(%) = (무처리구 병 발병도 - 처리구 병 발병도) / 무처리구 병 발병도 x 100

하기 표 3 및 표 4에 JG46 균주를 이용한 미생물 제제의 고사리 마름병에 대한 예방 효과 및 치료 효과 조사 결과를 각각 나타내었다.

미생물(JG46) 제제 처리	5일후		10일후
미생물(JG46) 제제 처리	발병도	방제가(%)	발병도	방제가(%)
무처리^*	3.00±0.0	-	3.80±0.2	-
Ⅹ1,000^*	0.20±0.2	93.3	1.20±0.2	68.4
Ⅹ2,000*	0.80±0.2	73.3	1.40±0.8	63.2
1) 3반복 평균 2) 유의수준: ^*P<0.001

미생물(JG46) 제제 처리	5일후		10일후
미생물(JG46) 제제 처리	발병도	방제가(%)	발병도	방제가(%)
무처리^*	2.80±0.2	-	4.00±0.0	-
Ⅹ1,000^*	0.20±0.2	92.9	1.40±0.3	65.0
Ⅹ2,000*	0.80±0.2	71.4	1.40±0.3	65.0
1) 3반복 평균 2) 유의수준: ^*P<0.001

표 3 및 표 4를 참조하면, JG46 균주를 이용한 미생물 제제를 1,000배 또는 2,000배로 희석하여 병 발생 전·후에 처리함으로써 우수한 고사리 신규 마름병 방제 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있다.

구체적으로, 1,000배로 희석하여 처리하였을 때 가장 방제가가 높았고, 처리 10일 후에는 방제가가 다소 낮아지는 것으로 보아 5 내지 7일 간격으로 미생물 제제를 처리함으로써 신규 마름병을 효과적으로 방제할 수 있을 것으로 판단된다.

또한, 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 JG46균주를 이용한 미생물 제제의 고사리 마름병균에 대한 균사 생장 억제 정도를 조사한 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 500배, 1,000배 및 2,000배 희석액 모두 균사 생장 억제 효과를 나타낸 것을 확인하였다.

이와 같이, 고사리 마름병은 본 발명자들이 최초로 원인 규명을 한 것으로, 현재까지 고사리로 등록된 친환경적인 방제 약제가 없는 상황에서 본 발명에 따른 미생물 제제의 사용을 통해 고사리 재배 농가의 심각한 문제를 해결하고 농가 소득 증대를 가져올 수 있는 실질적인 방제법이 될 수 있다.

실시예 6: JG46 균주 제제의 약해 시험

JG46 균주를 이용한 미생물 제제가 작물에 약해가 있는지 확인하기 위하여 하기와 같이 조사하였다.

고사리, 배추, 상추, 오이, 고추 및 인삼 모종을 정식 후 재배하면서 JG46 균주를 이용한 미생물 제제를 각 작물의 유묘기에 경엽처리 방식으로 기준량(2,000배)과 배량(1,000배)으로 처리하였다. 미생물 제제 처리 후 3, 5 및 7일차에 각 작물의 외관상 나타나는 약해 유무를 달관 조사하였으며, 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

시험작물	처리내용	약해정도(0~4)			최종결과
시험작물	처리내용	처리후 3일차	처리후 5일차	처리후 7일차	최종결과
고사리	기준량	0	0	0	약해없음
고사리	배량	0	0	0	약해없음
배추	기준량	0	0	0	약해없음
배추	배량	0	0	0	약해없음
상추	기준량	0	0	0	약해없음
상추	배량	0	0	0	약해없음
오이	기준량	0	0	0	약해없음
오이	배량	0	0	0	약해없음
고추	기준량	0	0	0	약해없음
고추	배량	0	0	0	약해없음
인삼	기준량	0	0	0	약해없음
인삼	배량	0	0	0	약해없음

표 5를 참조하면, 각 작물의 외관상 나타나는 약해 유무를 달관 조사한 결과 기준량 및 배량 처리 시 모두 약해 증상이 없는 것을 확인할 수 있다.

실시예 7: JG46 균주 제제 처리에 의한 식물 생육 촉진 효과

JG46 균주를 이용한 미생물 제제 처리에 의한 식물 생육 촉진 효과를 검정하기 위하여 하기와 같이 조사하였다.

오이, 상추, 배추 및 들깨 종자를 상기 실시예 6과 같은 방법으로 표면 살균하고 멸균수로 세척하였다.

발아된 종자들은 10일간 작물 재배용 상토에서 키운 후 포트에 옮겨 각 작물들이 유묘기가 되었을 때 JG46 균주 제제를 2,000배로 희석하여 일주일 간격으로 4번 근권 토양에 관주 처리하였다. 각 작물별 무처리구와 처리구는 3반복으로 하였고, 관주 처리 한 달 후 각 작물의 생체중을 측정하여 미생물 제제의 생육 촉진 효과를 확인하였고, 그 결과를 하기 표 6 및 도 8에 나타내었다.

작물	생중량(g/주)		증가율(%)
작물	무처리	처리	증가율(%)
오이^*	8.31±0.05	11.24±1.39	35.3
배추^**	2.06±0.02	3.80±0.19	84.5
들깨^*	2.10±0.03	2.80±0.07	33.3
상추^*	0.54±0.02	0.93±0.03	72.2
1) 3반복 평균 2) 유의수준: ^P<0.05, ^*P<0.01

표 6을 참조하면, 각 작물별 미생물 제제에 대한 무처리구와 처리구의 생중량을 비교한 결과, JG46 균주 제제를 처리한 4가지 작물들 모두 생중량이 유의성 있게 증가하였으며, 도 8을 참조하면, 동시에 뿌리 생육이 무처리구에 비해 증가하였음을 확인할 수 있다.

이상에서 설명한 본 발명의 바람직한 실시예들은 기술적 과제를 해결하기 위해 개시된 것으로, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 사상 및 범위 안에서 다양한 수정, 변경, 부가 등이 가능할 것이며, 이러한 수정 변경 등은 이하의 특허청구범위에 속하는 것으로 보아야 할 것이다.

국립농업과학원

KACC92271P

20190822

<110> Jgreen Inc. <120> Development of a natural biopesticide using an antagonistic microorganism for the control of a new bracken blight pathogen <130> NP19-11133 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1460 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Bacillus subtilis JG46 <400> 1 gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc ggacagatgg gagcttgctc 60 cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat 120 aactccggga aaccggggct aataccggat ggttgtttga accgcatggt tcaaacataa 180 aaggtggctt cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg cattagctag ttggtgaggt 240 aacggctcac caaggcaacg atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga 300 ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccg caatggacga 360 aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt cggatcgtaa agctctgttg 420 ttagggaaga acaagtaccg ttcgaatagg gcggtacctt gacggtacct aaccagaaag 480 ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggaa 540 ttattgggcg taaagggctc gcaggcggtt tcttaagtct gatgtgaaag cccccggctc 600 aaccggggag ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc 660 acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc agtggcgaag gcgactctct 720 ggtctgtaac tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg aacaggatta gataccctgg 780 tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg gtttccgccc cttagtgctg 840 cagctaacgc attaagcact ccgcctgggg agtacggtcg caagactgaa actcaaagga 900 attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa 960 ccttaccagg tcttgacatc ctctgacaat cctagagata ggacgtcccc ttcgggggca 1020 gagtgacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc 1080 gcaacgagcg caacccttga tcttagttgc cagcattcag ttgggcactc taaggtgact 1140 gccggtgaca aaccggagga aggtggggat gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct 1200 gggctacaca cgtgctacaa tggacagaac aaagggcagc gaaaccgcga ggttaagcca 1260 atcccacaaa tctgttctca gttcggatcg cagtctgcaa ctcgactgcg tgaagctgga 1320 atcgctagta atcgcggatc agcatgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac 1380 cgcccgtcac accacgagag tttgtaacac ccgaagtcgg tgaggtaacc ttttaggagc 1440 cagccgccga atgtgacaag 1460

Claims

신규 미생물 바실러스 써브틸리스(Bacillus subtilis) JG46(수탁번호: KACC 92271P) 균주.
제1항에 있어서,
상기 균주는 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 16S rRNA 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 바실러스 써브틸리스(Bacillus subtilis) JG46(수탁번호: KACC 92271P) 균주.
제1항에 있어서,
상기 균주는 고사리 신규 마름병균인 디디멜라 속(Didymella sp.) 병원균에 대해 길항력을 갖는 것을 특징으로 하는 바실러스 써브틸리스(Bacillus subtilis) JG46(수탁번호: KACC 92271P) 균주.
제3항에 있어서,
상기 균주는 배추 무사마귀병균(Plasmodiophora brassicae), 수박 줄기마름병균(Didymella bryoniae), 인삼 균핵병균(Sclerotinia minor), 인삼 탄저병균(Colletotrichum gloeosporioides), 인삼 반점병균(Alternaria panax) 및 딸기 시들음병균(Fusarium oxysporum)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 병원균에 대한 항진균 활성을 더욱 갖는 것을 특징으로 하는 바실러스 써브틸리스(Bacillus subtilis) JG46(수탁번호: KACC 92271P) 균주.
제4항에 있어서,
상기 균주는 바나나 시들음병균(Xanthomonas campestris) 또는 딸기 세균모무늬병균(Xanthomonas fragariae)에 대한 항균 활성을 더욱 갖는 것을 특징으로 하는 바실러스 써브틸리스(Bacillus subtilis) JG46(수탁번호: KACC 92271P) 균주.
제5항에 있어서,
상기 균주는 식물 생육 촉진능을 더욱 갖는 것을 특징으로 하는 바실러스 써브틸리스(Bacillus subtilis) JG46(수탁번호: KACC 92271P) 균주.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 미생물, 이의 배양액 또는 배양 추출액을 유효성분으로 함유하는 미생물 제제.