CN109845573A - 一株云芝菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种云芝新菌株，它是由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的保藏号：CGMCC No.15880的云芝栓孔菌Trametes Versicolor。本发明还公开了一种云芝的栽培方法。将本发明云芝新菌株与对照野生云芝菌株栽培种植后的数据相比，云芝1号生产周期缩短13天，产量达到75.32g/kg袋料，比对照菌株增产15.37％以上，浸出物、多糖含量分别比对照增加5.85％和10.43％，工厂化生产应用前景良好。

Description

一株云芝菌株及其应用

技术领域

本发明涉及一株云芝菌株及其应用，属于食用菌领域。

背景技术

云芝[Coriolus uersicolor(L.:Fr.)Quel.]收录于《本草纲目》(28卷)，具有“扶正固本、补益精气”的功效。《中国药典》记载云芝具有“健脾利湿，清热解毒”的功效，主要用于治疗湿热黄疸，胁痛，纳差，倦怠乏力等症。现代医学表明云芝具有调节免疫、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化等多种功效。

野生云芝生于阔叶树腐木或枯枝上，在我国分布广泛，在黑龙江、河北、山西、山东、江苏、福建、四川及云南等21个省份和4个自治区均有分布。我国的云芝药材主要来源于野生采集，但是野生采集云芝品质不稳定，价格昂贵，对生态环境破坏较大，产量逐年下降，产量和品质已不能满足市场需求。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一株新的云芝菌株及其在栽培种植中的应用。

本发明云芝菌株，它是由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的保藏号：CGMCC No.15880的云芝栓孔菌Trametes Versicolor。

本发明云芝栓孔菌Trametes Versicolor，于2018年7月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏号为CGMCC No.15880。

本发明还提供了一种云芝的栽培原料组合物，其特征在于：它是由如下原料质量百分比组成的：木屑30-50份，棉籽壳30-60份，玉米芯10-20份，麦麸8-12份，石膏1-2份，石灰1-2份。

进一步地，它是由如下原料质量百分比组成的：木屑38份，棉籽壳40 份，玉米芯10份，麦麸10份，石膏1份，石灰1份。

本发明最后提供了一种云芝的栽培方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)菌袋制作：按前述配比称取原料，将棉籽壳、玉米芯用水预湿12h～ 24h，再混入其他原料、拌匀、堆沤、调pH值、装袋，将菌袋分层堆码灭菌，冷却备用；

(2)接种：取前述菌种，接入菌袋，封口，转移至发菌室；

(3)发菌管理：菌袋分层堆码于发菌室，菌丝过肩后翻堆，菌丝长满菌袋移至出菇棚；

(4)出芝期管理：将菌袋分层堆放于出菇架上，打开菌袋口，控制出菇棚湿度在80-90％；

(5)采收烘干：当菌盖边缘的白色或乳白色生长圈消失，菌盖由薄变厚，颜色由浅黄变深棕或褐色，菌盖变硬时，采收，烘干；

(6)转潮管理：采收结束，出菇棚停止喷水，保持温度，2-3d后提高湿度，菌袋原基处长出子实体时，按照步骤(4)出菇棚环境培养管理，采收得第二潮云芝，循环往复得第三潮云芝。

进一步地，步骤(1)所述拌匀后的水分含量为65％-70％；和/或，所述堆沤时间为3d；和/或，所述调pH值是以石灰水调节pH至6.5；和/或，所述分层堆码料袋之间空隙为2cm；和/或，所述灭菌为常压灭菌24小时；和/或，所述冷却为温度冷至30℃。

更进一步地，所述堆码的定义是将物品整齐、规则地摆放成货垛的作业。

进一步地，步骤(2)所述接种的工具、菌袋及装有菌株的栽培种瓶用优氯净消毒粉熏蒸30min；和/或，所述接种的操作为无菌操作；和/或，所述菌种的用量为每650ml栽培种瓶接10袋栽培袋；和/或，所述发菌室是经过消毒处理的。

进一步地，步骤(3)所述菌袋分层堆码高度为6层，菌袋之间空隙为2cm；和/或，所述发菌室温度为23-26℃，空气湿度为50-70％，二氧化碳浓度为 200-500ppm；和/或，所述翻堆时剔除生长状态不良和被污染的菌袋。

进一步地，步骤(4)所述出菇架上每层堆放两层菌袋；和/或，所述出菇棚在出芝期时环境温度控制在25-28℃，保持出菇棚通风，到出芝阶段时，保持菇棚内有散射光，光照强度控制在500-2000lx。

进一步地，步骤(6)所述保持温度在25-28℃；和/或，所述湿度提高至 80-90％；和/或，所述菌袋原基处长出子实体的时间是提高湿度后7-10d。

更进一步地，所述栽培方法为袋式熟料栽培，菌袋规格为 17cm×33cm×0.05cm。

本发明云芝菌株在多点试验中，与对照野生云芝菌株相比，生产周期缩短13天，产量达到75.32g/kg袋料，比对照菌株增产15.37％以上，浸出物、多糖含量分别比对照增加5.85％和10.43％，工厂化生产应用前景良好。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1云芝1号选育过程示意图

具体实施方式

实施例1本发明云芝栓孔菌Trametes Versicolor的来源与选育过程

1、品种来源

云芝1号来源于四川江油地区的一株野生云芝样本，经组织分离、驯化栽培而得。

2、选育过程

2007-2010年，课题组分别在四川江油市、雅安州、攀枝花市、西昌市、广元市等地采集野生云芝27份。经子实体组织分离，获得纯培养物22份。

2010年，课题组针对纯化的22份云芝培养物进行了驯化栽培，并获得生产性能较优的云芝菌株12份。

2011-2012年，课题组进一步对上述12份菌株开展比较试验，通过对子实体产量和内在品质(多糖、浸出物等)的比较，筛选获得1个综合性状优良的菌株——云1，命名为“云芝1号”。

2013-2014年，以野生云芝菌株云20为对照，对云芝1号进行了连续两年的品种多点试验和一年生产试验。已完成的试验结果表明，云芝1号遗传性状均稳定一致，其干燥子实体符合《中华人民共和国药典》(2010年版一部) 标准，与对照相比具有适应性强，生产周期较短，产量高，内在品质优的特点。选育过程见图1。

将选育得到的云芝，命名为云芝1号，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。

实施例2本发明云芝栓孔菌Trametes Versicolor的品种特征特性

本发明云芝菌株，是由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的保藏号：CGMCC No.15880的云芝栓孔菌Trametes Versicolor。

1、孢子形态：孢子卵圆形，长5-7μm，直径2-3μm，壁两层，外壁平滑无色，内壁浅褐色。

2、菌丝体形态：菌丝浓白、粗壮，具有锁状联合，异宗结合。

3、性状：具典型的彩绒革盖菌Coriolus versicolor(L.ex Fr.)Quel形态特征。菌盖单个呈扇形、半圆形或贝壳形，常数个叠生成莲座状；直径3-7 cm，厚l-4mm。表面整体呈黑褐色，密生灰、褐、黑色的绒毛(菌丝)，构成多色的狭窄同心性环带，边缘薄；腹面浅灰色，无菌管处呈白色，菌管密集，管口近圆形至多角形，部分管口开裂成齿。革质，不易折断，断面菌肉类白色，厚0.8-1.2mm；菌管单层，长0.5-2mm，多为浅棕色，管口近圆形至多角形，每lmm有3-5个。气微，味淡。

4、生产周期：生产周期短，118天(子实体采收3潮)，接种后28-32 天长满菌袋，原基分化时间10-15天，原基分化到子实体成熟30-35天。5、子实体产量：绝对生物转化率可达7％以上，较对照菌株云20增产10％以上。

5、内在品质：显微形态、特征成分鉴别均符合药典规定；水分9.6％(药典规定应不得过13％)，总灰分1.2％(药典规定应不得过6.0％)，酸不溶性灰分0.1％(药典规定应不得过4.0％)，浸出物20.2％(药典规定应不得少于 18.0％)，多糖3.8％(药典规定应不得少于3.2％)均优于药典规定标准，在浸出物和多糖含量两项关键指标上，分别比对照云20(野生云芝菌株)提高8.60％和11.76％。

实施例3生产本发明云芝栓孔菌Trametes Versicolor的栽培方法

(1)菌袋的制作

栽培配方：木屑38份，棉籽壳40份，玉米芯10份，麦麸10份，石膏1 份，石灰1份。

按以上配方称取新鲜、无霉变、无虫蛀、干净、干燥的原料。将称好的棉籽壳、玉米芯用水预湿12h～24h。再将其他原料混入其中拌匀。栽培料的水分含量控制在65％-70％之间，以用手握一把料，指缝间有水滴渗出，但不滴下为宜。拌料后堆沤3d。以石灰水调节pH至6.5-7.0。将装好的菌袋分层码在灭菌灶内，袋与袋之间留2cm的空隙，以便蒸汽流通，灭菌彻底。接好通气管后用常压灭菌方法灭菌24小时，再冷却菌袋至30℃。

(2)接种

将灭菌后冷却的料袋和经75﹪酒精表面消毒的栽培种瓶和清洗干净的接种工具，放入接种箱内，用优氯净消毒粉熏蒸半小时即可接种。接种时用接种钩剔除菌种表面的老化菌层，并将菌种搅散，不可过碎，捣成花生仁大小为宜。打开料袋两端的扎口，分别接入菌种，立即封口、扎紧，周而复始。菌种散撒在料面上，用种量控制在每650ml栽培种瓶接10袋栽培袋(栽培袋规格：17cm×33cm×0.05cm)。接种过程应尽可能缩短开袋时间，做到无菌操作，严格控制，减少污染。待接种完成后将菌包转移到已消好毒的发菌室。

(3)发菌管理

把菌袋分层码在发菌室内，堆码高度为6层。袋与袋之间的空隙为2cm，以利于气体交换。发菌期温度控制在23-26℃，空气湿度控制在50-70％，二氧化碳浓度控制在200-500ppm。待菌丝过肩之后，进行翻堆，将外缘的菌袋向内移动，里层的菌袋向外移动，以便菌丝的长势相对一致。同时剔出生长状态不良和被污染的菌袋。

(4)出芝期管理

菌丝长满菌袋后即可将菌袋移到出菇棚，出菇架的每层堆放两层菌袋。将菌袋进行开口。把空气相对湿度提高至80-90％。出芝期环境温度控制在 25-28℃，每天打开通风口通风换气，保持空气新鲜。出芝阶段，保持菇棚内不要有强光照射，保证一定的散射光。光照强度控制在500-2000lx。

(5)采收烘干

当菌盖边缘的白色或乳白色的生长圈已消失，菌盖由薄变厚，颜色由浅黄变深棕或褐色，菌盖变硬时。及时进行采收，烘干。

(6)转潮管理

云芝子实体采收后，停止喷水2-3d后，提高湿度至80-90％，温度仍保持在25-28℃，待7-10d后又可在原来原基处继续长出子实体来，按照步骤(4) 出芝期管理，可以采收第二、三潮云芝。

(7)采后初加工

采收后的云芝子实体及时在50-60℃条件下烘干。

以下通过试验例说明本发明的有益效果:

试验例1本发明云芝栓孔菌Trametes Versicolor的多点试验

(一)2013年品种多点试验

1、参试品种

云芝1号(CV-1)：本课题组选育，保藏号：CGMCC No.15880。

云20(对照)：野生云芝菌株。

2、试验地点

在成都市崇州市设立两个试验点，德阳市旌阳区设立两个试验点，彭州市通济镇设立一个试验点，共5个试验点，简记为CZ1，CZ2，JY1，JY2， TJ1。

3、试验点设置

(1)选择可满足温度、湿度、光照、通气量调节要求的，近两年未出现严重病虫害的大棚。

(2)采用单因素随机区组设计，每个处理100袋，设4次重复。

4、栽培管理

同实施例3

5、观察记录

(1)物候期记录

包括菌丝满袋时间、原基分化时间、子实体成熟时间。

(2)外观形态观察

记录云芝菌株不同发育时期的外观形态，及采收子实体的形态指标。

(3)产量

记录三潮子实体的总重量(干重)，计算绝对生物转化率。

(4)内在品质

按《中华人民共和国药典》(2010年版一部)检测各品种的浸出物和多糖含量。

6、试验结果

(1)物候期记录

观察结果表明(表1)，两个菌株在不同试验点物候期相差不大；物候期的差异主要表现在菌丝期、原基期和第一潮子实体期，而在第二、三潮子实体期基本相似。在各个试验点，CV-1生产周期明显短于对照云20，平均生产周期118d；云20(对照)平均生产周期131d。

表1 2013年云芝品种比较试验物候期记录表

(2)外观形态观察

参试菌株在不同试验点的外观形态在各时期均完全一致，其中CV-1分片数中等，表面整体呈黑褐色，腹面呈浅灰色；云20(对照)分片数较多，表面整体呈浅灰褐色，腹面呈浅黄棕色。具体表现见表2。参试菌株的菌盖直径和菌盖厚度差异不明显，具体统计结果见表3。

表2 2013年云芝品种比较试验不同时期外观形态观察

表3 2013年云芝品种比较试验子实体形态指标记录表

(3)产量

CV-1与云20生物转化率及其分析比较结果见表4-8，结果显示：在5个试验点的绝对生物转化率分别达到了7.57％、7.43％、7.45％、7.54％、7.67％，与对照云20相比具有极显著性差异(p<0.01)，增产分别达到19.06％、15.37％、 18.39％、18.13％和17.14％。对CV-1进行丰产性及其稳定性分析，发现其产量高且稳定，适宜于所有云芝种植地区。

表4 2013年云芝品种比较试验产量记录表

表5 2013年品种比较试验方差分析表

变异来源	df	SS	MS	F	Prob.
						地点内区组	15	0.5654	0.0377	0.8958	0.5735
地点	4	0.1385	0.0346	0.8277	0.5176
						品种	3	34.7442	11.5814	275.2495	0.0001
品种×地点	12	0.2762	0.0230	0.5471	0.8715
						试验误差	45	1.8934	0.0421
总的	79	37.6177

表6 2013年品种比较试验各品种云芝多重比较

品种	均值(％)	5％显著水平	1％极显著水平
				CV-1	7.5335	a	A
云20	6.4055	c	C

表7 2013年品种比较试验各产地云芝多重比较

地点	均值	5％显著水平	1％极显著水平
				TJ1	6.8475	a	A
CZ1	6.8256	a	A
				JY2	6.7850	a	A
CZ2	6.7569	a	A
				JY1	6.7356	a	A

表8 2013年品种比较试验品种丰产性及其稳定性分析

(4)内在品质

①浸出物含量测定

按《中华人民共和国药典》(2010年版一部)附录X A热浸法进行测定，即：取云芝样品2-4g，称定重量，置100-250ml的锥形瓶中，精密加入水50-100 ml，塞紧，称定重量，静置1小时后，连接回流冷凝管，加热至沸腾，并保持微沸1小时。放冷后，取下锥形瓶,密塞,称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，用干燥滤器滤过。精密量取滤液25ml，置已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于105℃干燥3小时，移置干燥器中，冷却30分钟，迅速精密称定重量，以干燥品计算供试品中水溶性浸出物的含量(％)。

测定结果如表9所示，5个试验点云芝的浸出物指标均符合药典标准。其中，CV-1在5个试验点浸出物含量平均达到19.72％，平均较对照云20增加 5.85％。

表9 2013年品种比较试验浸出物含量测定

②多糖含量测定

按《中华人民共和国药典》(2010年版一部)云芝项中的含量测定方法进行，即：

总糖取本品粗粉5g，精密称定，置锥形瓶中，精密加水120ml，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，用脱脂棉滤过，精密量取滤液40ml，加酚酞指示液1-2滴，用氢氧化钠试液调节pH值至中性，加稀硫酸25ml，加热回流4小时，放冷，用氢氧化钠试液调节pH值至中性，精密加入碘滴定液(0.l mol/L)25ml，逐滴加氢氧化钠试液4ml，边加边剧烈振摇，密塞，置暗处放置10分钟，加稀硫酸4ml，立即用硫代硫酸钠滴定液(0.1mol/L)滴定，至近终点时，加淀粉指示液2ml，继续滴定至蓝色消失，并将滴定的结果用空白试验校正，即得。每1ml碘滴定液(0.1mol/L)相当于9.008mg的无水葡萄糖(C₆H₁₂O₆)。

单糖精密量取总糖项下的滤液40m l，加酚酞指示液1-2滴，用氢氧化钠试液调节pH值至中性，按总糖项下方法，自"精密加入碘滴定液(0.1mol/L) 25ml"起，同法操作。每1ml碘滴定液(0.1mol/L)相当于9.008mg的无水葡萄糖(C₆H₁₂O₆)。

总糖的含量减去单糖的含量，即为云芝多糖的含量。

测定结果如表10所示，5个试验点云芝的多糖含量指标均符合药典标准。其中，CV-1在5个试验点多糖含量平均达到3.81％，平均较对照云20增加 10.43％。

表10 2013年品种比较试验多糖含量测定

③第三方检测

CV-1和对照云20样品送四川大学华西药学院分析测试中心检测，结果如表11。CV-1所有指标均符合或优于药典标准，较对照云20浸出物含量增加8.60％，多糖含量增加11.76％。

表11 2013年品种比较试验内在品质检测

多点试验结果显示：云芝1号品系优良，生长周期短，产量较对照增产15.37％以上、浸出物和多糖两项项关键指标较对照品系提高5.85％、10.43％，内在品质符合《中华人民共和国药典》(2010年版一部)标准，总灰分3.2％ (药典规定应不得过6.0％)，酸不溶性灰分1.5％(药典规定应不得过4.0％)，浸出物20.2％(药典规定应不得少于18.0％)，多糖3.8％(药典规定应不得少于3.2％)均优于药典规定标准，适用于工厂化生产。

Claims (10)

1.一株云芝菌株，其特征在于：它是由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的保藏号：CGMCC No.15880的云芝栓孔菌Trametes Versicolor。

2.一种云芝的栽培原料组合物，其特征在于：它是由如下原料质量百分比组成的：木屑30-50份，棉籽壳30-60份，玉米芯10-20份，麦麸8-12份，石膏1-2份，石灰1-2份。

3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于：它是由如下原料质量百分比组成的：木屑38份，棉籽壳40份，玉米芯10份，麦麸10份，石膏1份，石灰1份。

4.一种云芝的栽培方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)菌袋制作：按权利要求2所述配比称取原料，将棉籽壳、玉米芯用水预湿12h～24h，再混入其他原料、拌匀、堆沤、调pH值、装袋，将菌袋分层堆码灭菌，冷却备用；

(2)接种：取权利要求1所述菌种，接入菌袋，封口，转移至发菌室；

(3)发菌管理：菌袋分层堆码于发菌室，菌丝过肩后翻堆，菌丝长满菌袋移至出菇棚；

(4)出芝期管理：将菌袋分层堆放于出菇架上，打开菌袋口，控制出菇棚湿度在80-90％；

(5)采收烘干：当菌盖边缘的白色或乳白色生长圈消失，菌盖由薄变厚，颜色由浅黄变深棕或褐色，菌盖变硬时，采收，烘干；

(6)转潮管理：采收结束，出菇棚停止喷水，保持温度，2-3d后提高湿度，菌袋原基处长出子实体时，按照步骤(4)出菇棚环境培养管理，采收得第二潮云芝，循环往复得第三潮云芝。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(1)所述拌匀后的水分含量为65％-70％；和/或，所述堆沤时间为3d；和/或，所述调pH值是以石灰水调节pH至6.5；和/或，所述分层堆码料袋之间空隙为2cm；和/或，所述灭菌为常压灭菌24小时；和/或，所述冷却为温度冷至30℃。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(2)所述接种的工具、菌袋及装有菌株的栽培种瓶用优氯净消毒粉熏蒸30min；和/或，所述接种的操作为无菌操作；和/或，所述菌种的用量为每650ml栽培种瓶接10袋栽培袋；和/或，所述发菌室是经过消毒处理的。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(3)所述菌袋分层堆码高度为6层，菌袋之间空隙为2cm；和/或，所述发菌室温度为23-26℃，空气湿度为50-70％，二氧化碳浓度为200-500ppm；和/或，所述翻堆时剔除生长状态不良和被污染的菌袋。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(4)所述出菇架上每层堆放两层菌袋；和/或，所述出菇棚在出芝期时环境温度控制在25-28℃，保持出菇棚通风，到出芝阶段时，保持菇棚内有散射光，光照强度控制在500-2000lx。

9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(6)所述保持温度在25-28℃；和/或，所述湿度提高至80-90％；和/或，所述菌袋原基处长出子实体的时间是提高湿度后7-10d。

10.根据权利要求4-9任一项所述的方法，其特征在于：所述栽培方法为袋式熟料栽培，菌袋规格为17cm×33cm×0.05cm。