CN107372119B - 一种番茄幼胚培养方法及其培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明属于幼胚培养技术领域，公开了一种番茄幼胚培养方法及其培养基，包括消毒操作：采摘番茄幼果，先经自来水充分冲洗，再用10％次氯酸钠表面灭菌15min，然后用无菌水冲洗3‑5次完成消毒操作。无菌接种：在无菌条件下进行取出幼胚、无菌接种，每瓶接种10个幼胚，随时观察生根生芽情况。对结果进行统计和比较。培养幼胚：接种后在培养温度25士1℃，每天光照12h，进行人工培养。幼苗转瓶：番茄幼苗生长，进行转瓶，使每瓶幼苗数在5株。炼苗：移栽前要打开瓶口，阴处放置1‑3天进行炼苗，幼苗移栽：苗高到5‑7cm时进行移栽，取出移栽到装有营养土的营养钵中，浇足水，保持高湿度。5‑7d后，再生植株即可正常生长发育。

Description

一种番茄幼胚培养方法及其培养基
技术领域
本发明属于幼胚培养技术领域，尤其涉及一种番茄幼胚培养方法及其培养基。
背景技术
目前，番茄营养丰富，栽培面积大，在我国农业生产和作物育种中占有非常重要的地位。而番茄的常规采种操作较为复杂，需要在番茄果实完熟后取出种子并经过充分后熟等程序才能再次播种，致使传统育种技术存在育种周期偏长、增产潜力有限等局限性。因而探索将育种周期短提高育种效率的技术手段用于番茄等重要作物的遗传上便显得十分必要和迫切。
综上所述，现有技术存在的问题是：番茄的常规采种操作较为复杂，耗时较长，番茄生长周期达到120天左右，致使育种效率极为低下。目前一般采用南繁或温室设施提高育种效率，但是番茄种子本身的特性决定其采摘后必须经历后熟才能够正常萌发，因而现有技术及手段不能从根本上缩短番茄生长周期、提高育种效率。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种番茄幼胚培养方法。
本发明是这样实现的，一种番茄幼胚培养方法，包括:
步骤一，消毒操作：按照研究方案采摘目的番茄幼果，先经自来水充分冲洗，再用10％次氯酸钠表面灭菌15min，然后用无菌水冲洗3-5次完成消毒操作。
步骤二，无菌接种：在无菌条件下进行取出幼胚、无菌接种到特定培养基上，每瓶接种10个幼胚，随时观察生根生芽情况。
步骤三，培养幼胚：接种后在培养温度25士1℃，每天光照12h，光照强度2500LX下进行人工培养。
步骤四，幼苗转瓶：番茄幼苗生长到一定程度，进行转瓶，使每瓶幼苗数在5株，不拥挤即可。
步骤五，炼苗：移栽前要打开瓶口，阴处放置1-3天进行炼苗。
步骤六，幼苗移栽：苗高到5-7cm时进行移栽，取出幼苗移栽到装有营养土的营养钵中，浇足水，保持较高湿度。5-7d后，再生植株即可正常生长发育。
进一步，所述培养基以MS为基本培养基附加1.0mg/L 6-BA、1.0mg/L GA3、0.2mg/LIAA的培养基组合。
进一步，所述胚龄为经优化试验确定的番茄幼胚培养授粉后30天。
进一步，所述培养基培养基的配制方法为：
步骤1，培养基母液的配制和保存；
以上各种营养成分的用量，除了母液Ⅰ为20倍浓缩液外，其余的均为200倍浓缩液。
上述几种母液都要单独配成1L的贮备液。其中，母液Ⅰ、母液Ⅱ及母液Ⅳ的配制方法是：每种母液中的几种成分称量完毕后，分别用少量的蒸馏水彻底溶解，然后再将它们混溶，最后定容到1L。
母液Ⅲ的配制方法是：将称好的FeSO4·7H2O和Na2-EDTA·2H2O分别放到450mL蒸馏水中，边加热边不断搅拌使它们溶解，然后将两种溶液混合，并将pH调至5.5，最后定容到1L，保存在棕色玻璃瓶中。
各种母液配完后，分别用玻璃瓶贮存，并且贴上标签，注明母液号、配制倍数、日期等，保存在冰箱的冷藏室中。
(5)生长调节剂
为了幼胚健康生长，培养基中加入生长调节剂：IAA、6-BA、GA3、KT，并且分别配成母液(0.1mg/mL)；其配制方法是：分别称取这3种物质各10mg，将GA3、KT和IAA用1mL无水乙醇预溶，将6-BA用1mL 0.1mol/L的NaOH溶液溶解，溶解过程需要水浴加热，最后分别定容至100mL，即得0.1mg/mL的母液。
步骤2，配制培养液；
用量筒或移液管从各种母液中分别取出所需的用量：母液Ⅰ为50mL，母液Ⅱ、Ⅲ、ⅣA和ⅣB各5mL。再取GA38mL、IAA2mL、6-BA 10mL、KT 5mL，与各种母液一起放入烧杯中。
步骤3，融化琼脂；
用粗天平分别称取琼脂7g、蒸糖25g，放入1000mL的烧杯中，再加入蒸馏水750mL，用电炉加热，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状。然后再将配好的混合培养液加入到煮沸的琼脂中，最后加蒸馏水定容至1000mL，搅拌均匀。
步骤4，调pH；
用滴管吸取物质的量浓度为1mol/L的NaOH溶液，逐滴滴入溶化的培养基中，边滴边搅拌，一直到培养基的pH为5.8为止(培养基的pH必须严格控制在5.8)。
步骤5，培养基的分装；
溶化的培养基应趁热分装。分装时，先将培养基倒入烧杯中，然后将烧杯中的培养基倒入锥形瓶(50mL或100mL)中。注意不要让培养基沾到瓶口和瓶壁上。锥形瓶中培养基的量约为锥形瓶容量的1/5～1/4。每1 000mL培养基，可分装25～30瓶。
培养基分装完毕后，及时用2块硫酸纸(每块大小约为9cm×9cm)中间夹1层薄牛皮纸封盖瓶口，并用线绳捆扎。
步骤6，高压灭菌；
待需要灭菌的物品码放完毕，盖上锅盖。在98kPa、121.3℃下，灭菌20min。
灭菌后取出锥形瓶，让其中的培养基自然冷却凝固。最好放置1d后再使用。
本发明的优点及积极效果为：本发明中对培养体系中的培养基类型、幼胚胚龄等因素进行了优化分析，建立了良好高效的番茄幼胚培养方法，成苗率在90％左右。经试验对比得出，同样条件下，使用传统采种方式番茄的生长周期在120天左右，而采用本发明的番茄生长周期在60天左右，采用本发明所需时间约为常规方法所需时间的一半，可以提高约一倍的育种效率。在实际番茄育种工作中，结合温室等设施条件和本发明方法一年可繁育番茄6代，而使用常规采种方法结合温室设施一年育种仅能繁育2代。本发明不但利于提高番茄育种的效率，而且在番茄的远缘杂交、基因工程等方面也具有很大的参考价值。
附图说明
图1是本发明实施例提供的番茄幼胚培养方法流程图。
具体实施方式
为能进一步了解本发明的发明内容、特点及功效，兹例举以下实施例，并配合附图详细说明如下。
本发明提供了一种培养基的配制方法，具体如下：
1、培养基母液的配制和保存
以上各种营养成分的用量，除了母液Ⅰ为20倍浓缩液外，其余的均为200倍浓缩液。
上述几种母液都要单独配成1L的贮备液。其中，母液Ⅰ、母液Ⅱ及母液Ⅳ的配制方法是：每种母液中的几种成分称量完毕后，分别用少量的蒸馏水彻底溶解，然后再将它们混溶，最后定容到1L。
母液Ⅲ的配制方法是：将称好的FeSO4·7H2O和Na2-EDTA·2H2O分别放到450mL蒸馏水中，边加热边不断搅拌使它们溶解，然后将两种溶液混合，并将pH调至5.5，最后定容到1L，保存在棕色玻璃瓶中。
各种母液配完后，分别用玻璃瓶贮存，并且贴上标签，注明母液号、配制倍数、日期等，保存在冰箱的冷藏室中。
(5)生长调节剂
为了幼胚健康生长，培养基中加入生长调节剂：IAA、6-BA、GA3、KT，并且分别配成母液(0.1mg/mL)。其配制方法是：分别称取这3种物质各10mg，将GA3、KT和IAA用1mL无水乙醇预溶，将6-BA用1mL 0.1mol/L的NaOH溶液溶解，溶解过程需要水浴加热，最后分别定容至100mL，即得0.1mg/mL的母液。
2、配制培养液
用量筒或移液管从各种母液中分别取出所需的用量：母液Ⅰ为50mL，母液Ⅱ、Ⅲ、ⅣA和ⅣB各5mL。再取GA38mL、IAA2mL、6-BA 10mL、KT 5mL，与各种母液一起放入烧杯中。
3、融化琼脂
用粗天平分别称取琼脂7g、蒸糖25g，放入1000mL的烧杯中，再加入蒸馏水750mL，用电炉加热，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状。然后再将配好的混合培养液加入到煮沸的琼脂中，最后加蒸馏水定容至1000mL，搅拌均匀。
4、调pH
用滴管吸取物质的量浓度为1mol/L的NaOH溶液，逐滴滴入溶化的培养基中，边滴边搅拌，一直到培养基的pH为5.8为止(培养基的pH必须严格控制在5.8)。
5、培养基的分装
溶化的培养基应趁热分装。分装时，先将培养基倒入烧杯中，然后将烧杯中的培养基倒入锥形瓶(50mL或100mL)中。注意不要让培养基沾到瓶口和瓶壁上。锥形瓶中培养基的量约为锥形瓶容量的1/5～1/4。每1000mL培养基，可分装25～30瓶。
培养基分装完毕后，及时用2块硫酸纸(每块大小约为9cm×9cm)中间夹1层薄牛皮纸封盖瓶口，并用线绳捆扎。
6、高压灭菌
待需要灭菌的物品码放完毕，盖上锅盖。在98kPa、121.3℃下，灭菌20min。
灭菌后取出锥形瓶，让其中的培养基自然冷却凝固。最好放置1d后再使用。
下面结合附图对本发明的结构作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的番茄幼胚培养方法，包括:
S101：消毒操作：按照研究方案采摘目的番茄幼果，先经自来水充分冲洗，再用10％次氯酸钠表面灭菌15min，然后用无菌水冲洗3-5次完成消毒操作。
S102：无菌接种：在无菌条件下进行取出幼胚、无菌接种，每瓶接种10个幼胚，随时观察生根生芽情况。
S103：培养幼胚：接种后在培养温度25士1℃，每天光照12h，光照强度2500LX下进行人工培养。
S104：幼苗转瓶：番茄幼苗生长，进行转瓶，使每瓶幼苗数在5株。
S105：炼苗：移栽前要打开瓶口，阴处放置1-3天进行炼苗。
S106：幼苗移栽：苗高到5-7cm时进行移栽，取出移栽到装有营养土的营养钵中，浇足水。5-7d后，再生植株即可正常生长发育。
所述培养基以MS为基本培养基附加1.0mg/L 6-BA、1.0mg/L GA3、0.2mg/LIAA的培养基组合。所述胚龄为番茄幼胚培养授粉后的30天。
本发明的工作原理：按照研究方案采摘目的番茄幼果，先经自来水充分冲洗，再用10％次氯酸钠表面灭菌15min，然后用无菌水冲洗3-5次完成消毒操作。接下来在无菌条件下进行取出幼胚、无菌接种等操作，每瓶接种10个幼胚，随时观察生根生芽情况。接种后在培养温度25士1℃，每天光照12h，光照强度2500LX下进行人工培养。番茄幼苗的生长，进行转瓶，使每瓶幼苗数在5株。苗高到5-7cm时进行移栽。移栽前要打开瓶口，阴处放置1-3天进行炼苗，然后取出移栽到装有营养土的营养钵中，浇足水。5-7d后，再生植株即可正常生长发育。
以上所述仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

Claims (4)

1.一种番茄幼胚培养方法，其特征在于，所述番茄幼胚培养方法包括:
步骤一，消毒操作：采摘目的番茄幼果，先经自来水充分冲洗，再用10％次氯酸钠表面灭菌15min，然后用无菌水冲洗3-5次完成消毒操作；
步骤二，无菌接种：在无菌条件下进行取出幼胚、无菌接种于培养基上，每瓶接种10个幼胚，随时观察生根生芽情况；
步骤三，培养幼胚：接种后在培养温度24-26℃，每天光照12h，光照强度2500LX下进行人工培养；
步骤四，幼苗转瓶：番茄幼苗生长，进行转瓶，使每瓶幼苗数在5株；
步骤五，炼苗：移栽前要打开瓶口，阴处放置1-3天进行炼苗；
步骤六，幼苗移栽：苗高到5-7cm时进行移栽，取出移栽到装有营养土的营养钵中，浇足水；5-7d后，再生植株即可正常生长发育；
所述培养基以MS为基本培养基附加1.0mg/L 6-BA、1.0mg/L GA3、0.2mg/L IAA的培养基组合。
2.如权利要求1所述番茄幼胚培养方法，其特征在于，所述番茄幼胚是胚龄为授粉后30天的未发育成熟胚。
3.如权利要求1所述番茄幼胚培养方法，其特征在于，所述培养基的配制方法为：
步骤1，培养基母液的配制和保存；
①ⅣA
肌醇 20000
②ⅣB
以上各种营养成分的用量，除了母液Ⅰ为20倍浓缩液外，其余的均为200倍浓缩液；上述几种母液都要单独配成1L的贮备液；其中，母液Ⅰ、母液Ⅱ及母液Ⅳ的配制方法是：每种母液中的几种成分称量完毕后，分别用少量的蒸馏水彻底溶解，然后再将它们混溶，最后定容到1L；
母液Ⅲ的配制方法是：将称好的FeSO4·7H2O和Na2-EDTA·2H2O分别放到450mL蒸馏水中，边加热边不断搅拌使它们溶解，然后将两种溶液混合，并将pH调至5.5，最后定容到1L，保存在棕色玻璃瓶中；
各种母液配完后，分别用玻璃瓶贮存，并且贴上标签，注明母液号、配制倍数、日期，保存在冰箱的冷藏室中；
(5)生长调节剂
为了幼胚健康生长，培养基中加入生长调节剂：IAA、6-BA、GA3，并且分别配成0.1mg/mL母液；其配制方法是：分别称取这3种物质各10mg，将GA3和IAA用1mL无水乙醇预溶，将6-BA用1mL 0.1mol/L的NaOH溶液溶解，溶解过程需要水浴加热，最后分别定容至100mL，即得0.1mg/mL的母液；
步骤2，配制培养液；
用量筒或移液管从各种母液中分别取出所需的用量：母液Ⅰ为50mL，母液Ⅱ、Ⅲ、ⅣA和ⅣB各5mL；再取GA3 8mL、IAA 2mL、6-BA 10mL，与各种母液一起放入烧杯中；
步骤3，融化琼脂；
用粗天平分别称取琼脂7g、蒸糖25g，放入1 000mL的烧杯中，再加入蒸馏水750mL，用电炉加热，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状；然后再将配好的混合培养液加入到煮沸的琼脂中，最后加蒸馏水定容至1 000mL，搅拌均匀；
步骤4，调pH；
用滴管吸取物质的量浓度为1mol/L的NaOH溶液，逐滴滴入溶化的培养基中，边滴边搅拌，一直到培养基的pH为5.8为止，培养基的pH必须严格控制为5.8；
步骤5，培养基的分装；
融化的培养基应趁热分装；分装时，先将培养基倒入烧杯中，然后将烧杯中的培养基倒入50mL或100mL的锥形瓶中；注意不要让培养基沾到瓶口和瓶壁上；锥形瓶中培养基的量为锥形瓶容量的1/5～1/4；每1000mL培养基，可分装25～30瓶；
培养基分装完毕后，及时用2块硫酸纸中间夹1层薄牛皮纸封盖瓶口，并用线绳捆扎；
每块硫酸纸大小为9cm×9cm；
步骤6，高压灭菌；
待需要灭菌的物品码放完毕，盖上锅盖；在98kPa、121.3℃下，灭菌20min；
灭菌后取出锥形瓶，让其中的培养基自然冷却凝固，放置1d后再使用。
4.一种权利要求3所述的番茄幼胚培养基配制方法配制的培养基。
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