CN108935087A - 一种云锦杜鹃多倍体的培育方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种云锦杜鹃多倍体的培育方法，涉及植物生物技术领域，包括如下步骤：云锦杜鹃种子灭菌后，以氨磺乐灵进行处理；种子萌发后移栽至育苗块进行培养，然后通过气孔法和流式细胞仪法检测染色体倍性变化，检测确认的染色体加倍植株移栽至温室培养，即可获得多倍体植株。采用本方法进行云锦杜鹃的多倍体的培育，诱导率高(可达30％)，变异植株成活率高(85％以上)，鉴定方法简便，可同时获得大量多倍体材料，大大提高了育种效率。

Description

一种云锦杜鹃多倍体的培育方法

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域，尤其是涉及一种云锦杜鹃多倍体的培育方法。

背景技术

云锦杜鹃是一种常绿大灌木，为中国特有的杜鹃属植物，生于海拔600-2300m的山坡、沟谷或石山等，广泛分布于浙江、江西、安徽、湖南等南方省份。云锦杜鹃花朵美丽，颜色鲜艳，根、叶、花均可入药，具有非常重要的观赏价值和药用价值。我国云锦杜鹃野生资源丰富，但品种少，尤其抗性较强的品种缺乏。培育优良新品种，对于云锦杜鹃资源开发和利用，以及提升其市场价值具有重要意义。多倍体相对二倍体，往往具有植株粗壮、花器官增大、花色更艳丽的优点，如图1-A和图1-B所示；同时多倍体相对于二倍体的植株具有抗性更强等优点，增加了花卉的观赏价值和市场价值。多倍体育种已成为花卉新品种培育的重要手段之一，在许多花卉植株中已经成功运用，但在云锦杜鹃上的运用尚未见报道。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种云锦杜鹃多倍体的培育方法，缓解了现有技术中存在的缺乏一种云锦杜鹃多倍体的培育方法的技术问题。

为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

本发明提供了一种云锦杜鹃多倍体的培育方法，包括如下步骤：云锦杜鹃种子灭菌后，以氨磺乐灵进行处理；种子萌发后移栽至育苗块进行培养，然后通过气孔法和流式细胞仪法检测染色体倍性变化，检测确认的染色体加倍植株移栽至温室培养，即可获得多倍体植株；

其中，氨磺乐灵处理云锦杜鹃种子的步骤如下：

用2.5mg·L^-1～10mg·L^-1氨磺乐灵溶液浸泡灭菌后的种子14h～24h，用无菌水清洗3～4次后播种于用无菌水浸湿的灭菌滤纸上，置于玻璃培养皿内萌发，萌发条件为温度24℃～26℃，光照强度1500lx～2000lx，光照时间12h～16h，萌发时间15d～20d；然后将萌发的种子苗移栽至直径3.8cm育苗块，在相同的条件下继续培养30d。

在本发明一个实施方案中，所述云锦杜鹃种子灭菌，包括如下步骤：取0.1～0.3g种子，用无菌水清洗1遍，加10mL～20mL，75％酒精浸泡30s；倒去酒精用无菌水清洗3～4次，加入10mL～20mL稀释1000倍的多菌灵溶液浸泡15min～30min；倒去多菌灵溶液用无菌水清洗3～4次，加10mL～20mL 10％安替福明溶液灭菌10min～15min；倒去安替福明溶液用无菌水清洗3～4次，然后以氨磺乐灵进行处理。

在本发明一个设施方案中，所述气孔法和流式细胞仪法检测染色体倍性变化包括如下步骤：剪取植株嫩叶，用10％安替福明浸泡16h～24h，撕取叶片下表皮，在光学显微镜下统计单位面积气孔数量、测定气孔大小；取同一植株叶片，提取细胞核，通过流式细胞仪测定植株倍性，染色体加倍植株即为多倍体。

在本发明一个设施方案中，所述移栽的过程包括：将倍性检测确定为多倍体的植株移至光照培养室中培养，培养条件为温度22℃～26℃，湿度75～85％，光照强度2000lx～2500lx，光照时间16h，培养时间3个月～4个月；5月～6月龄植株移至温室，炼苗2d～4d，栽入填有松针土、珍珠岩和黄泥，并且直径为10cm～15cm的花盆内，室内放置3d～5d后，移至室外遮阴棚内；所述松针土、珍珠岩和黄泥的比为4∶2∶1。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

氨磺乐灵是一种抗微管物质，能与植物微管蛋白高度亲和形成氨磺乐灵-微管蛋白复合体，并干扰细胞器的Ca²⁺运输系统，导致更多微管解聚合，抑制细胞有丝分裂，达到低浓度，高效率诱导细胞染色体加倍的效果。将氨磺乐灵应用于云锦杜鹃的染色体加倍，具有低浓度、低毒性、低成本的优点。本发明通过实验发现，以2.5mg·L^-1～10mg·L^-1氨磺乐灵溶液浸泡灭菌后的种子14h～24h，可有效诱导云锦杜鹃种子的染色体加倍。

本发明在诱导云锦杜鹃种子后，还需要对经诱导处理的云锦杜鹃进行检测，包括使用气孔法和流式细胞仪法检测染色体倍性变化，以筛选出染色体成功诱导加倍的云锦杜鹃，有针对性的对诱导成功的云锦杜鹃进行培育，避免在培育的过程中在未成功诱导的云锦杜鹃植株上浪费资源，降低了云锦杜鹃多倍体植株的培育成本。

综上所述，本发明的目的在于提供一种云锦杜鹃多倍体的培育方法。采用本方法进行云锦杜鹃的多倍体培育，诱导率高(可达30％)，变异植株成活率高(85％以上)，鉴定方法简便，可同时获得大量多倍体材料，大大提高了育种效率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1-A为云锦杜鹃二倍体植株培养5个月后形态；

图1-B为云锦杜鹃四倍体植株培养5个月后形态；

图2-A为云锦杜鹃二倍体植株叶片气孔密度和大小；

图2-B为云锦杜鹃四倍体植株叶片气孔密度和大小；

图3-A为云锦杜鹃二倍体植株叶片的DNA含量；

图3-B为云锦杜鹃四倍体植株叶片的DNA含量。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明的目的在于提供一种云锦杜鹃多倍体培育方法。采用本方法进行云锦杜鹃的多倍体的培育，诱导率高(可达30％)，变异植株成活率高(85％以上)，鉴定方法简便，可同时获得大量多倍体材料，大大提高了育种效率，在本发明一些实施方案中，按照如下步骤实施云锦杜鹃多倍体的培育方法，效果更佳。

1.云锦杜鹃种子的灭菌。取云锦杜鹃种子进行灭菌，灭菌条件和流程为：无菌水清洗，75％酒精浸泡30s；再次无菌水清洗3～4次，多菌灵溶液(稀释1000倍)浸泡15min～30min；重复无菌水清洗3～4次，10％安替福明溶液灭菌10min～15min；最后再用无菌水清洗3～4次。

2.云锦杜鹃多倍体诱导。取灭菌后的种子，用2.5mg·L^-1～10mg·L^-1氨磺乐灵溶液浸泡14h～24h，用无菌水清洗3～4次后播种于灭菌滤纸(用无菌水浸湿)上，置于玻璃培养皿内。

3.云锦杜鹃种子萌发。将播有种子的玻璃培养置于光照培养箱进行萌发，萌发条件为温度24℃～26℃，光照强度1500lx～2000lx，光照时间12h～16h，萌发时间15d～20d。

4.诱导种子苗移栽。将萌发的种子苗移至育苗块(直径3.8cm)，置于方形育苗盆内，盖上透明塑料盖子保湿，继续光照培养30d。

5.多倍体植株鉴定。采用气孔性状和流式细胞仪鉴定植株倍性。测定气孔性状，用10％安替福明浸泡嫩叶16h～24h，撕取叶片下表皮，在光学显微镜下观察气孔性状，统计单位面积气孔数量、测定气孔大小。多倍体苗木叶片气孔一般较大，如图2-A和图2-B所示，可以根据这一现象间接鉴定云锦杜鹃染色体是否加倍。

然后取同一植株叶片，通过提取液提取细胞核，染色后采用流式细胞仪测定植株倍性。经荧光染料处理的细胞核DNA所发荧光强度的强弱，就反应了细胞核DNA含量的高低，随着染色体数目的成倍增加，细胞核DNA含量必然也成倍增加，即可以根据DNA量的高低进行倍性鉴定，如图3-A和图3-B所示。

6.多倍体植株的移栽与培育。将多倍体植株从光照培养箱移至光照培养室中培养，培养条件为温度22℃～26℃，湿度75％～85％，光照强度2000lx～2500lx，光照时间16h，培养时间3个月～4个月；培养至5～6个月株龄，将植株移至温室，炼苗2d～4d，栽入填有松针土、珍珠岩和黄泥的花盆(直径10cm～15cm)内，室内放置3d～5d后，移至室外遮阴棚内继续培养。

下面结合优选实施例进一步说明本发明的有益效果。

实施例1：以天台华顶山云锦杜鹃为例。

取天台华顶山云锦杜鹃种子0.1g进行灭菌，灭菌流程为：无菌水清洗1遍，加10mL75％酒精浸泡30s；倒去酒精用无菌水清洗3次，加10mL多菌灵溶液(稀释1000倍)浸泡20min；倒去多菌灵溶液用无菌水清洗4次，加10mL 10％安替福明溶液灭菌10min；倒去安替福明溶液用无菌水清洗4次。

取灭菌后的种子于5mg·L^-1氨磺乐灵溶液浸泡14h，然后无菌水清洗3次，均匀播种于垫有灭菌滤纸的玻璃培养皿中，加无菌水湿润，用医用胶带密封培养皿，于光照培养箱内萌发，萌发条件为温度24℃，光照强度2000lx，光照时间16h，萌发时间15d。

将萌发的种子苗移栽至育苗块(直径3.8cm)，置于方形育苗盆内，盖上透明塑料盖子保湿，在上述相同条件下继续培养30d。

倍性鉴定采用气孔性状和流式细胞仪测定法。测定气孔性状时，剪取培养30天植株嫩叶，用10％安替福明浸泡嫩叶16h，撕取叶片下表皮，置于载玻片上，在光学显微镜下观察气孔，统计单位面积气孔数量、测定气孔长宽。取同一植株嫩叶2张，加0.4mL Cystain UVPrecise P(Partec)Nuclei Extraction试剂，用手术刀片切碎提取细胞核，在加入1.6mLCystain UV Precise P(Partec)staining染液染色，100μm滤网过滤后，通过CyFlowCounter(Partec)流式细胞仪检测植株染色体是否加倍。

检测染色体加倍的植株即为多倍体。将多倍体植株从光照培养箱移至光照培养室中培养，培养条件为温度24℃，湿度75％，光照强度2500lx，光照时间16h，培养时间3个月；培养至5个月，将植株移至温室，炼苗2d，栽入填有松针土、珍珠岩和黄泥的花盆(直径15cm)内，室内放置3d后，移至室外遮阴棚内继续培养即可获得云锦杜鹃多倍体大苗。

实施例2：以云南昆明云锦杜鹃为例。

除以下区别外，其他步骤和方法与实施例1相同。

取来自云南昆明云锦杜鹃种子0.2g，灭菌后用10mg·L^-1氨磺乐灵溶液浸泡24h，萌发20d，移栽至育苗块，经培养和倍性检测，将多倍体植株移栽至室外遮阴棚内继续培养。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (4)

1.一种云锦杜鹃多倍体的培育方法，其特征在于，包括如下步骤：云锦杜鹃种子灭菌后，以氨磺乐灵进行处理；种子萌发后移栽至育苗块进行培养，然后通过气孔法和流式细胞仪法检测染色体倍性变化，检测确认的染色体加倍植株移栽至温室培养，即可获得多倍体植株；

其中，氨磺乐灵处理云锦杜鹃种子的步骤如下：

用2.5mg·L^-1～10mg·L^-1氨磺乐灵溶液浸泡灭菌后的种子14h～24h，用无菌水清洗3～4次后播种于用无菌水浸湿的灭菌滤纸上，置于玻璃培养皿内萌发，萌发条件为温度24℃～26℃，光照强度1500lx～2000lx，光照时间12h～16h，萌发时间15d～20d；然后将萌发的种子苗移栽至直径3.8cm育苗块，在相同的条件下继续培养30d。

2.根据权利要求1所述的云锦杜鹃多倍体的培育方法，其特征在于，所述云锦杜鹃种子灭菌，包括如下步骤：取0.1～0.3g种子，用无菌水清洗1遍，加10mL～20mL，75％酒精浸泡30s；倒去酒精用无菌水清洗3～4次，加入10mL～20mL稀释1000倍的多菌灵溶液浸泡15min～30min；倒去多菌灵溶液用无菌水清洗3～4次，加10mL～20mL 10％安替福明溶液灭菌10min～15min；倒去安替福明溶液用无菌水清洗3～4次，然后以氨磺乐灵进行处理。

3.根据权利要求1所述的云锦杜鹃多倍体的培育方法，其特征在于，所述气孔法和流式细胞仪法检测染色体倍性变化包括如下步骤：剪取植株嫩叶，用10％安替福明浸泡16h～24h，撕取叶片下表皮，在光学显微镜下统计单位面积气孔数量、测定气孔大小；取同一植株叶片，提取细胞核，通过流式细胞仪测定植株倍性，染色体加倍植株即为多倍体。

4.根据权利要求1所述的云锦杜鹃多倍体的培育方法，其特征在于，所述移栽的过程包括：将倍性检测确定为多倍体的植株移至光照培养室中培养，培养条件为温度22℃～26℃，湿度75～85％，光照强度2000lx～2500lx，光照时间16h，培养时间3个月～4个月；5月～6月龄植株移至温室，炼苗2d～4d，栽入填有松针土、珍珠岩和黄泥，并且直径为10cm～15cm的花盆内，室内放置3d～5d后，移至室外遮阴棚内；所述松针土、珍珠岩和黄泥的比为4∶2∶1。