KR101040240B1 - 바이오리액터 배양기에 의한 조직배양 감자종서의 대량생산방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은, (A) NH₄NO₃와 KNO₃의 함량이 1~1/4로 감소된 MS배지에 탄소원 1~5중량% 첨가된 pH 8~4인 멸균 액체배지에 무균처리된 감자줄기를 접종한 후, 2000~4000Lux, 20~27℃ 조건에서 2~4주간 배양하는 감자줄기 증식단계; 및 (B) NH₄NO₃와 KNO₃의 함량이 1~1/4로 감소된 MS배지에 탄소원 3~7중량% 첨가된 pH 8~4인 멸균 액체배지에 상기 증식된 감자줄기를 접종한 후, 암실, 12~20℃ 조건에서 4~6주간 배양하는 감자종서 증식단계;를 포함하는 인공 씨감자 생산방법에 관한 것이다.

본 발명에 의해 생산된 감자종서는 바이러스 없는 씨감자의 원천 증식용으로 사용할 수 있다.

감자, 씨감자, 종서, 액체배양, 줄기증식, 인공

Description

바이오리액터 배양기에 의한 조직배양 감자종서의 대량생산 방법{Method for mass production of micro potato by bioreactor culture}

본 발명은 액체배지가 들어있는 바이오리액터 배양기내에서 무균적으로 배양한 감자줄기로부터 종서를 대량으로 생산하여 배양용기 밖으로 꺼내 바이러스가 없는 무병주 씨감자로 재배하는 방법에 관한 것이다.

감자는 전 세계 160개국에서 널리 재배되고 있는 4대 주식작물로 21세기 식품산업 발전에 가장 기대가 큰 알칼리성 식량 작물이지만 바이러스가 감염된 씨감자를 사용 할 경우 수확량이 30~80%까지 감소한다. 따라서 반드시 바이러스가 감염되지 않은 우량 씨감자를 사용해야 한다.

무바이러스 씨감자의 기본식물은 한천(agar)이 함유된 고체배지를 넣은 페트리디쉬 배양용기(직경 10 cm, 두께 3 cm 내외, 배지 100 mL 내외)에서 감자 줄기를 배양한 후 동일한 배양용기에서 종서를 만들어 사용한다(식물조직배양학회지 1992년 제19권 67-73; 한국원예학회지 1995년 제36권 46-49; 한국식물생명공학회지 2008년 제35권 63-68). 이러한 기존 배양방법은 생산원가가 많이 들고, 종서 크기가 작아 씨감자를 얻기 위해서 감자종서를 하우스나 밭에서 재배하는데 여러 가지 문제점이 있다.

종래 씨감자는 조직배양 감자종서(무균 인공 씨감자)를 하우스에서 상토 또는 수경 재배에 의해 소형의 씨감자(기본종)를 생산하여 하우스에서 망실재배를 3년 정도 시행한 후 고랭지에서 2회 정도 노지재배 하여 농가에 공급되고 있다. 이와 같은 체계는 조직배양 한 감자종서로부터 농가에 공급하는 보급용 씨감자를 생산하는데 5-7년 정도 걸리는 단점이 있다. 장기간 시간이 필요한 이유는, 원인은 최초 조직배양 감자종서를 생산하는데 많은 경비와 시간이 걸리고 아직까지 대량으로 생산하는 시스템이 정립되지 않았기 때문에 여러 번의 증식과정이 필요하다(농촌진흥청 홈페이지 의 고령지연구소 자료 참조).

바이오리액터 배양기는 액체배지를 수 리터에서 수백 리터 넣어 배양할 수 있는 배양기로 배양체를 값싸게 대량으로 생산하는데 유리하다. 하지만 이 배양법은 배양기술이 복잡하고 시설비가 많이 드는 단점이 있어 잘 사용하지 않고 있다.

감자의 경우 감자줄기를 바이오리액터 액체배지에서 배양할 경우 먼저 줄기를 증식시키면서 키우고 이 줄기에 종서가 생기도록 배지를 교환해 주고, 어둡고 저온인 환경으로 옮겨야 하는 어려움이 있다. 또한, 감자줄기를 증식시킬 때 한두 마디 크기로 여러 조각으로 나누어 무기영양소와 탄소원(주로 설탕) 등이 첨가된 액체배지에서 배양하므로 줄기의 절단된 부위로 액체배지가 들어가면 감자줄기의 생장에 많은 어려움이 있다.

식물조직배양은 배양용기와 배지가 완전히 멸균된 상태를 유지하면서 배양해야 하고 멸균되지 않은 배지를 사용하거나 멸균되지 않은 용기로 옮겨 키울 경우에는 바로 오염이 되어 배양체가 죽게 된다. 바이오리액터는 다량의 액체배지를 고온고압(121℃, 1.2기압)으로 멸균하기 때문에 멸균시간이 오래 걸려 멸균하는 동안 pH와 배지성분이 변하게 되어 배양체가 잘 자라지 못하는 문제점이 있다.

본 발명은 바이오리액터로 감자줄기를 배양하여 이들로부터 감자종서를 만드는 과정에서 문제가 되는 액체배지의 조제 및 배지멸균 방법을 개선하였다. 그리고 바이오리액터에서 줄기를 증식시키는 방법과 이들로부터 종서가 대량으로 생성되도록 획기적인 방법을 개발하였다. 이 방법에 의해 바이러스 없는 무병주 감자종서와 씨감자를 생산하는 비용을 줄일 수 있고, 크기가 큰 감자종서를 얻을 수 있어 이들로부터 생산된 씨감자를 2년 이내에 농민에게 공급할 수 있어 산업화하는데 매우 유리하다.

본 발명은 바이오리액터로 감자줄기를 배양하여 이들로부터 대량으로 감자종서를 얻어 씨감자로 산업화하는데 적용하는 것을 목적으로 한다. 즉 본 발명은, 감자줄기를 공간적으로 제한된 무균 배양용기인 바이오리액터에서 배양하여 감자종서가 만들어지는 배양환경에 옮겨 바이러스가 없는 종서를 저가에 대량으로 생산할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은, 감자종서를 하우스나 밭에 재배생산 하여 감자재배 농가에 공급할 수 있는 씨감자를 제공하는 것을 목적으로 한다.

전술한 과제를 해결하기 위한 본 발명은, (A) NH₄NO₃와 KNO₃의 함량이 1~1/4로 감소된 MS배지에 탄소원 1~5중량% 첨가된 pH 8~4인 멸균 액체배지에 무균처리된 감자줄기를 접종한 후, 2000~4000Lux, 20~27℃ 조건에서 2~4주간 배양하는 감자줄기 증식단계; 및 (B) NH₄NO₃와 KNO₃의 함량이 1~1/4로 감소된 MS배지에 탄소원 3~7중량% 첨가된 pH 8~4인 멸균 액체배지에 상기 증식된 감자줄기를 접종한 후, 암실, 12~20℃ 조건에서 4~6주간 배양하는 감자종서 증식단계;를 포함하는 인공 씨감자 생산방법에 관한 것이다.

본 발명에서는, 상기 단계(B)에서 감자종서 증식이 완료되기 2~7일 전에 2000~4000Lux의 광을 조사하여 종서를 녹화 숙성시키는 과정을 추가하는 것이 바람직하다.

또한 본 발명에서 상기 단계(A) 및 (B)에서의 NH₄NO₃와 KNO₃의 함량이 각각 1/3 및 1/2로 감소되도록 하는 것이 좋다.

본 발명은 상기 실시 예를 통하여 설명한 바와 같이 바이오리액터 배양기에서 감자줄기를 대량으로 증식시켜 이들로부터 종서가 생기도록 배양하여 이 감자종서를 재배하여 씨감자로 이용하는 방법에 관한 것이다.

이 방법에 의해서 감자 종서를 더 크고 (기존 고체배지 배양법의 약 3-5배) 튼튼하면서 더 싸게 (약 1/5-1/10) 대량으로 생산할 수 있게 되었다. 즉 씨감자 생산에 있어서 최초단계인 조직배양에서의 경제성과 품질에 대한 문제점을 해결하게 되었다.

본 발명에 의하면, 종래 조직배양 종서로부터 씨감자를 생산하여 농가에 공급하는 단계가 5-6단계(5-7년) 걸리는 것을 1-2단계(1-2년)로 단축하여 전보다 고품질 감자를 생산하는데 기여할 수 있게 될 것이다. 또한, 최첨단 무바이러스 감자종서와 씨감자 생산기술의 원천기술을 확보하여 세계적인 경쟁력을 확보할 수 있게 된다.

본 발명은, (1) 바이오리액터내의 액체배지를 감자줄기 및 종서 배양용으로 적합하게 제조하여 멸균할 때 배지성분이 변하지 않도록 멸균하는 단계와 (2) 바이오리액터에서 감자줄기를 증식시켜 이들로부터 감자종서를 만드는 방법에 관한 것이다.

이하 본 발명에 의한 조직배양 감자종서의 생산방법을 상세히 설명한다.

본 발명에서 감자줄기 및 종서배양에 사용된 액체배지의 성분은 기존 고체배지에서 사용하는 MS배지와 동일하지만 무기물 성분 중 NH₄NO₃와 KNO₃의 양을 1/3~1/2로 줄여(1/3~1/2 MS 배지)사용하였다(표 1).

두 성분은 MS배지에서 절대적으로 많은 양을 차지하고 있는 성분으로 이들의 양을 줄임으로 인해 두 가지 문제점을 해결하였다. 첫째는 액체배지의 농도를 낮춤으로서 절단된 감자줄기부분의 세포에 상해를 입히는 것을 방지할 수 있다. 액체배지에서는 무기물 성분 농도가 한천배지와 같이 높으면 절단된 감자줄기의 내부로 액체배지가 들어가 세포에 상해를 입혀 생장에 영향을 준다. 둘째는 5리터 이상의 MS액체배지를 멸균할 때 멸균시간이 짧으면 멸균이 제대로 되지 않고, 멸균시간이 길면 배지의 pH가 5이하로 낮아져 이 조건에서 감자줄기를 배양하면 거의 생장하지 않는다. 그러나 NH₄NO₃와 KNO₃의 양을 1/3로 줄인 1/3 MS배지는 60분 이상 멸균해도 pH가 5이하로 떨어지지 않아 감자줄기를 배양하는데 전혀 문제가 없다.

본 발명에서 감자줄기 배양은 설탕이 3%로 함유된 1/3 MS 액체배지 5 리터 이상을 넣은 바이오리액터 배양기를 사용하였고, 배지 1리터당 감자줄기의 밀도는 10개로 하였다. 또한, 감자 배양용 배지에는 식물생장조절물질을 첨가하지 않았다.

기존 감자의 줄기 및 종서 배양은 고체배지(3% 설탕이 들어 있는 MS 배지에서 4-5주 동안 형광 빛 아래의 25℃조건)에서 감자줄기를 증식시킨 후, 6-9% 설탕이 첨가된 MS 고체배지에 옮겨 어둡고 16℃인 배양조건에서 배양하면 감자줄기의 밑부분에서 감자 종서가 생성된다(도 1). 배양용기가 작은 고체배지에서는 원천적으로 감자줄기가 가늘고 약해서 종서의 수가 적고 크기도 작다.

그러나 본 발명에 의하면 배양용기가 크고 액체배지를 사용하는 바이오리액터에서 감자줄기가 굵고 크게 생장하므로 이들로부터 생성된 감자종서는 크기가 크고 개수도 많았다(도 1, 도 3). 따라서 바이오리액터 배양기로 배양한 감자종서는 고체배지에서 생산한 종서보다 튼실하여 하우스나 밭에서 재배할 경우 가뭄과 병충해에 강해 많은 양의 씨감자를 얻을 수 있다.

바이오리액터에서 감자줄기를 증식시켜 이들로부터 감자종서를 만드는 방법은 두 단계로 나누어진다. 첫 단계는 감자줄기를 배양하여 줄기만 증식시키는 단계이고, 두 번째는 증식된 줄기에서 종서가 생기게 하는 단계이다. 먼저 감자줄기 증식은 상기 방법에 의해 제조된 액체배지(3%설탕이 첨가된 1/3 MS배지)가 들어있는 바이오리액터에 1리터당 10여개의 감자줄기를 넣고 3,000Lux, 23℃ 배양실 온도 조건에서 3주간 배양하면 감자 줄기가 대략 5배 정도 증식한다(도 2). 증식된 감자줄기를 절단하여 동일한 배양조건의 바이오리액터에 나눠서 배양하면 3주마다 5배 정도의 감자줄기를 증식시킬 수 있다. 이와 같이 5리터 이상의 바이오리액터 액체배지에서 감자줄기를 증식시키는 시스템을 완성한 것은 본 발명이 처음이라고 할 수 있겠다. 이것이 가능한 것은 배지를 약하게 제조(배지농도를 1/3 정도로 줄임)하여 절단된 감자줄기의 상처부위 세포의 상해를 최소화한 것과 5리터 이상의 액체배지를 멸균할 때 멸균시간이 길어져도 pH가 5이하로 내려가지 않게 배지를 제조했기 때문이다.

증식된 감자줄기에서 종서가 형성되게 하기 위해서는 배지를 종서용 배지로 교체해 주고 배양환경을 바꿔주어야 한다. 3주간 배양한 감자줄기의 배지를 따라내고 종서형성용 배지(1/2 MS배지에 5%설탕이 첨가된 액체배지)로 교환해주고, 16℃ 온도와 어두운 암실 조건에서 배양하면 종서가 생성된다.

상기조건에서 감자종서는 배양 1주부터 생성되기 시작하여 3주정도 되면 거의 생성이 완료되고 이후에는 종서가 비대해지고 5주 정도 지나면 생장이 거의 완료된다(도 3). 5리터 이상의 대용량의 액체배지를 사용하는 바이오리액터 배양기에서 감자줄기를 배양하여 배지교환(배지농도를 높임)과 배양환경(저온과 빛이 없는 상태의 암 배양)을 바꿔서 대량의 감자종서를 효율적으로 생산하는 시스템도 본 발명이 처음이라 할 수 있다.

이하 첨부된 도면과 실시예를 참조하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 이러한 도면과 실시예는 본 발명의 기술적 사상의 내용과 범위를 쉽게 설명하기 위한 예시일 뿐, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 한정되거나 변경되는 것은 아니다. 또한 이러한 예시에 기초하여 본 발명의 기술적 사상의 범위 안에서 다양한 변형과 변경이 가능함은 당업자에게는 당연할 것이다.

실시예 1 : 바이오리액터에서 감자줄기 배양 및 증식

바이오리액터 배양기에 넣어 배양하는 최초의 감자줄기는 기존 고체배지에서 배양하고 있는 것으로 고체배지에서 감자줄기를 무균적으로 바이오리액터에 옮겨 설탕이 3%로 함유된 1/3 MS 액체배지 조건에서 배양하였다. 바이오리액터 안으로 공기의 주입은 콤퓨레셔 혹은 수족관용 에어펌프를 사용하여 용기 밑에서 계속해서 뿜어지도록 장치한다. 무균 공기의 주입을 위해 공기가 Midisart 2000 (구멍크기 0.2 ㎛)을 통과하도록 하였다. 배양환경은 23±1℃의 온도와 직사광선이 드는 남쪽으로 창이 있는 밝은 장소 또는 형광 빛으로 3,000 Lux 이상으로 하였다.

감자줄기는 잎 사이의 마디마다 액아가 있어 이 부분을 절단해서 배양하면 각각의 액아에서 하나의 줄기가 나와 생장하게 된다. 따라서 충분히 자란 줄기에는 5개 이상의 마디를 가지고 있으므로 이들을 절단하여 새 배지에서 배양하면 5배 이상의 줄기를 생산할 수 있다(도 2).

고체배지에서는 감자줄기를 절단하여 일반적으로 식물조직배양에 많이 사용하는 MS 배지에 줄기를 올려놓으면 줄기는 잘 자라 이들을 배양하여 증식시키는데 별문제가 없다. 그러나 액체배지의 경우에는 고체배지와 같은 조건으로 배양하면 전혀 생장이 이루어지지 않았다. 그 원인을 검토한 결과 고체배지에서는 절단된 부분으로 배지성분이 들어가지 않아 무기질 농도가 높은 배지를 사용해도 감자줄기의 절단된 부분으로 배지가 들어가지 않아 잘 생장하지만 액체배지의 경우 높은 농도의 배지성분이 줄기절편을 통해 내부로 들어가므로 세포들이 상해를 입히게 되어 배양하기가 힘들어진다는 사실을 알아냈다. 따라서 줄기생장에 해가 없는 적정 농도의 액체배지를 제조해야만 배양이 가능한데 본 발명에서는 배지농도를 낮춰줌으로써 감자줄기 절편을 배양하는데 성공하였다.

감자줄기 증식은 상기 방법에 의해 제조된 배지(3%설탕이 첨가된 1/3 MS배지)가 들어있는 바이오리액터에 1리터당 10여개의 감자줄기를 넣고 3,000Lux, 23℃ 배양실 온도 조건에서 배양하면 감자줄기의 성장과 함께 잎도 크게 자란다(도 2). 감자줄기와 잎이 크게 자랄수록 이들로부터 종서를 만들 때 종서는 크고 개수도 많이 생성되므로 되도록 감자줄기를 크게 키우는 것이 바람직하다. 감자줄기를 절단하여 동일한 배양조건의 바이오리액터에 나눠서 배양하면 3주마다 5배 정도의 감자줄기를 증식시킬 수 있는데 이들은 감자종서를 만드는데 사용한다.

실시예 2 : 감자줄기로부터 감자종서 대량생산

바이오리액터에서 감자줄기와 잎이 충분히 생장하면 바이오리액터내의 배지를 종서형성용 배지(1/2 MS배지에 5%설탕이 첨가된 액체배지)로 교체해 주고 종서가 생길 수 있도록 배양환경을 바꿔 주어야 한다.

먼저 배지교환은 바이오리액터에서 3주간 배양한 감자줄기의 배지를 조심해서 따라내고 종서형성용 배지로 교환해준다. 모든 작업은 무균대에서 무균적으로 해야 하므로 대량의 배지를 따라낼 때 오염되지 않도록 특히 주의한다. 새로 배지를 갈아준 바이오리액터는 배양실이 어두운 암실과 같은 곳으로 옮겨주고 온도는 16℃ 정도의 저온으로 해준다. 이러한 조건에서 감자종서는 배양 1주부터 줄기의 아래 부분부터 각각의 마디에 생성된다(도 3). 감자종서는 3주 정도까지 생성되며 그 이후에는 종서가 비대해지고 5주 정도 지나면 단단하고 충분히 비대해지므로 수확해도 좋다.

감자종서를 바이오리액터에서 꺼내기 전에 4-5일 정도 밝은 빛에서 배양하면 종서는 녹색이 되면서 더욱 단단해진다.

고체배지에서 생산된 감자종서는 대부분 0.3 g 이내의 크기이지만 액체배지에서 생산된 것은 대부분이 0.5 g 이상이고 1.0 g 이상의 것도 많았다. 이와 같이 액체배지를 사용하는 바이오리액터 배양기에서 대량의 감자종서를 생산하는 시스템은 기존 고체배지에서 종서를 생산하는 시스템보다 훨씬 효율적이다.

실시예 3 : 감자종서의 보관 및 재배

실시예 2와 같은 방법으로 얻어진 감자종서를 깨끗이 씻어 20℃ 항온실에서 표면을 건조시킨 후, 하우스내에서 상토재배하기 전까지 적정온도에 저장하였다.

감자는 25℃ 실온에서 2-3개월 동안 휴면을 하는데 온도가 낮은 곳에서 보관하면 감자는 휴면기간이 길어진다. 배양종서의 경우 연중 생산할 수 있으므로 휴면 기간을 조정하여 파종기에 맞춰 싹을 틔워서 상토에서 재배한다.

감자종서의 휴면기간은 2기작 조생종인 추백과 대지는 20-25℃에서는 60일 정도이고 15℃에서는 90일정도 소요되었다(도4). 1기작 품종인 수미와 대서는 20-25℃ 이상에서는 90일 정도 걸리고 15℃에서는 110일 정도 소요되었고, 보라색 감자인 자심은 이들보다 좀 더 휴면기간이 길었다. 그리고 모든 감자종서를 5-10℃ 저온에서 보관할 경우 6개월 이상 싹이 틔지 않아 장기간 보관하는 것이 가능하다. 따라서 연중 배양실에서 생산한 감자종서는 저온에 저장한 후 파종기에 맞춰 휴면타파를 하여 싹을 틔워 파종할 수 있는 편리한 점이 있다(도 4).

싹을 틔운 감자종서는 온실이나 노지에 재배하면 식용으로 사용할 수 있을 정도로 자라 수확해서 먹을 수 있다(도 5). 감자종서를 재배해 수확한 감자는 바이러스가 없는 씨감자이므로 식용으로 사용하는 것보다 식용감자보다 작은 크기로 많이 생산하여 씨감자로 사용하는 것이 좋다(도 5).

도 1은 본 발명의 고체배지에서 배양한 종서와 바이오리액터에서 배양한 종서의 크기를 비교한 사진.

도 2는 본 발명의 액체배지의 바이리액터에서 감자줄기를 배양하여 증식시키는 과정을 보여주는 사진.

도 3은 본 발명의 바이오리액터 배양기에서 감자줄기로부터 무병주 감자종서를 대량으로 배양한 결과를 보여주는 사진.

도 4는 본 발명의 바이오리액터에서 생산된 감자종서와 이들을 싹틔워 상토에 재배하는 모습을 보여주는 사진.

도 5는 본 발명의 무병주 감자종서를 밭에서 재배하여 씨감자를 수확하는 상황(좌 상)과, 수확한 씨감자를 무균 건조대에서 건조시켜(우) 보관하는 과정(좌하)을 보여주는 사진.

Claims (3)

1. (A) 배지 1L 당 NH₄NO₃ 550~825 mg과 KNO₃ 630~950 mg을 사용하여 제조한 MS배지에 설탕 1~5중량%가 첨가된 pH 8~4인 멸균 액체배지에 무균처리된 감자줄기를 접종한 후, 2000~4000Lux, 20~27℃ 조건에서 2~4주간 배양하는 감자줄기 증식단계; 및

   (B) 배지 1L 당 NH₄NO₃ 550~825 mg과 KNO₃ 630~950 mg을 사용하여 제조한 MS배지에 설탕 3~7중량%가 첨가된 pH 8~4인 멸균 액체배지에 상기 증식된 감자줄기를 접종한 후, 암실, 12~20℃ 조건에서 4~6주간 배양하는 감자종서 증식단계;

   를 포함하는 것을 특징으로 하는 인공 씨감자 생산방법.
2. 제 1 항에 있어서,

   상기 단계(B)에서 감자종서 증식이 완료되기 2~7일 전에 2000~4000Lux의 광을 조사하여 종서를 녹화숙성시키는 것을 특징으로 하는 인공 씨감자 생산방법.
3. 삭제

Images