CN103404364A - 一种灰树花液体菌种培养及高产栽培的方法 - Google Patents

Abstract

一种灰树花液体菌种培养及高产栽培的方法，属于食用菌栽培学领域。我们着眼于进行灰树花深层发酵技术与灰树花优质高产栽培相结合的研究。我们经过几年的研究、反复实验终于研究成功了灰树花液体菌种规模化生产新技术，该技术不仅可以大大缩短菌种的制种时间，提高菌种质量，降低菌种生产成本，提高子实体品质、产品质量和商品价值等等，而且投资少，技术易掌握，适合我国国情，具有很高的推广价值。

Description

一种灰树花液体菌种培养及高产栽培的方法

技术领域

一种灰树花液体菌种培养及高产栽培的方法，属于食用菌栽培学领域。 

背景技术

在灰树花[Grifola frondosa (Fr.) S. F. Gray]，又名贝叶多孔菌，俗称栗子蘑、莲花菇、舞茸等，在分类系统中属于担子菌亚门、层菌纲、非褶菌目、多孔菌科、树花属。灰树花子实体形似盛开的莲花，扇形菌盖重重叠叠，鲜嫩的子实体香味浓郁，味道鲜美，口感极佳。其营养丰富，富含灰树花多糖、维生素、必需氨基酸和微量元素，经常食用可预防和治疗肝脏系统及胃肠道疾病，既是营养补品，又具有抗癌作用，是一种具有很高开发价值的珍贵食用兼药用的菌类。灰树花野生量极少，几乎不能形成商品。1974年日本进行人工栽培获得成功，在1981年日本主要利用空调设备在室内进行周年栽培，生物学效率最高可达40%左右。我国最早是浙江庆元县在1983年从日本引进菌种进行栽培，生物学效率未突破40%。据记载在80—90年代国内许多单位和个人多次组织研究探索灰树花的人工驯化栽培，获得了纯菌种，但子实体分化不好，产量低，没有成功。90年代初国内一些单位利用固体菌种进行仿野生栽培法，虽然生物学效率达到80%，但普遍存在着生产周期长、污染机会多、转代次数多，菌种易退化等问题，这种生产技术远远不能适应激烈的市场竞争，无法同国际的同行业竞争。面对入世给食用菌产业带来的机遇和挑战与技术落后现状，我们必须在技术上有所突破和创新。我们着眼于进行灰树花深层发酵技术与灰树花优质高产栽培相结合的研究，在灰树花的生产上用液体菌种直接接在栽培袋上养菌出菇，改变了传统的用固体菌种生产的方法。我们经过几年的研究、反复实验终于研究成功了灰树花液体菌种规模化生产新技术，该技术不仅可以大大缩短菌种的制种时间，提高菌种质量，降低菌种生产成本，提高子实体品质、产品质量和商品价值等等，而且投资少，技术易掌握，适合我国国情，具有很高的推广价值。同时灰树花液体菌种培养技术在其大规模栽培上也得到应用推广。 

此处键入技术领域描述段落。 

发明内容

一、灰树花液体菌种培养技术工艺的研究 

（一）灰树花母种培养基筛选的研究

灰树花[Grifola frondosa (Fr.) S. F. Gray]，是一种很有开发价值的食用兼药用真菌，为了更好地进行人工栽培，我们进行了灰树花母种培养基的筛选试验，得到了比较满意的效果，现将试验结果报告如下：

   1  材料与方法　

1.1  供试菌种  灰树花菌株YtGf-1，由烟台师范学院食用真菌研究所提供并保存。

1.2  初筛培养基　 

A、PDA培养基:马铃薯（去皮）200g,葡萄糖20g，琼脂20g，水1000ml，PH值5.5-6.5；

B、马铃薯综合培养基: 马铃薯（去皮）200g, 麦麸50g , 葡萄糖20g，KH₂PO₄ 2.0g，MgSO₄ 1.0g,蛋白胨5.0g, VB₁0.01g，琼脂20g,水1000ml，PH值5.5-6.5；                              

C、玉米粉综合培养基：玉米粉50g,葡萄糖20g, KH₂PO₄ 2.0g，MgSO₄ 1.0g  琼脂20g，水1000ml，PH值5.5-6.5；

D、马铃薯棉籽壳培养基：马铃薯（去皮）200g，棉籽壳100g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000ml，PH值5.5-6.5；

E、马铃薯木屑培养基：马铃薯（去皮）200g，木屑（阔叶树）100g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000ml，PH值5.5-6.5；

F、马铃薯菌糠培养基：马铃薯（去皮）200g，菌糠（灰树花）100g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000ml，PH值5.5-6.5；

1.3             复筛培养基

1、初筛培养基E（木屑培养基）+（NH₄）₂SO₄1.0g

2、初筛培养基E（木屑培养基）+ KH₂PO₄ 1.0g

3、初筛培养基E（木屑培养基）+ MgSO₄1.0g

4、初筛培养基E（木屑培养基）+VB₁0.01g

5、初筛培养基E（木屑培养基）+（NH₄）₂SO₄1.0g

+KH₂PO₄ 1.0g + MgSO₄1.0g + VB₁0.01g

1.4  试验方法  棉籽壳、木屑、菌糠需要文火煮沸1h，其它过程和其它培养基的配制均按常规方法制成斜面。斜面长度10cm，每一配方设10次重复。在无菌条件下接入大小相同的0.5cm²的灰树花菌种。26⁰C恒温培养。当菌丝萌发后表现出良好的生长时，在试管壁上划线，观察并记录菌丝萌发情况、生长密度、满管天数。

2  结果与分析 

2.1  灰树花母种培养基的初筛  灰树花菌丝在不同培养基的生长情况见表1。 

  

表1  灰树花菌丝在初筛培养基的生长情况

从表1中可以看出，灰树花在马铃薯综合培养基和马铃薯木屑培养基上萌发早，生长速度较快。在马铃薯综合培养基、马铃薯棉籽壳培养基和马铃薯木屑培养基上菌丝生长浓密，但菌丝在马铃薯木屑培养基上生长速度快，所以选择马铃薯木屑培养基作为复筛培养基。

2.2            灰树花母种培养基复筛  

表2  灰树花菌丝在复筛培养基上的生长情况

从表2中可以看出，（1）不同添加物对灰树花菌丝的萌发时间、生长密度影响不大。（2）向复筛培养基中添加（NH₄）₂SO₄，不利于灰树花菌丝的生长，向复筛培养基中添加VB₁，对菌丝的生长影响不大。（3）向复筛培养基中添加KH₂PO₄或MgSO₄，则有利于菌丝的生长。

3                  小结 

3.1 本文筛选的马铃薯木屑培养基、马铃薯综合培养基比其他培养基更适合灰树花菌丝的生长。

3.2 用该配方制作灰树花母种，菌丝浓密，生长速度快，长势好。 

3.3 向马铃薯木屑培养基中添加不同物质时，对灰树花菌丝的生长有不同的作用。向复筛培养基中添加KH₂PO₄或MgSO₄，则有利于菌丝的生长。 

  

（二）灰树花液体培养营养条件以及培养基筛选的研究

1、灰树花液体培养对碳源、氮源、无机盐的筛选研究

目前，国内已开展了灰树花栽培技术、生态特性与营养分析等多方面的研究，但有关灰树花液体培养条件的研究报道较少，对灰树花碳源、氮源、无机盐利用的系统研究尚未见报道。我们系统地对灰树花液体培养的碳源、氮源、无机盐进行了筛选研究，现将实验结果归纳如下：

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  供试菌种  灰树花菌株YtGf-1，由烟台师范学院食用真菌研究所提供并保存。

1.1.2  斜面培养基（马铃薯综合培养基）  马铃薯（去皮）20%, 麦麸5% , 葡萄糖2%，KH₂PO₄ 0.2%，MgSO₄ 0.1%,蛋白胨0.5%, VB₁0.001%，琼脂2%。 

1.1.3  液体种子培养基  马铃薯（去皮）20%，葡萄糖2%，蛋白胨0.5%，KH₂PO₄0.2%，MgSO₄0.1%，VB₁0.002%。 

1.1.4  发酵培养基础培养基  KH₂PO₄0.2%、VB₁0.002%、葡萄糖2%、蛋白胨0.5%、MgSO₄0.1%。 

1.2  试验方法 

1.2.1  液体菌种的制备  将刚长满管的斜面菌种接种于液体培养基中，在25⁰C恒温箱中静置24h，然后在25⁰C、180r/min旋转式摇床振荡培养7d，作为液体菌种。

1.2.2  菌丝干重的测量  将培养好的菌液经干燥的脱脂棉过滤后得菌丝体，用蒸馏水冲洗干净，放于60⁰C干燥箱中烘至恒重后测重。 

1.2.3  碳源的筛选试验  我们选择了葡萄糖、果糖、木糖、半乳糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、纤维二糖、玉米淀粉、麦麸、玉米粉、木屑12种碳源作比较，试验浓度为2%。采用去葡萄糖的基础培养基为基质，以无碳源为对照，每种碳源3次重复。在500ml三角瓶中装入150ml培养液，灭菌后按10%的接种量进行接种。然后，放在25⁰C的培养箱中静置培养24小时，再放在25⁰C，180r/min摇床上振荡培养5d，测量菌丝体的干重。 

1.2.4  氮源的筛选试验  我们将液体培养基中的氮源分别换成0.5%酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、黄豆粉、玉米粉、麦麸、NH₄Cl、      （NH₄）₂SO₄, NH₄NO₄, KNO₄10种氮源，以无氮源作为对照，每种氮源3次重复。在500ml三角瓶中装入150ml培养液，灭菌后按10%的接种量进行接种。然后，放在25⁰C的培养箱中静置培养24h，再放在25⁰C，180r/min摇床上振荡培养5d，测量菌丝体的干重。 

1.2.5  无机盐的筛选试验  将液体培养基中的无机盐分别换成0.2%KH₂PO₄ ，MgSO₄ ,CaSO₄ ,ZnSO₄ ,FeSO₄ ， MnSO₄ 6种无机盐，以去无机盐的基础培养基为对照，每种无机盐3次重复。在500ml三角瓶中装入150ml培养液，灭菌后按10%的接种量进行接种。然后，放在25⁰C的培养箱中静置培养24h，再放在25⁰C，180r/min摇床上振荡培养5d，测量菌丝体的干重。 

2  结果与分析 

2.1  碳源筛选试验   本试验分别用2%葡萄糖、果糖、木糖、半乳糖、麦芽糖、乳糖、纤维二糖、蔗糖、玉米淀粉、麦麸、玉米粉、木屑作为灰树花液体培养基中的碳源，观察菌丝体生长状态。各种碳源对灰树花菌丝体生长的影响见表3。

  

表3  不同碳源对灰树花菌丝体生长的影响

方差分析表明，各组菌丝体干重的差异有显著性意义（P<0.05），说明所试碳源对灰树花菌丝体生长的影响有较明显的差异。从表3可以看出，灰树花对碳源的利用相当广泛，对单糖、双糖、多糖均可利用，这与已报道的灰树花生长发育的条件相同，也符合真菌的生理代谢过程。灰树花可以直接吸收利用的是单糖，其它形式的糖类只有经过菌丝分泌的酶分解成单糖以后，才能被吸收利用。在单糖中，对葡萄糖的利用最好，其次是果糖，而对半乳糖的利用最差；在双糖中，对麦芽糖的利用最好，对蔗糖的利用较差；在多糖中，玉米淀粉、麦麸是灰树花最好的碳源。

2.2  氮源筛选试验   本试验分别用0.5%酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、黄豆粉、玉米粉、麦麸、NH₄Cl,（NH₄）₂SO₄, NH₄NO₄, KNO₄10种氮源作为灰树花液体培养基中的氮源，观察菌丝体生长状态。各种氮源对灰树花菌丝体生长的影响见表4。 

  

表4  不同氮源对灰树花菌丝体生长的影响

方差分析表明，各组菌丝体干重的差异有显著性意义（P<0.05），说明不同氮源对灰树花菌丝体生长的影响有明显差异。从表4可以看出，灰树花对有机氮的利用强于无机氮。有机氮以天然农副产品中的黄豆粉、麦麸为最好，其次是玉米粉、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏等。在无机氮中，灰树花对铵态氮和硝态氮均可以利用，但对铵态氮的利用略强于对硝态氮的利用。

2.3  无机盐筛选试验   本试验将液体培养基中的无机盐分别换成0.2%KH₂PO₄ ，MgSO₄ ,CaSO₄ ,ZnSO₄ ,FeSO₄ ， MnSO₄ ，观察菌丝体生长状态。不同无机盐对灰树花菌丝体生长的影响见表5。 

  

表5  不同无机盐对灰树花菌丝体生长的影响

方差分析表明，各组菌丝体干重的差异有显著性意义（P<0.05），说明不同无机盐对灰树花菌丝体生长的影响有明显差异。它们对灰树花菌丝体生长的影响依次为MgSO₄＞KH₂PO₄＞CaSO₄＞ZnSO₄＞MnSO₄＞FeSO₄。可见，Mg、P、K对灰树花菌丝体生长的影响较大，Fe对菌丝体的影响很微弱。

3  小结 

3.1  试验结果表明葡萄糖是灰树花液体培养最好的碳源。玉米淀粉、麦麸、玉米粉等农副产品也是良好的碳源，因其价格低廉，在生产中可以代替葡萄糖作为碳源，以降低成本。

3.2  酵母膏、蛋白胨、牛肉膏等有机氮源富含各种氨基酸，可直接被菌丝体吸收利用。利用这些多组分的复合氮源，菌丝体生长快，生物量较高。利用无机氮源时，菌丝体生长缓慢，这和大多数食用菌对氮素的利用是一致的。 

3.3  灰树花菌丝体在麦麸、黄豆粉、玉米粉等天然植物氮源中生长最好。这些氮源中可能含有丰富的蛋白酶及多种生长刺激因子，而且也有可能由于灰树花菌丝体分泌的蛋白酶较适合于这些植物蛋白。在生产中，采用黄豆粉、麦麸、玉米粉等作为灰树花生长的主要氮源，其效果好，价格低。 

3.4  不同无机盐对灰树花菌丝体生长的影响有明显差异。其中Mg、P、K对灰树花菌丝体生长的影响较大，Fe对菌丝体几乎没有影响。 

2、灰树花液体培养最适C/N比试验研究 

我们在系统地对灰树花液体培养的碳源、氮源进行了筛选研究的基础上，又对其最适C/N比进行了试验，现将实验结果总结如下：

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  供试菌种  灰树花菌株YtGf-1，由烟台师范学院食用真菌研究所提供并保存。

1.1.2  斜面培养基（马铃薯综合培养基）  马铃薯（去皮）20%, 麦麸5% , 葡萄糖2%，KH₂PO₄ 0.2%，MgSO₄ 0.1%,蛋白胨0.5%, VB₁0.001%，琼脂2%。 

1.1.3  液体种子培养基  马铃薯（去皮）20%，葡萄糖2%，蛋白胨0.5%，KH₂PO₄0.2%，MgSO₄0.1%，VB₁0.002%。 

1.1.4  发酵培养基础培养基  KH₂PO₄0.2%、VB₁0.002%、葡萄糖2%、蛋白胨0.5%、MgSO₄0.1%。 

1.2  试验方法 

1.2.1  液体菌种的制备  将刚长满管的斜面菌种接种于液体培养基中，在25⁰C恒温箱中静置24h，然后在25⁰C、180r/min旋转式摇床振荡培养7d，作为液体菌种。

1.2.2  菌丝干重的测量  将培养好的菌液经干燥的脱脂棉过滤后得菌丝体，用蒸馏水冲洗干净，放于60⁰C干燥箱中烘至恒重后测重。 

1.2.3  最适C/N比试验  保持发酵培养基础培养基中的碳源浓度不变，去蛋白胨，按C/N比分别为3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、35、40、45、50添加硫酸铵。在500ml三角瓶中装入150ml发酵培养液，灭菌后按10%的接种量进行接种。然后，放在25⁰C的培养箱中静置培养24小时，再放在25⁰C，180r/min摇床上振荡培养5d，测量菌丝体的干重。 

1.2.4  最适C/N下碳源不同浓度的试验  以最适C/N比为基准，按葡萄糖（碳源）0.4%、硫酸铵0.02%递增，进行液体培养5d后，观察灰树花菌丝的生长情况，并测菌丝体干重。 

2、 结果与讨论 

1）不同C/N比对灰树花菌丝体生长的影响见表6和图1。

  

表6  不同C/N比对灰树花菌丝体生长的影响

从以上可以看出，灰树花菌丝体在C/N比为15:1至35:1的范围内生长较好，在21:1达到最大值。当C/N比超过35:1，菌丝生长量急剧减少。

2）最适C/N比下碳源不同浓度对灰树花菌丝生长的影响见图2。 

    从图2可以看出，灰树花菌丝体在液体培养时，其C/N比固定在21:1，碳源浓度在3.2%以下、氮源浓度在0.15%以下时，随着碳氮源浓度的增加，灰树花菌丝体生长量逐渐增加，并在碳源浓度在3.2%--4.8%、氮源浓度在0.15%--0.23%时，菌丝生长速度快，生物量最大。当碳源浓度大于4.8%以下、氮源浓度大于0.23%以下时，灰树花菌丝体生长会收到抑制，出现对营养物质的添加与利用不合理的现象。 

3、灰树花液体培养基的筛选研究 

    根据我们对灰树花液体培养的碳源、氮源的筛选研究，葡萄糖是最好的碳源。麦麸、黄豆粉、玉米粉是灰树花菌丝体生长的主要氮源，其效果好，价格低，也正好符合再生资源开发利用的要求。合理利用农副产品及其加工中的下脚料是最经济、最有效的食用菌液体深层发酵工业化生产趋势。为了找到合理的液体培养基配方，我们选用葡萄糖、麦麸、黄豆粉、玉米粉等四因子进行L₉(3⁴)正交试验。现将试验结果总结如下：

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  供试菌种  灰树花菌株YtGf-1，由烟台师范学院食用真菌研究所提供并保存。

1.1.2  斜面培养基（马铃薯综合培养基）  马铃薯（去皮）20%, 麦麸5% , 葡萄糖2%，KH₂PO₄ 0.2%，MgSO₄ 0.1%,蛋白胨0.5%, VB₁0.001%，琼脂2%。 

1.1.3  液体菌种培养基  马铃薯（去皮）20%，葡萄糖2%，蛋白胨0.5%，KH₂PO₄0.2%，MgSO₄0.1%，VB₁0.002%。 

1.1.4  正交试验共同培养基  KH₂PO₄0.2%，MgSO₄0.1%，VB₁0.002%。 

1.2  试验方法 

1.2.1  液体菌种的制备  将刚长满管的斜面菌种接种于种子培养基中，在25⁰C恒温箱中静置24h，然后在25⁰C、180r/min旋转式摇床振荡培养7d，作为液体菌种。

1.2.2  发酵培养工艺  在500ml三角瓶中装入150ml培养液（配制时将固体原料均制成浸制液使用），灭菌后按10%的接种量进行接种。然后，放在25⁰C的培养箱中静置培养24h，再放在25⁰C，180r/min摇床上振荡培养5d，观察记录菌丝体生长情况。 

1.2.3  菌丝干重的测量  将培养好的菌液经干燥的脱脂棉过滤后得菌丝体，用蒸馏水冲洗干净，放于60⁰C干燥箱中烘至恒重后测重。 

2  结果与讨论 

     试验结果见表8。

表8   L₉(3⁴)正交试验结果及分析 

从表中可以分析出，麦麸是灰树花菌丝体生长的主要因素，玉米粉和葡萄糖是灰树花菌丝体生长的次要因素，黄豆粉对灰树花菌丝体生长的影响最小。依据表8制作图3，更直观地表达了葡萄糖等四因子对灰树花菌丝体生长的影响，从而得出灰树花液体发酵最适培养基为：麦麸5%，玉米粉1%，葡萄糖2%， KH₂PO₄0.2%，MgSO₄0.1%，VB₁0.002%。在此培养基中生长的灰树花菌球小，密度高，生物量高。

  

（三）灰树花液体菌种最佳培养条件的研究

灰树花[Grifola frondosa (Fr.) S. F. Gray]，又名贝叶多孔菌，俗称栗子蘑、莲花菇、舞茸，是一种具有很高开发价值的珍贵食用兼药用的菌类。据T.Mizuno和I.Suzuki等研究证实，从灰树花子实体、菌丝体及发酵发酵滤液中提取的活性多糖，均具有显著的抗肿瘤和抗艾滋病的功效。利用液体发酵培养，可以较便利地获取大量菌丝体，从中提取活性多糖等有较高价值的物质。为此，我们对灰树花的液体培养条件进行了试验研究，现将主要工作研究报告如下：

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  供试菌种  灰树花菌株YtGf-1，由烟台师范学院食用真菌研究所提供并保存。

1.1.2  斜面培养基（马铃薯综合培养基）  马铃薯（去皮）20%, 麦麸5% , 葡萄糖2%，KH₂PO₄ 0.2%，MgSO₄ 0.1%,蛋白胨0.5%, VB₁0.001%，琼脂2%。 

1.1.3  液体种子培养基  马铃薯（去皮）20%，葡萄糖2%，蛋白胨0.5%，KH₂PO₄0.2%，MgSO₄0.1%，VB₁0.002%。 

1.1.4  发酵培养基  麦麸5%，玉米粉1%，葡萄糖2%， KH₂PO₄0.2%，MgSO₄0.1%，VB₁0.002%。 

1.2  试验方法 

1.2.1  液体菌种的制备  将刚长满管的斜面菌种接种于种子培养基中，在25⁰C恒温箱中静置24h，然后在25⁰C、180r/min旋转式摇床振荡培养7d，作为液体菌种。

1.2.2  菌丝干重的测量  将培养好的菌液经干燥的脱脂棉过滤后得菌丝体，用蒸馏水冲洗干净，放于60⁰C干燥箱中烘至恒重后测重。 

2  结果与分析 

2.1  温度对菌丝体生长的影响

在500ml三角瓶中装入150ml培养液（配制时将固体原料均制成浸制液使用），灭菌后按10%的接种量进行接种。然后设定15⁰C、18⁰C 、20⁰C、25⁰C、28⁰C、30⁰C不同温度，每个处理重复3次。在不同的温度下，先在培养箱中静置培养24h，再放在180r/min摇床上振荡培养5d，观察记录菌球生长情况，测量菌丝干重。其结果见图4。

从图4可以看出，随着温度不断的升高菌丝产量不断增加,但在25℃后继续升温,菌丝量不再增加,当温度超过28℃时产量迅速下降。所以确定25℃为适宜发酵温度。 

2.2  不同PH对菌丝体生长的影响 

在500ml三角瓶中装入150ml培养液（配制时将固体原料均制成浸制液使用），用稀酸或稀碱将培养基分别调成PH值为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，每个处理3瓶。灭菌后按10%的接种量进行接种。然后，放在25⁰C的培养箱中静置培养24h，再放在25⁰C，180r/min摇床上振荡培养5d，观察记录菌球生长情况，测量菌丝体干重。其结果见图5。

从图5中可以看出灰树花在PH4.0—7.0范围内均能生长，适应能力较强。PH6.0时，菌丝量最大，我们认为灰树花液体培养初始PH为6.0最合适。 

2.3  装液量对菌丝体生长的影响 

在500ml三角瓶中分别装入培养基50ml、80ml、100ml、150ml、180ml、200ml（配制时将固体原料均制成浸制液使用），每处理各3瓶。灭菌后按10%的接种量进行接种。然后，放在25⁰C的培养箱中静置培养24h，再放在25⁰C，180r/min摇床上振荡培养5d，观察记录菌球生长情况，测量菌丝干重。发酵培养结果见图6。

从图6可以看出，装液量在150ml时，产生菌丝量多，装液量过少（50ml）、过多（200ml）均不利于菌丝体生长。由此可以看出，灰树花液体培养需要中等通气量，通气量过多或过少，均不利于菌丝体的生长。 

2.4  转速对菌丝体生长的影响 

在500ml三角瓶中装入150ml培养液（配制时将固体原料均制成浸制液使用），灭菌后按10%的接种量进行接种。然后，放在25⁰C的培养箱中静置培养24h，再分别放在25⁰C，50、100、150、180、200、250r/min摇床上振荡培养5d，每个处理重复3次。观察记录菌球生长情况，测量菌丝干重。其结果见图7。

从图7中可以看出：不同转速对菌丝产量影响较大。转速增加，通气量增大，通气量增多溶氧量增大，菌丝生产量增多，转速达150r/min时菌丝生长量最大。转速超过200r/min后又影响菌丝体的生长。 

2.5  接种量对菌丝体生长的影响 

在500ml三角瓶中装入150ml培养液（配制时将固体原料均制成浸制液使用），灭菌后分别按5%、10%、15%、20%、25%的接种量进行接种，每个处理3瓶。然后，放在25⁰C的培养箱中静置培养24h，再放在25⁰C，180r/min摇床上振荡培养5d，观察记录菌球生长情况，测量菌丝干重。其结果见图8。

从图8中可以看出，随着接种量从5%--10%的增加，菌丝体的产量也逐渐提高。接种量在10%--15%之间，菌丝体的产量变化不大。当接种量超过15%时，菌丝体的产量反而会下降。由此可见，适合灰树花液体发酵培养的接种量以10%为宜。 

2.6  培养时间对菌丝体生长的影响 

在500ml三角瓶中装入150ml培养液（配制时将固体原料均制成浸制液使用），灭菌后按10%的接种量进行接种。然后，放在25⁰C的培养箱中静置培养24h，再放在25⁰C，180r/min摇床上振荡培养，观察记录菌球生长情况，测量菌丝干重。其结果见图9。

    从图9中可以看出在发酵培养120—144h菌丝体的产量较高，培养144h达到高峰值，接着培养菌丝体的产量急剧下降。发酵培养到168h由于溶氧量降低，菌球开始衰老自溶，进行镜检，发现菌丝体开始老化、瘦弱。培养144h的菌液有灰树花的浓郁香味，镜检无细菌和酵母菌，用棉籽壳培养无霉菌生长。菌液于25℃平板培养菌丝长速快，且生长健壮。所以灰树花的液体发酵培养144h后，应及时结束发酵。 

3  结论 

通过试验确定了灰树花发酵培养最适的PH为6，接种量为10%。灰树花菌丝体在中等装液量（500ml三角瓶装液量150ml）下，生物量最多。25℃，150-180r/min振荡培养144h即可结束发酵，其发酵周期较短，便于大规模工业生产。

（四）灰树花液体菌种保存温度及有效期的试验研究 

灰树花液体菌种培养，即采用深层发酵法培养菌种不仅生产效率高、接种方便、萌发点多、发菌快、抗杂性强，还具有周期短、纯度高、成本低、菌龄整齐一致等优点，这些都是固体菌种不可比拟的，但液体菌种不耐保存。为此我们对灰树花液体菌种进行了在不同温度下的有效期试验，为液体菌种的保存、使用提供可靠的依据。现将试验结果总结如下：

1           材料和方法

1.1  供试材料

1.1.1  供试菌种  灰树花菌株YtGf-1，扩繁后在液体培养基（麦麸5%，玉米粉1%，葡萄糖2%， KH₂PO₄0.2%，MgSO₄0.1%，VB₁0.002%）中25℃，150r/min振荡培养144h。

1.1.2  平板培养基  PDA培养基 

1.1.3  试管斜面培养基  马铃薯综合培养基

1.2  试验方法

1.2.1  平板复活试验  设5个温度范围处理，作7个保存期的菌种复活试验。各处理菌种以500ml三角瓶封装，在不同温度下保存。复活时随机挑取菌球在平板培养基上各接三个点（每处理重复3次），置25℃下培养，记录菌球萌动情况。

1.2.2  菌丝的活力测定  各处理的菌球复活后，无菌条件下挑取三个菌球接入试管斜面培养基上，记录菌丝的生长速度、满管天数及生长密度。 

2  试验结果 

2.1  平板复活试验  不同处理菌球的萌动情况见表9。

  

表9  不同温度下保存菌种菌球开始萌动的天数

从表9中可以看出，在相同温度下，随着保存期延长，灰树花菌球萌动所需的时间愈长；在保存期相同的条件下，保存温度低，菌球萌动得愈早。从本试验还可以看出灰树花液体菌种的保存期在0—5℃和6—10℃是16天，在11—15℃是10天，在16—20℃是8天，在21--25℃是6天。

2.2            菌丝活力的测定  

不同处理菌球活力的情况见表10--14。

  

表10  在0—5℃保存菌种菌丝的生长情况

表11  在6—10℃保存菌种菌丝的生长情况

表12  在11--15℃保存菌种菌丝的生长情况

表13  在16—20℃保存菌种菌丝的生长情况

表14  在21—25℃保存菌种菌丝的生长情况

从表10-14中可以分析出灰树花液体菌种在不同温度下保存期有所不同。在0—5℃为15～18天，在6—10℃为12～15天，在11—15℃为8～10天，在16—20℃是6～8天，在21--25℃是4～6天。

3  讨论 

液体菌种的保存期是受多因子制约的。由于条件的限制我们只做了使用500ml三角瓶保存液体菌种的有效期观察，其他的保存方式有待于进一步试验。

二、灰树花配套高产栽培技术的研究             （一）灰树花高产栽培培养料的筛选研究 

灰树花是一种珍稀的食用兼药用菌类。据测定，100克灰树花干品含蛋白质22.75克，氨基酸23.58克，氨基酸含量比香菇高1倍以上，并富含维生素C、B₁、B₂及有机物硒等。据专家评价灰树花具有防癌、抗癌，抗衰老、促进性腺功能，防治糖尿病，抑制肥胖、双向调节血压、治疗动脉硬化、脑血栓等症，口服能美容和滋润皮肤、延缓老年斑的出现，增强食欲，提高免疫力、增强记忆力等六大医疗保健功能，因此有“食用菌王子”之美称。随着人民消费需要的不断提高，灰树花产业将显示出强大的生命力，具有广阔的市场前景，所以应提倡大力栽培。

为了提高灰树花的产量，我们进行了培养料的筛选研究。筛选出既能高产，又能节省成本的培养料配方，以供广大食用菌生产者参考选用。 

1、材料和方法 

1.1  供试菌种  灰树花菌株YtGf-1，扩繁后在液体培养基（麦麸5%，玉米粉1%，葡萄糖2%， KH₂PO₄0.2%，MgSO₄0.1%，VB₁0.002%）中发酵培养，在25℃条件下培养144h即可。长好的液体菌种应菌球大小一致、分布均匀并有灰树花的香味。

1.2  培养基配方  由棉籽壳、木屑（阔叶树）、菌糠、麦麸、玉米粉、生石灰等材料组成组成7个配方，见表15。以棉籽壳和麦麸组成的常规配方为对照。 

表15  供试培养基配方（%） 

1.3  试验方法  

1.3.1  材料的选择与处理  由于灰树花是一种特别好氧性的菌类，用于栽培的木屑不宜太细，木屑颗粒一般1—2mm。如果使用的木屑太细，可加入部分较粗的木片碎屑，以利通气，粗细以1：3比例混匀后使用。其他原料使用前也必须经太阳晒干。

1.3.2  配制与装袋  按配方要求将培养料称好，然后将麦麸、玉米粉、生石灰等辅料拌和后均匀地洒在主料上，然后加入适量水，投入到搅拌机内拌匀。按照配方拌料时，最主要的是掌握含水量，坚持宁小勿大的原则。最后装袋时的水分，以手握湿料成团，弃之即散为宜，这为正常发菌的关键含水量。 

装袋采用17厘米×33厘米×0.04厘米聚丙烯袋，装袋时培养料要用手握拳头紧压，达到合适松紧度。 

1.3.3  灭菌与接种  栽培袋制作完毕不宜久放，应及时装入灭菌锅灭菌（当天制作当天进行灭菌）。如果使用高压灭菌锅，则蒸汽压力1.2—1.3千克/平方厘米（或温度123℃--125℃）保持1—1.5小时；如果使用常压灭菌，必须保持8—10小时，杀菌才能彻底。灭菌结束后冷却放入接种室内。 

接种时在无菌操作下用接种枪将菌种打入袋内，迅速将袋口封住，放入25℃左右的培养室培养。 

1.3.4  发菌及管理  灰树花的菌袋培养是在培养室内完成。在放入菌袋前要对培养室进行消毒，保持室温在25～26℃，培养室内相对湿度保持在60%--65%。 

发菌期管理是栽培成败的关键，要灵活调节温度，加强通风换气，注意防湿控光，更应注意的是菌袋在培养期间要经常翻堆检查，一般每周翻堆1--2次。翻堆时做到上下、里外、侧向相互对调，目的是使菌袋均匀地接触光照、空气和温度，促使发菌平衡。翻堆时认真检查，发现杂菌及时处理。 

1.3.5  栽培方式  灰树花高产栽培采用的是室外脱袋覆土立埋式栽培法，具体做法如下： 

首先选择背风近水源的地方，每隔60厘米，挖50厘米宽，25厘米深的畦沟，畦沟一般东西走向，长3米。然后灌大水一次，水渗后，撒一薄层石灰，再将发好菌的菌袋将外层塑料袋全部脱去，竖直排放在畦沟内，应注意的是，排放时菌棒前后左右均应保留1～2厘米的间隙，菌棒上顶面比畦梗低2厘米。在菌棒四周的间隙中填入经过晒干的土壤，使其与菌棒的培养基表面齐平。随后再在菌棒表面覆盖一层经过晒干的土壤，厚度为1.5—2.0厘米，以刚好把培养基隆起部分的原基盖住为宜。

覆土工作完毕后，要及时调节土壤的水分，调水时应用喷雾器均匀喷水，掌握少量多次的原则，要求必须在1—2天之内，将覆土层调节到适宜的湿度(用手捏土粒，不碎，也不粘手为宜)，这时可在土层表面铺垫一层直径0.3—0.5厘米的粗沙砾，能阻隔子实体底部沾土。最后把木棍或竹杆搭在畦上，覆上塑料布，再盖上草帘，目的是调温和遮阴，应注意两端应留通气孔。 

1.3.6  出菇及管理  灰树花的出菇管理工作，主要是水分管理和通风换气。灰树花子实体的生长，需保持有较高的相对湿度—--90%左右，灰树花又是一种需氧量较大的菌类，每天要全部更换空气5—6回。因此，栽培管理技术的好坏，就在于如何调节通气和保湿之间的矛盾。 

正常栽培季节，气温在15--20℃之间，每天需喷水2—3次，早、中、晚各一次进行通风。为保持空气新鲜，应使通气孔长期开启。如果气温偏高，空气湿度偏低，致使覆土层变干，此时应该增加喷水量和喷水次数，并且经常在空间和步道上喷雾和洒水，使相对湿度能保持在90%以上。 

另外，栽培场所要有200—500勒克斯光照，灰树花子实体的菌盖分化和颜色才会正常，成活率也较高。 

1.3.7   采收  灰树花的子实体在适宜的温度和湿度的条件下，从长出土面，出现脑状皱褶的小子实体到长大成熟，一般需要15—18天。当灰树花的扇形菌盖外缘无白色生长端，边缘变薄，菌盖平展、伸长，颜色呈浅灰黑色，整朵菇形像盛开的莲花，并散发出浓郁的香味时，即可采收。 

2  结果与分析 

2.1  菌丝生长情况  

每个配方随机抽取100袋，进行观察。灰树花菌丝在萌发时间、菌丝生长速度、菌种满袋天数及污染率的差异见表16。

  

表16  不同配方菌丝生长情况

从表16中可以看出，各配方的灰树花菌丝在萌发时间无差异；在吃料时间、污染率上略有差异。菌丝生长速度以配方5最快，配方4和7略慢，以配方2为最慢。

2.2  产量与生物学效率 

每袋料干重为0.5kg，每个配方随机抽取100袋进行栽培，计算产量，见表17。

表17  不同配方灰树花产量及生物学效率 

从表17中可以看出，配方5和4产量高，生物学效率高。下面依次是配方7、配方3、配方1、配方2、配方6。

3  讨论与小结 

从本试验可以得出，适合灰树花栽培的原料有木屑、棉籽壳、菌糠、玉米粉、麦麸。菌糠作为栽培原料，与木屑等拌合能改善通气情况，减轻菌丝生长过程中产生的不良物质对菌丝的影响。但由于菌糠本身的有效养分偏少，其产量及生物学效率稍低，但其成本低，相对来讲经济效益还是显著的。所以我们认为适合灰树花高产的配方有以下三个：

木屑75%，麦麸20%，玉米粉5%，生石灰2%；

木屑55%，棉籽壳25%，麦麸20%，生石灰2%；木屑40%，菌糠50%，麦麸10%，生石灰5%。

（二）灰树花栽培方式的试验研究 

灰树花子实体形似盛开的莲花，扇形菌盖重重叠叠，鲜嫩的子实体香味浓郁，味道鲜美，口感极佳，营养极其丰富。灰树花加工产品更为外商所青睐。因此发展灰树花的栽培有着巨大的市场潜力和诱人的前景。本文在其液体菌种培养的基础上对其栽培方式进行研究，以其对灰树花的生产有所帮助。

1、材料和方法 

1.1  供试摇瓶种  灰树花菌株YtGf-1，扩繁后在液体培养基（麦麸5%，玉米粉1%，葡萄糖2%， KH₂PO₄0.2%，MgSO₄0.1%，VB₁0.002%）中发酵培养，在25℃条件下培养144h即可。长好的液体菌种应菌球大小一致、分布均匀并有灰树花的香味。

1.2种子罐种  培养基的配方：麦麸5%，玉米粉1%，葡萄糖2%， KH₂PO₄0.2%，MgSO₄0.1%，VB₁0.002%，按配方将培养基配好，装入发酵罐中，121℃下菌0.5hr，待冷却后无菌操作接入长好的摇瓶种，接种量为5%，25℃下培养4-5天即可 

1.3  栽培袋生产

1.3.1  栽培料的配方  木屑75%，麦麸20%，玉米粉5%，生石灰2%。

1.3.2  栽培袋的生产  装袋采用17厘米×33厘米×0.04厘米聚丙烯袋，按常规装袋、灭菌、接种、发菌。 

1.4  栽培方式  将发满菌丝的菌袋进行出菇实验，采用以下两种方式进行栽培：（1）脱袋立埋覆土栽培：选择背风近水源的地方，每隔60厘米，挖50厘米宽，25厘米深的畦沟，畦沟一般东西走向，长3米。然后灌大水一次，水渗后，撒一薄层石灰，再将发好菌的菌袋将外层塑料袋全部脱去，竖直排放在畦沟内，应注意的是，排放时菌棒前后左右均应保留1～2厘米的间隙，菌棒上顶面比畦梗低2厘米。在菌棒四周的间隙中填入经过晒干的土壤，使其与菌棒的培养基表面齐平。随后再在菌棒表面覆盖一层经过晒干的土壤，厚度为1.5—2.0厘米，以刚好把培养基隆起部分的原基盖住为宜。覆土工作完毕后，要及时调节土壤的水分，调水时应用喷雾器均匀喷水，掌握少量多次的原则，要求必须在1—2天之内，将覆土层调节到适宜的湿度(用手捏土粒，不碎，也不粘手为宜)，这时可在土层表面铺垫一层直径0.3—0.5厘米的粗沙砾，能阻隔子实体底部沾土。最后把木棍或竹杆搭在畦上，覆上塑料布，再盖上草帘，目的是调温和遮阴，应注意两端应留通气孔。（2）开袋无覆土栽培：将菌袋袋口松开，并将塑料袋两侧各割一长口，然后入大棚内进行出菇。两种栽培方式均按常规管理出菇、采收。 

2、结果与分析 

不同栽培方式的出菇情况见表18。从表中可以看出，生物学效率以脱袋立埋覆土栽培最高，达108.6%，但从子实体性状来看，开袋无覆土栽培的子实体朵形较小，菇柄较长，且基部很干净。 

  

表18  不同栽培方式灰树花产量的对比

3、讨论

栽培灰树花要获优质高产，不仅需要合理的培养料配方和处理方法，而且还要有与之配套的高产栽培方式。通过试验，灰树花脱袋立埋覆土栽培可显著提高灰树花子实体的产量，而且子实体朵大、菇柄很短。开袋无覆土栽培的子实体由于没有土层支撑，悬挂在菌袋两侧或袋口，容易受到损伤，甚至脱落，管理过程应特别小心。

（三）灰树花液体与固体菌种栽培袋发菌对比试验 

栽培灰树花普遍采用的是斜面母种制作原种，由原种直接用于生产栽培袋栽培出菇。近两年，我们对灰树花的液体发酵技术进行了研究，发现直接将液体菌种接入栽培袋中具有发菌快、菌丝壮、污染率低等特点，现主要将灰树花液体菌种与固体菌种发菌的对比试验作一总结。

1  材料与方法 

1.1  供试材料

1.1.1  供试菌种  灰树花菌株YtGf-1，由烟台师范学院食用真菌研究所提供并保存。按常规分别制成优质、适龄的灰树花原种和液体菌种。

1.1.2  培养基配方  木屑（粗细搭配）75%，麦麸20%，玉米粉5%，生石灰2%(外加)，含水量60—65% ，PH5.5—6.5 。 

1.2  试验方法  按配方要求将培养料称好，然后将麦麸、玉米粉、生石灰等辅料拌和后均匀地洒在主料上，再加入适量水，拌匀，最后焖堆1h，装袋。袋子规格为17cm×33cm×0.04cm聚丙烯袋，装袋时培养料要用手握拳头紧压，达到合适松紧度。在每袋中间部位打打一直径1.5--2cm的小孔，在121℃下灭菌2hr。灭菌彻底后冷却接种，接种时无菌操作。液体菌种与固体菌种的接种量均按10%，各接100袋，放入25℃培养室中培养，观察菌丝萌发情况，并划线测量菌丝生长速度，记录满袋天数及统计污染袋子数。 

2  结果 

灰树花液体菌种与固体菌种发菌在萌发时间、菌丝生长速度、菌种满袋天数及污染率的差异见表19。

  

表19  液体菌种与固体菌种发菌的对比

从表中可以看出在萌发时间上液体菌种早于固体菌种，接种液体菌种比接种固体菌种菌丝生长速度快而且污染率低。

3  讨论 

由于液体菌种具有流动性，它的菌丝球和菌丝片段可以流散在菌袋的不同部位萌发，发育点多，萌发快。因此接种后，可在袋中的不同部位菌丝迅速蔓延生长，这样就大大减少了杂菌侵染的机会，减少了污染率，从而就缩短了发菌时间。

从“灰树花液体菌种与固体菌种发菌情况的对比试验”可以看出液体菌种比固体菌种发菌时间缩短了11天。我们使用灰树花液体菌种制作栽培袋34天左右可以一次完成；若使用灰树花固体菌种，45天只完成了原种的制作，再使用原种直接制作栽培袋还需要近40天左右的时间。可以看出使用液体菌种进行灰树花高产栽培可以将整个生产周期缩短50天左右。 

（四）灰树花液体与固体菌种栽培袋出菇比较试验 

灰树花的栽培一般采用的是斜面母种制作原种，由原种直接用于生产栽培袋栽培出菇。近两年，我们对灰树花的液体发酵技术进行了研究，直接将液体菌种接入栽培袋中栽培出菇，发现其具有现蕾早、出菇齐、生物学效率高等特点，现将对比试验总结如下。

1  材料与方法 

1.1  供试材料  灰树花菌株YtGf-1，由烟台师范学院食用真菌研究所提供并保存。按常规分别利用液体菌种和固体菌种制成优质、适龄的灰树花栽培袋。

1.2  试验方法  采用室外脱袋覆土立埋式栽培法。 

1.3  出菇管理  常规管理关键在于菇场的通风、调湿、光照、温度等环境条件的综合调控与有机结合，使之最大限度地促进灰树花的生长发育。 

1.4  采收  当灰树花的扇形菌盖外缘无白色生长端，边缘变薄，菌盖平展、伸长，颜色呈浅灰黑色，整朵菇形像盛开的莲花，并散发出浓郁的香味时，即可采收。 

2  结果与讨论 

以每亩地投料15000kg计，灰树花利用液体菌种与固体菌种栽培时其现蕾时间、出菇情况、生物学效率的差异见表20。

  

表20  灰树花液体菌种与固体菌种栽培试验的比较

从表中可以看出，灰树花利用液体菌种进行栽培时具有现蕾早、出菇齐、生物学效率高等特点。

附图说明

图1  不同碳氮比对灰树花菌丝体生长的影响 

图2  最适碳氮比下碳源浓度对灰树花生长的影响

图3  葡萄糖等对灰树花菌丝体生长的影响

图4  培养温度对灰树花菌丝体生长的影响

图5  PH值对灰树花菌丝体生长的影响

图6  装液量对灰树花菌丝体生长的影响

图7  转速对灰树花菌丝体生长的影响

图8  接种量对灰树花菌丝体生长的影响

图9  培养时间对灰树花菌丝体生长的影响。 

Claims (3)

1.一种灰树花液体菌种培养及高产栽培的方法，其特征在于筛选出最适合灰树花菌丝生长的斜面母种培养基为马铃薯木屑培养基，其配方是：马铃薯（去皮）200g，木屑（阔叶树）100g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL，PH值5.5-6.5。

2.如权利要求1所述的一种灰树花液体菌种培养及高产栽培的方法，其特征在于确定了灰树花液体发酵最适培养基为：麦麸5%，玉米粉1%，葡萄糖2%， KH2PO40.2%，MgSO40.1%，VB10.002%，在此培养基中生长的灰树花菌球小，密度高，生物量高。

3.一种灰树花液体菌种培养及高产栽培的方法，其特征在于筛选出适合灰树花高产的配方有以下三个：（1）木屑75%，麦麸20%，玉米粉5%，生石灰2%；（2）木屑55%，棉籽壳25%，麦麸20%，生石灰2%；（3）木屑40%，菌糠50%，麦麸10%，生石灰5%。

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