CN105441334A - 产灰树花多糖的菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株产灰树花多糖的菌株及其应用，所述菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCC？No.？10116，保藏日期为：2014年12月9日，所述菌株分类命名为：灰树花GrT.01（<i>Griflola</i><i>？frondosa</i>）。本发明所述菌株GrT.01是从野生环境天然子实体中分离筛选获得，菌丝体和多糖含量高，可应用于高效生产灰树花多糖。本发明所述菌株GrT.01的发酵培养基配料简单，价格低廉，是工业生产中非常普遍容易获得的，发酵效果显著，使灰树花多糖的生产成本大大降低，可应用于大规模液体深层发酵生产。

Description

产灰树花多糖的菌株及其应用
技术领域
本发明属于食品生物技术领域，具体涉及一种生产灰树花多糖的菌株及其应用。
背景技术
灰树花(Grifolafrondosa)是担子菌亚门，层菌纲，无隔担子菌亚纲，非褶菌目，多孔菌属中的一种大型真菌，又名贝叶多孔菌、栗子蘑、重菇等，日本称之为舞茸。
近20年来，国内外深入开展了作为生物反应调节剂的真菌多糖的研究，灰树花多糖显著的疗效也逐渐被人们所认识。经过大量的化学和药理分析发现，灰树花多糖具有明显的抗肿瘤，抗HIV病毒，改善免疫系统功能，调节血糖、血脂及胆固醇水平，降血压等作用，对防止癌细胞的生成和转移、艾滋病、高血压、肥胖症、糖尿病以及免疫系统功能的紊乱都有一定的疗效，且无任何毒副作用。大野尚仁（1986)比较了液体培养的菌丝体多糖与子实体多糖的抗肿瘤活性，发现二者十分相似。深层发酵得到的灰树花菌丝体不但具有固体栽培子实体相当的营养及药用效果，还可得到胞外多糖等子实体所不具备的营养保健成分。最近，美国食品和药物管理局（FDA）证实了灰树花提取物治疗晚期乳腺癌和前列腺癌的研究结果，并允许灰树花提取物作为癌症的有效抑制剂，直接进行Ⅱ期临床试验。因此，灰树花是一种极具开发价值的珍贵食、药用真菌。
灰树花多糖主要以灰树花子实体为原料提取。多年来灰树花生产主要以人工固体栽培为主，但固体栽培存在占地面积大、生产周期长、产量不稳定、易受气候、环境因素影响等诸多缺点，使灰树花多糖的开发生产受到极大限制；而利用液体深层发酵法可使灰树花多糖生产工业化，周期缩短，产量增加，质量更稳定。因此灰树花深层发酵可以替代子实体作为产品深度开发的原料。当前，常规的产灰树花多糖菌株存在多糖含量低，菌丝体产量低的问题，尤其是适合大规模发酵生产的灰树花菌株很难获得。因此通过现有的技术手段对自然界的灰树花菌株资源筛选，以期获得高产多糖的灰树花菌株，为其应用奠定坚实基础。
发明内容
本发明目的之一在于提供一株生产灰树花多糖的菌株，本发明所涉及的灰树花菌株采自京东地区板栗产区，是从野生天然菌株中分离筛选得到。可以在最适条件下高效的合成灰树花多糖。
本发明目的之二在于提供一株生产灰树花多糖的菌株的应用，即将筛选出的GriflolafrondosaGrT.01菌株用于灰树花多糖的制备，从而高效的生产灰树花多糖。
为实现上述目的，本发明所采取的技术方案为：
产灰树花多糖的菌株，保藏号为：CGMCCNo.10116，保藏日期为：2014年12月9日，所述菌株分类命名为：灰树花GrT.01（Griflolafrondosa）。
利用前面所述的菌种生产灰树花多糖的方法，是将CGMCCNo.10116菌种制成种子，接种于含有碳源、氮源、无机盐和水的培养基（pH为4~8）中，在23~28℃条件下连续发酵6~14天。
前面所述的方法，优选的方案在于，具体包括以下步骤：在灰树花多糖生产阶段，生产发酵培养基的碳源为葡萄糖和土豆汁或玉米粉，氮源为麸皮汁和酵母粉，无机盐的磷酸二氢钾和硫酸镁的配比为2:1，生长因子VB1在生产发酵培养基中的质量百分比浓度为8-10mg/L。
前面所述的方法，优选的方案在于，具体包括以下步骤：
1）种子液制备阶段：利用如权利要求1或2所述的菌株制备种子液；
2）菌种繁殖阶段：将所述种子液接种于一次发酵培养基后，所述一次发酵培养基在pH为4~8和温度为23~28℃的条件下进行连续发酵；
3）灰树花多糖生产阶段：向所述一次发酵培养基中添加玉米粉和麸皮汁，配制成生产发酵培养基，在23~28℃条件下连续发酵6~14天。
前面所述的方法，优选的方案在于，所述一次发酵培养基成分为：碳源、氮源、无机盐和生长因子。
前面所述的方法，优选的方案在于，所述一次发酵培养基中碳源为葡萄糖或玉米粉，所述氮源为麸皮汁和酵母粉。
前面所述的方法，优选的方案在于，所述一次发酵培养基中葡萄糖和玉米粉的质量百分比浓度各为1~6%。
前面所述的方法，优选的方案在于，所述步骤3)中，生长因子在生产发酵培养基中的浓度为8-10mg/L，无机盐在生产发酵培养基中的质量百分比浓度为0.01-0.5%。
前面所述的方法，优选的方案在于，所述一次发酵培养基和所述生产发酵培养基pH均为4~8。
前面所述的方法，优选的方案在于，所述一次发酵培养基和所述生产发酵培养基pH均为6。
本发明提供的一株产灰树花多糖的菌株，所述菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCCNo.10116，保藏日期为：2014年12月9日，所述菌株分类命名为：灰树花GrT.01（Griflolafrondosa）。优选的是，所述菌株筛选自京东地区板栗产区。
一种产灰树花多糖的方法，其特征在于，应用如权利要求1或2所述的菌株生产灰树花多糖。优选的是，所述的方法具体包括以下步骤：在灰树花多糖生产阶段，生产发酵培养基的碳源为葡萄糖和玉米粉，葡萄糖和玉米粉在生产发酵培养基中的质量百分比浓度为1~6%，氮源为麸皮汁和酵母粉。优选的是，所述的方法具体包括以下步骤：种子液制备阶段：利用如权利要求1或2所述的菌株制备种子液；菌种繁殖阶段：将所述种子液接种于一次发酵培养基后，所述一次发酵培养基在pH为4~8和温度为23~28℃的条件下进行连续发酵；灰树花多糖生产阶段：向所述一次发酵培养基中添加玉米粉和麸皮汁，配制成生产发酵培养基，生产发酵培养基中的葡萄糖和玉米粉的浓度各为1~6%，所述生产发酵培养基的pH为4.5~8，在23~28℃条件下连续发酵6~14天。优选的是，所述一次发酵培养基成分为：碳源、氮源、无机盐和生长因子。优选的是，所述一次发酵培养基中碳源为葡萄糖或/玉米粉，所述氮源为麸皮汁。优选的是，所述一次发酵培养基中葡萄糖和玉米粉的质量百分比浓度各为1~6%，麸皮汁的质量百分比浓度为1-6%。优选的是，所述步骤3)中，葡萄糖在生产发酵培养基中的质量百分比浓度为3%，玉米粉在生产发酵培养基中的质量百分比浓度为3%，麸皮汁在生产发酵培养基中的质量百分比浓度为5%。优选的是，所述一次发酵培养基和所述生产发酵培养基pH均为5.5~6.5。优选的是，所述一次发酵培养基和所述生产发酵培养基pH均为6。
本发明公开了一株产灰树花多糖的菌株及其应用，所述菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCCNo.10116，保藏日期为：2014年12月9日，所述菌株分类命名为：灰树花GrT.01（Griflolafrondosa）。本发明所述菌株GrT.01是从野生环境天然子实体中分离筛选获得，菌丝体和多糖含量高，可应用于高效生产灰树花多糖。本发明所述菌株GrT.01的发酵培养基配料简单，价格低廉，是工业生产中中非常普遍容易获得的，发酵效果显著，使灰树花多糖的生产成本大大降低，可应用于大规模液体深层发酵生产。
本发明的有益效果本发明所述菌株GrT.01是从京东地区板栗产区十余株菌株中筛选出来，在比较适宜的生长条件下，可应用于高效生产灰树花多糖，本发明还对所述菌株GrT.01高效表达灰树花多糖的发酵条件进行了探索，获得了所述菌株表达灰树花多糖的发酵培养中最优碳源、最优氮源、最优无机盐浓度、生长因子浓度等生活条件，本发明所述菌株GrT.01的发酵培养基配料简单，都是工业生产中非常普遍容易获得的，发酵效果显著，使灰树花多糖的生产成本大大降低，可应用于大规模生产。
附图说明
本发明公开了一株产灰树花多糖的菌株及其应用，所述菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCCNo.10116，保藏日期为：2014年12月9日，所述菌株分类命名为：灰树花GrT.01（Griflolafrondosa）。
图1是菌种系统发育树。
图2为本发明所述菌株在不同碳源的发酵培养基中时的生物量比较图。
图3为本发明所述菌株在不同氮源的发酵培养基中时的生物量比较图。
图4为本发明所述菌株在不同浓度无机盐的发酵培养基中时的生物量比较图。
图5为本发明所述菌株在不同诱导剂诱导下发酵培养基中的生物量比较图。
图6为本发明所述采集菌株不同多糖含量的对比测定图。
图7是灰树花菌种的平板型态和发酵菌球形态图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
本发明筛选的GrT.01（Griflolafrondosa）菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCCNo.10116，保藏日期为：2014年12月9日，所述菌株分类命名为：灰树花GrT.01（Griflolafrondosa）。
GrT.01（Griflolafrondosa）的形态特征：
菌丝在PDA和马铃薯半组合培养基上生长旺盛，浓密，白色，绒毛状至絮状，菌落厚；微观特征包括多数为简单分隔、少数为节状分隔的薄壁菌丝、厚壁的纤维菌丝。
实施例1菌株的筛选与鉴定
1、产酶菌株的筛选
本发明是自京东地区板栗产区采集十余株灰树花菌筛选产灰树花多糖的生产菌株，将在PDA和马铃薯半组合培养基上生长旺盛，浓密，白色的菌丝挑取培养用于灰树花多糖的发酵生产，菌株经鉴定后冷藏保存于PDA培养基中。具体步骤如下：
将自京东地区板栗产区采集十余株灰树花菌接种于PDA和马铃薯半组合培养基上，置于25℃～30℃下培养5~15天，选取生长旺盛的菌丝，获得的发酵菌株挑选产多糖含量最高的一株经鉴定为Griflolafrondosa，命名为GriflolafrondosaGrT.01。
2、GrT.01（Griflolafrondosa）的形态特征：
菌丝在PDA和马铃薯半组合培养基上生长旺盛，浓密，白色，绒毛状至絮状，菌落厚；微观特征包括多数为简单分隔、少数为节状分隔的薄壁菌丝、厚壁的纤维菌丝。
3、菌株的基因组学鉴定
鉴定步骤：1）、真菌基因组提取
用三博远志真菌基因组提取试剂盒提取基因组。说明书见三博远志网站
2）、通用引物扩增ITS序列
常用引物
ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG
ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC
35UL体系，55℃退火温度，35cycle
3）、纯化PCR产物
用真菌胶回收试剂盒纯化。
4）、DNA测序获得ITS序列
纯化产物送测序。
5）、与数据库中已知真菌比较获得样品种属信息
测序结果可信区域NCBI进行比对。
6）、选取近似菌种序列，构建系统发育树
将获得的序列用MEGA4软件进行构建，采用Neighbor-Joining法的CompleteDeletion模式，Bootstrap进行检验，并重复1000次。
图1是菌种系统发育树。分析结果见表1，结果表明菌种为Grifolafrondosa。
表1鉴定结果
实施例2对筛选获得的菌株GrT.01进行发酵灰树花菌丝体的最适条件的实验测定：
1)对发酵培养基中碳源的选择测定实验：
首先，设置为10个实验组，其中，发酵培养基中除碳源外，均在氮源
为麸皮汁，pH值为6，KH2PO4和MgSO4质量百分比浓度分别为0.3%和0.15%，生长因子0.2%和温度为25℃条件下进行发酵，单独碳源分别用质量百分比浓度为2%的葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、玉米淀粉、玉米粉、土豆泥，复合碳源在葡萄糖浓度2%基础上分别添加2%浓度的可溶性淀粉、玉米粉、玉米淀粉、土豆泥。
上述十个实验组发酵培养结束之后，分别测定各实验组菌丝体生物量，试验不同碳源对生物量的影响。如图2所示，结果表明，添加复合碳源葡萄糖和玉米粉的一组相比于其他组生物量显著提高，因此选择葡萄糖和玉米粉为最佳碳源。
2)对发酵培养基中氮源的选择测定实验：
首先，设置为四个实验组，其中发酵培养基中除氮源外，均在碳源为葡萄糖2%、玉米粉3%，pH6，KH2PO4和MgSO4质量百分比浓度分别为0.3%和0.15%，生长因子0.2%和温度为25℃条件下进行发酵，所述氮源分别为0.3％的蛋白胨和酵母粉，3%麸皮汁，1.5%黄豆粉。
上述四个实验组发酵培养结束之后，分别测定各实验组菌丝体生物量，试验氮源对生物量的影响。如图3所示，结果发现添加麸皮汁的实验组生物量最高。添加酵母粉和蛋白胨的实验组相近，但酵母粉比蛋白胨价格更低一些，因此最佳氮源选择麸皮汁和酵母粉。
3)无机盐浓度对产酶的影响：
首先，设置为五个实验组，其中，所述五个实验组的发酵培养基除KH2PO4和MgSO4浓度外，pH值为6，均在碳源葡萄糖2%和玉米粉3%，氮源麸皮汁3%，酵母粉0.3%在25℃条件下进行，所述五个实验组的发酵培养基中KH2PO4和MgSO4浓度(w／v)依次为0.1％和0.05%、0.15％和0.075%、0.2%％和0.1%、0.3%和0.15％、0.4%和0.2%，培养7d后测定菌丝体生物量，试验无机盐浓度对生物量的影响。如图4所示，实验结果显示该菌生物量在KH2PO4和MgSO4浓度为0.3%和0.15%下最高，选取KH2PO4和MgSO4浓度为0.3%和0.15%作为发酵培养基的配方。
实施例3所述产灰树花多糖的菌株用于产灰树花多糖的方法，包括以下步骤：制备种子液：将筛选得到的菌株GrT.01接种于种子培养基，在23~28℃下发酵5~8d到达对数生长期，停止发酵，获得种子液；
菌株大量繁殖：将所述种子液接种于一次发酵培养基后，所述一次发酵培养基在pH为4~8和温度为23~28℃的条件下进行连续5~8d发酵，从而使所述菌株进行大量繁殖生产多糖。发酵完成后灰树花生物量37g/L（干重），其中多糖含量达到17%。
图5为本发明所述菌株在不同诱导剂诱导下发酵培养基中的生物量比较图。图6为本发明所述采集菌株不同多糖含量的对比测定图。图7是灰树花菌种的平板型态和发酵菌球形态图。由图5-7可以看出本发明所获得菌株生物量和多糖含量较高,菌球均一密实,是一株可以应用于大工业生产的菌株。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出的实施例。

Claims (10)

1.产灰树花多糖的菌株，其特征在于，保藏号为：CGMCCNo.10116，保藏日期为：2014年12月9日，所述菌株分类命名为：灰树花GrT.01（Griflolafrondosa）。
2.利用权利要求1所述的菌种生产灰树花多糖的方法，其特征在于：将CGMCCNo.10116菌种制成种子，接种于含有碳源、氮源、无机盐和水的培养基（pH为4~8）中，在23~28℃条件下连续发酵6~14天。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在灰树花多糖生产阶段，生产发酵培养基的碳源为葡萄糖和土豆汁或玉米粉，氮源为麸皮汁和酵母粉，无机盐的磷酸二氢钾和硫酸镁的配比为2:1，生长因子VB1在生产发酵培养基中的质量百分比浓度为8-10mg/L。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
1）种子液制备阶段：利用如权利要求1或2所述的菌株制备种子液；
2）菌种繁殖阶段：将所述种子液接种于一次发酵培养基后，所述一次发酵培养基在pH为4~8和温度为23~28℃的条件下进行连续发酵；
3）灰树花多糖生产阶段：向所述一次发酵培养基中添加玉米粉和麸皮汁，配制成生产发酵培养基，在23~28℃条件下连续发酵6~14天。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述一次发酵培养基成分为：碳源、氮源、无机盐和生长因子。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述一次发酵培养基中碳源为葡萄糖或玉米粉，所述氮源为麸皮汁和酵母粉。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述一次发酵培养基中葡萄糖和玉米粉的质量百分比浓度各为1~6%。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中，生长因子在生产发酵培养基中的浓度为8-10mg/L，无机盐在生产发酵培养基中的质量百分比浓度为0.01-0.5%。
9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述一次发酵培养基和所述生产发酵培养基pH均为4~8。
10.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述一次发酵培养基和所述生产发酵培养基pH均为6。
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