CN114921348A - 一株高产多糖灰树花新菌株w151021及其分子标记 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株高产多糖灰树花新菌株W151021及其分子标记，属于食药用菌技术领域。本发明提供一株灰树花(Grifolafrondosa)菌株HMGIM‑W151021，其保藏编号为GDMCCNo：61165。本发明人将采集到的灰树花经过分离纯化获得其纯菌株并且经过人工驯化栽培工艺研究得到其人工栽培子实体，获得高产多糖、耐缺氧等具有优良性状的灰树花品种，利于工厂化栽培。为更好地保护该品种，本发明还提供了HMGIM‑W151021的特异性引物，从而使更好地保护该菌株资源。

Description

一株高产多糖灰树花新菌株W151021及其分子标记

技术领域：

本发明属于食药用菌技术领域，具体涉及一株高产多糖灰树花新菌株W151021及其分子标记。

背景技术：

灰树花(Grifola frondosa)又称灰树花孔菌，其子实体一年生，具柄，柄从基部分枝形成许多具侧生柄的菌盖，覆瓦状叠生或连生，新鲜时肉质，干后软木质。菌盖扇形、贝壳形至花瓣形，外伸可达7cm，宽可达8cm，厚可达0.7cm；表面灰白色至浅褐色，光滑，具不明显放射状条纹，无同心环带；边缘与菌盖表面同色，波状，干后下卷。表面白色至奶油色；形状不规则，每毫米2-3个；孔口边缘薄，撕裂状。菌肉白色至奶油色，厚可达4mm。菌管与孔口表面同色，延生至菌柄上部，长可达3mm。菌柄多分枝，奶油色，长可达8cm，直径可达1.5cm。担孢子5.2-6.7×3.8-4.2μm，卵圆形至椭圆形，无色，薄壁，光滑，非淀粉质，不嗜蓝。夏秋季生于多种阔叶树基部，尤其以蒙古栎上最为常见，造成木材白色腐朽。食药兼用。《中国大型菌物资源图鉴》中记载灰树花分布于东北和华北等地区。

灰树花目前涉及到的功效主要是抗肿瘤、降血糖、调节免疫、降压降脂、护肤、神经元保护等，在目前已经广泛研究的食药用菌中，其保健功能较为突出，其多糖可抑制肿瘤细胞增殖，通过刺激免疫系统识别而产生抑制肿瘤的作用，同时还具有显著的降血糖、降血脂等作用。目前灰树花提取物是除了香菇多糖外获得国内药字号的为数不多的以药用菌提取物制作的药品，足见其功效卓著。而以灰树花为主要原料的降血糖食品也逐渐获得消费者的认可，市场份额不断增加。

目前国内灰树花的菌种多来自于日本引进，同时由于其生长特性，难以适应低氧浓度，所以工厂化栽培技术一直难以推广。因此需要筛选耐缺氧的灰树花菌株，同时灰树花多糖是其有效成分的主要来源，筛选多糖含量较高的品种也是提升灰树花品质的重要手段之一。

发明内容：

为了克服上述问题，本发明提供一株高产多糖灰树花新菌株W151021及其分子标记。本发明中从野生环境下采集到的灰树花经过分离纯化获得其纯菌株并且经过人工驯化栽培工艺研究得到其人工栽培子实体，找到高多糖含量的灰树花品种，同时其耐缺氧的特性较目前的市场主栽品种更为优异，较利于工厂化栽培。为更好地保护该品种，我们通过重测序的方法获得其特异性的InDel位点，并通过设计和验证得到特异性引物。

本发明的第一个目的是提供一株灰树花(Grifola frondosa)菌株HMGIM-W151021，其保藏编号为GDMCC No：61165。所述的灰树花菌株HMGIM-W151021HMGIM-W151021菌株的活力强，在培养后期，料面的菌丝开始增多变成浓密，料面变白，容易形成原基，以引物ITS1/ITS4测序，发现与灰树花Grifola frondosa相似性为98.76％，结合形态学鉴定，该真菌标本宏观特征和显微特征与Grifola frondosa描述一致，鉴定结果为Grifolafrondosa。本发明所请求保护的灰树花菌株HMGIM-W151021，包括该菌株繁殖所产生的与所述菌株具有相同遗传学和/或形态学性状后代，还包括由灰树花菌株HMGIM-W151021培育得到的孢子和/或菌丝体和/或子实体。

本发明的第二个目的是提供上述灰树花菌株HMGIM-W151021在如下(1)-(5)至少一项中的应用：

(1)制备多糖；

(2)作为亲代培育优良性状品种；

(3)工厂化栽培；

(4)制备灰树花子实体、菌丝体和/或孢子；

(5)制备食品或药品。

优选地，所述的优良性状包括高产多糖、耐缺氧、生长周期短、出菇数量高、子实体朵型完整、出菇整齐度高、菌质脆嫩中的一种或多种。

本发明的第三个目的是提供一种上述灰树花菌株HMGIM-W151021的栽培方法，包括以下步骤：

a.将所述灰树花菌株HMGIM-W151021的菌种或子实体接种到母种培养基上培养得到母种菌丝；

b.将所述母种菌丝接种到原种培养基中扩大培养得到原种菌丝；

c.将所述原种菌丝接种到栽培料培养基中进行栽培和出菇管理。

优选地，所述母种培养基的成分及其质量分数为：马铃薯20％+葡萄糖2％+蛋白胨0.3％+酵母提取粉0.1％+琼脂2％+磷酸二氢钾0.3％+硫酸镁0.15％+维生素B1微量。

优选地，所述原种培养基的成分及其质量分数为：38-42％棉籽壳+35-40％木屑+18-20％麸皮+1-2％碳酸钙。

优选地，所述栽培料培养基的成分及其质量分数为：48-52％木屑+28-32％棉籽壳+18-22％麸皮+1-2％硫酸钙。

优选地，所述的原种培养基和栽培料培养基是装于菌袋中对菌种进行培养的，所述装袋是通过取棉籽壳，经水泡湿过夜，混入木屑、麸皮、碳酸钙，装入聚丙烯菌种袋中；装好料后用小木棒在袋料中打洞，洞深至袋底，然后在袋口套上塑料环，扣上配套的盖子，进行高温高压湿热灭菌制得的。

优选地，所述的菌袋栽培，其栽培条件为：菌丝培养时，置于22-24℃恒温、遮光培养，其中湿度65-75％，二氧化碳浓度2500-3000ppm，培养温度不超过25℃；待菌丝成熟后，置于25℃遮光处，继续培养5-7天。

优选地，步骤c所述的出菇管理，包括原基诱导、原基分化开叶和子实体采收，其中，所述原基诱导的条件为：每天光照24小时，湿度80-90％，温度18-20℃，二氧化碳浓度小于3000ppm；所述原基分化开叶的条件为：光照每天12-20小时，湿度95-98％，温度18-20℃，二氧化碳浓度小于1000ppm；所述子实体采收是在叶片增厚即分化菌孔前及时采收。

本发明的第四个目的是提供一种灰树花菌株HMGIM-W151021的特异性InDel位点，本发明利用全基因组重测序技术对灰树花W151021菌株进行基因组重测序，以已发表的灰树花全基因组(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/45365？genome_assembly_id＝278977)为参考基因组，获得灰树花W151021菌株InDel位点，开发全基因组范围内的InDel分子标记。所述InDel位点是在灰树花染色体LUGG01000006.1第568442位碱基(T)处插入碱基如下片段：TGTAGAGAACAAGCCGGCGAGCAATCGAATAGGGCCCGATGCCCGCACGTA。

本发明的第五个目的是针对上述的特异性InDel位点提供一种鉴定灰树花菌株HMGIM-W151021的特异性引物，所述的特异性引物为：

G3-F：GGCGAGCAATCGAATAGGGC，

G3-R：TCTGTCCTTCGGCGTCCTCA。

进一步地，上述特异性引物包括但不限应用于鉴定灰树花菌株HMGIM-W151021或筛选由灰树花菌株HMGIM-W151021培育得到的灰树花新品种中。

优选地，所述的鉴定灰树花菌株HMGIM-W151021，包括以下步骤：采用上述的特异性引物G3-F/G3-R作为PCR引物，以待测样品的基因组DNA为模板DNA，进行PCR反应，检测有PCR产物且约为500bp的则鉴定为待测样品为灰树花菌株HMGIM-W151021。

更优选地，所述的PCR反应，其PCR体系为：

所述的PCR反应，其PCR扩增程序为：

本发明第六个目的是提供一种灰树花菌株HMGIM-W151021的鉴定试剂盒，包括上述的特异性引物G3-F/G3-R。

优选地，还包括真菌核糖体基因间隔区通用引物ITS1/ITS4(ITS1:TCCGTAGGTGAACCTGCGG，ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC，以作为阳性对照。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明灰树花菌株HMGIM-W151021活性较强，在通风条件较佳(二氧化碳浓度<500ppm)的情况下比主栽市场品种庆元菌株要早出菇3-5天；在通风条件较差(二氧化碳浓度>1000ppm)的情况下能够正常出菇，而庆元菌株不能开伞正常出菇，具有工厂化栽培的优势；

(2)本发明灰树花菌株HMGIM-W151201的多糖含量比市场主栽品种高出110％以上，而灰树花多糖是其活性的主要物质，表明其可作为高价值的保健食品或药品使用；

(3)本发明灰树花菌株HMGIM-W151021产量高，每个菇袋可产菇超过100克；

(4)本发明灰树花菌株HMGIM-W151021子实体性状优良，子实体较易开盖，出菇整齐度高；且相较庆元菌株，菌质更为脆嫩，作为食品其口感好；

(5)本发明提供的人工栽培方法可以使得灰树花菌株HMGIM-W151021子实体朵型更为完整，在较佳栽培配方与条件下进行栽培，商品性状良好；

(6)本发明中的灰树花新菌株HMGIM-W151021采自于华南地区，不同于以往报道的分布于东北和华北等地区，因而拓宽了灰树花分布地图；

(7)本发明提供的特异性引物G3-F/G3-R，能够更好鉴定、筛选灰树花菌株HMGIM-W151021，从而保护该菌株资源。

保藏说明：

本发明的Grifola frondosa HMGIM-W151021，于2020年8月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编为：510070，保藏编号为：GDMCC No：61165。

附图说明：

图1为本发明灰树花菌株HMGIM-W151021的野生子实体。

图2为本发明灰树花菌株HMGIM-W151021的出菇示意图。

图3为本发明灰树花菌株HMGIM-W151021与主栽市场品种的栽培对比(A、B两图均为左：庆元菌株；右：HMGIM-W151021)。

图4为本发明灰树花HMGIM-W151021经人工驯化获得的子实体。

图5为本发明灰树花菌株HMGIM-W151021和10株对照菌株ITS-PCR产物电泳结果，其中标记M：DL2000 DNAMarker；标记1：灰树花菌株HMGIM-W151021；标记2-11：10株对照菌株。

图6为本发明灰树花菌株HMGIM-W151021和10株对照菌株的特异性引物PCR产物电泳结果，其中标记M：DL2000 DNAMarker；标记1：灰树花菌株HMGIM-W151021；标记2-11：10株对照菌株。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。除非特殊说明，以下实施例所用到的实验材料、试剂等均可从商业渠道获得。

实施例1：本发明灰树花菌株HMGIM-W151021的采集、纯化及鉴定

菌株来源：2015年9月在广东车八岭采集到一份灰树花(初步鉴定)标本。

纯化、鉴定：所述灰树花标本野生子实体形态如图1所示。经组织分离法得到其PDA纯培养物，通过液体培养收集菌丝，低温(40℃)烘干，使用液氮研磨，利用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒(商品编号SK8259，生工生物工程(上海)股份有限公司生产)，进行DNA基因组的提取，得到的DNA溶液-20℃冷藏备用。通过真菌核糖体基因间隔区通用引物ITS1/ITS4(ITS1:TCCGTAGGTGAACCTGCGG，ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)进行材料的ITS-PCR实验，扩增在Biometra PCR仪上进行，PCR反应液组成(共50μl)为：

相关试剂(商品编号R001A)由宝生物工程(大连)有限公司生产。反应条件为：94℃反应5min；94℃反应1min，55℃反应1min，72℃反应1min，30个循环；72℃反应10min。PCR产物直接送检进行双向测序，由华大基因完成。其ITS序列为：

gggctacgagtcgaacggttgtcgctggcctcaaatccggggcatgtgcacaccctgctcatccactctcacacctgtgcactttctgtaggtcggttcgggatctggtccctcgcggggtcgggttctgcgccttcctatgtacgatcacaaacgcttcagtattcagaatgtcattgcgataattaaaacgcatcttatacaactttcagcaacggatctcttggctctcgcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcaccttgcgctccttggtattccgaggagcatgcctgtttgagtgtcatggaattctcaacccacacatccttgtgacgtggacgggcttggactttggaggtttctgccggccccccattcgggtcggctcctctggaatgcattagctccatcccttgcggatcggctctcggtgtgataattgtctacgccgcggtcgttgaagcctcagtcgggagagctcataatcgtcccttcgggacaattgaatatgacatctgacctcaaatcagtagacgcattcc(SEQID NO.1)。

测序结果在GenBank进行序列Blast，发现与灰树花Grifola frondosa相似性为98.76％，因此结合形态学鉴定，该真菌标本宏观特征和显微特征与IGrifola frondosa描述一致，鉴定结果为Grifola frondosa。将其命名为Grifola frondosa HMGIM-W151021，并于2020年8月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编为：510070，保藏编号为：GDMCC No：61165。

实施例2本发明灰树花菌株HMGIM-W151021人工栽培方法

一、培养基种类及其配方

下述配方中的成分％是指质量分数。

1.分离母种培养基

配方：加富综合PDA(马铃薯20％+葡萄糖2％+琼脂2％+蛋白胨0.5％+磷酸二氢钾0.3％+硫酸镁0.15％+维生素B10.01ppm)。

2.生产母种培养基

配方：综合PDA(马铃薯20％+葡萄糖2％+蛋白胨0.3％+酵母提取粉0.1％+琼脂2％+磷酸二氢钾0.3％+硫酸镁0.15％+维生素B1微量)。

3.原种培养基

配方：40％棉籽壳+38％木屑+20％麸皮+2％碳酸钙。

4.生产种培养基

配方：40％棉籽壳+38％木屑+20％麸皮+2％碳酸钙。

5.栽培料培养基

配方：50％木屑+30％棉籽壳+18％麸皮+2％硫酸钙。

二、制种、栽培及管理

1.母种制作

1.1分离培养基

按照分离母种培养基配方将各营养成分及琼脂，分装试管，在0.11MPa大气压、121℃高温高压湿热灭菌30min，取出冷却摆成斜面。采集回来的野生子实体在无菌条件下用75％酒精擦拭表面后，撕开，以无菌操作方式接入0.2-0.5mm×0.2-0.5mm的菌肉组织。置于25℃培养箱中恒温暗培养，待菌丝长满斜面后后则可进行转接。

1.2生产母种

按照生产母种培养基配方常规制作综合PDA斜面，分装试管，在0.11MPa大气压、121℃高温高压湿热灭菌30min，取出冷却无菌操作接入分离成功的菌种。置于25℃培养箱中恒温暗培养，待菌丝长满斜面后后则可进行转接。母种长满的时间大概在10-15d之间。

2.原种制作

按照原种培养基配方称取所需比例的棉籽壳，经水泡湿过夜，按比例混入木屑、麸皮、碳酸钙，装入13cm×25cm耐高温的透明聚丙烯菌种袋中，折合每袋装干料250-300g。装好料后用小木棒在袋料中打洞，洞深至袋底，然后在袋口套上塑料环，扣上配套的盖子，即得一个制好的原种袋料。在0.147MPa大气压、128℃高温高压湿热灭菌90min，取出冷却后无菌操作接入生产母种。接种时确保母种料块埋入原种料中。把已接种的原种置于25℃培养箱中恒温暗培养，待菌丝吃满料后(30d左右)则可作为原种使用接入栽培袋中。

3.生产种制作

按照生产种培养基配方制作菌种袋，制作过程同原种培养基，但所用袋子为15cm×30cm耐高温的透明聚丙烯菌种袋。折合每袋装干料350-400g。生产种长满时间大约为30d。

4.栽培袋制作

按照栽培料培养基配方制作栽培袋，制作过程同原种培养基，但所用配方不同，并采用的是15cm×30cm耐高温的透明聚丙烯菌种袋。折合每袋装干料300-350g。长满时间大约为30d。

5.栽培管理

5.1菌丝培养：栽培袋接种后在22-24℃、空气相对湿度65-75％，二氧化碳浓度2500-3000ppm的培养室中避光培养，注意培养温度不能超过25℃。

5.2菌丝后熟：待栽培袋中的菌丝长满袋中栽培料后置于25℃遮光处继续培养5-7天。

出菇处理时机：在菌丝开始漫延到盖子上，在盖子内部形成原基之前进行出菇处理。

5.3原基诱导：把栽培袋竖排放置(袋与袋之间应留有空隙)，揭开栽培袋盖子再松扣回套环上，置于18-20℃保持80-90％的相对湿度，用蓝光每天光照24小时，每天更换新风2次，每次1小时，二氧化碳浓度小于3000ppm，即0.3％，维持10-12天。等袋口原基形成并转成黑色，即揭去盖子操作。

5.4原基分化开叶：揭去菌盖，将菌袋置于温度18-20℃，湿度95-98％条件下(保障有间断性的水雾)，每天光照12-20小时，每天更换新风4-5次，确保空气新鲜，二氧化碳浓度小于1000ppm，维持12-15天。

5.5子实体采收：在叶片增厚(分化菌孔)前及时采收，此时子实体大小变化已经很小，菌盖开始平展，说明子实体已趋成熟。每批菌包可采收1次，用小刀切割采收子实体。

5.6采后处理：采收完须清除菌包，清洁室内，恢复干燥、整洁的环境。

四、出菇情况

HMGIM-W151021菌株的活力强，在培养后期，料面的菌丝开始增多变成浓密，料面变白，容易形成原基，一旦发现菌丝开始生长到盖子内部，须进行出菇处理，防止其在盖子内部形成原基。HMGIM-W151021菌株的出菇情况如图2所示。

蓝色光有助于形成深色的叶片，光照时间越长，所形成的叶片色泽越深。

五、与主栽市场品种的对比

与来源于庆元产区的主栽品种(以下称庆元菌株)进行了栽培对比，庆元菌株的栽培方法和条件均与本发明菌株HMGIM-W151021的相同。

菌丝满袋时间均为21天，同样出菇条件下(光照每天12-20小时，湿度95-98％，温度18-20℃，二氧化碳浓度为700-900ppm)，庆元菌株大部分没有分化出叶片，HMGIM-W151021能够正常开伞，平均产量107克(图3)。

HMGIM-W151021生长周期约62天，活性较强，在通风条件较佳(二氧化碳浓度<500ppm)的情况下比庆元菌株早出菇3-5天。在通风条件较差(二氧化碳浓度>1000ppm)的情况下能够正常出菇，而庆元菌株不能开伞正常出菇，具有工厂化栽培的优势。

HMGIM-W151021子实体随光照弱至强呈现灰白色至深灰色，叶片呈花瓣状，子实体较易开盖，出菇整齐度高(图4)。相较庆元菌株，菌质更为脆嫩。与野生状态相比，该品种在人工驯化后子实体朵型完整，在较佳栽培配方与条件下进行栽培，商品性状良好。

实施例3本发明灰树花菌株HMGIM-W151021营养成分的测定

对实施例2栽培得到的灰树花菌株HMGIM-W151021栽培子实体和市场主栽品种庆元菌株进行多项营养成分测定，从营养成分对比(表1)可以看出，灰树花HMGIM-W151201的蛋白质含量比庆元菌株稍低，多糖含量则高出110％以上，而灰树花多糖是其活性的主要物质。从营养成分上看，含有18种氨基酸，其中包括人体必需的8种氨基酸，氨基酸种类齐全，氨基酸总和在15.1g/100g。

表1市场主栽灰树花与灰树花HMGIM-W151201的营养成分对比

实施例4本发明灰树花菌株HMGIM-W151021的分子标记及其特异性引物

1、菌种基因组DNA提取

以本团队采集的3株野生灰树花菌种(W160354(江西省鹰潭市)，W160365(江西省鹰潭市)，A190110(吉林省吉林市))和市场常用的7株灰树花市场种菌种(MC-GF-0049(河北迁西)，MC-GF-007(浙江庆元)，MC-GF-010(浙江庆元)，MC-GF-011(福建三明)，MC-GF-013(江苏泗阳)，MC-GF-015(广东佛山)，MC-GF-017(福建漳州))为对照菌株，将灰树花菌株W151021菌种和10株对照菌株菌种同时分别转接到覆盖有赛璐玢薄膜的PDA平板上，25℃避光培养5-7天获得新鲜菌丝体。使用无菌镊子收集适量菌丝体于研磨管中，利用全自动核酸提取仪配套使用磁珠法真菌基因组DNA提取试剂盒(广州迈宝生物科技有限公司，货号DNF628-05B[定制版])提取菌丝体的基因组DNA。得到的DNA溶液(DNA模板)冷藏于-20℃备用。

2、菌种ITS鉴定

通过真菌核糖体基因间隔区通用引物ITS1/ITS4(ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG，ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)进行ITS-PCR实验，扩增在Biometra PCR仪上进行，PCR反应液组成(共50μl)如下：

真菌ITS-PCR体系：

真菌ITS-PCR扩增程序：

取10μL PCR产物及DNAMarker点样于1％(质量体积比)琼脂糖凝胶，80V电压下电泳30min，然后将琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪观察。结果如图5，灰树花菌株W151021和10株对照菌株皆有条带，证明所提DNA无质量问题。剩余PCR产物送检进行双向测序，由华大基因完成。将灰树花菌株W151021和10株对照菌株的测序结果与模式种ITS序列进行比对，鉴定结果皆为灰树花(Grifola frondosa)。

3、全基因组重测序

样品基因组DNA检测合格后，利用超声波将DNA序列片段化形成随机片段，对片段化的DNA进行末端修复、3′端加A、连接测序接头后，再利用用磁珠吸附进行富集，富集400bp左右的随机片段，经过PCR扩增形成测序文库。建好的文库先进行文库质检，质检合格的文库用Illumina HiSeqTM平台进行测序，测序策略为Illumina PE150，总测序读长为300bp。在Illumina HiseqTM测序数据(Raw Data)下机之后，对下机数据进行质量控制，过滤其中低质量的数据，获得高质量的数据(Clean Data)。利用BWA软件将Clean Data比对到参考基因组序列(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/45365？genome_assembly_id＝278977)上，获得序列的位置归属(即BAM文件)。利用GATK的Best Practices流程对BAM文件进行校正，并进行Small InDel标记的检测。利用SNPEff软件和参考基因组的基因预测信息进行变异功能注释，得到InDel的功能注释信息。本次分析数据量为7.53Gbp的Clean Data，Q30达到95.01％。样品与参考基因组平均比对率为90.34％，平均覆盖深度为21X，基因组覆盖度为91.13％。

4、特异性引物设计

基于全基因组重测序的InDel检测结果，根据测序深度及插入/缺失片段碱基数筛选灰树花菌株W151021的特异性InDel位点，该位点在染色体LUGG01000006.1第568442位碱基(T)处插入碱基片段：

TGTAGAGAACAAGCCGGCGAGCAATCGAATAGGGCCCGATGCCCGCACGTA(SEQ ID NO.2)，并进行相应的特异性引物设计，以灰树花菌株W151021和10株对照菌株的基因组DNA为模板进行PCR筛选验证，最终获得1对特异性强且具灰树花菌株W151021专一性的特异性引物，具体为：

G3-F：GGCGAGCAATCGAATAGGGC(SEQ ID NO.3)；

G3-R：TCTGTCCTTCGGCGTCCTCA(SEQ ID NO.4)。

5、PCR鉴定

以灰树花菌株W151021和10株对照菌株的基因组DNA为模板，使用特异性引物G3-F和G3-R进行PCR扩增。

灰树花菌株W151021特异性引物PCR体系：

灰树花菌株W151021特异性引物PCR扩增程序：

取15μL PCR产物及DNAMarker点样于1％(质量体积比)琼脂糖凝胶，80V电压下电泳30min，然后将琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪观察。结果如图6，仅灰树花菌株W151021在约500bp处有一特异性条带，而10株对照菌株皆无条带。

将特异性引物PCR产物送检进行双向测序，由华大基因完成。通过测序获得灰树花菌株W151021特异性引物对G3-F/G3-R扩增序列：

aatagggcccgatgcccgcacgtaaagggttacaaacgagtgaggaatactaccaacgacgcccgctgcaaactcttcccagctttcccacggtcatgcacttcacgccgctcgccacaaccaatccaaaagccaacatcggtatgggggtattcgcaccagtgctagcggggctcttcgcgagcgagttcgacagtgcaccgataagcgattgtgcagcagcggatgttgcgggaaggttcgtattgccagagggtagggtcagtccggagaaggtcgcaaatggatttgttggctctgcgcgcggtgtcgtaatcggactcgcatgacgagactgacaataaaaatgtcagatggtaggagagttgggacagataagaaaggctgctccatggaaagtaattatatcatgcgaatttcaaccttgacctcaacggctactggatcaatgactttgaggacgcc(SEQ ID NO.5)，该特异性核酸序列共计465bp，与电泳条带大小吻合。因测序仪器的原因，不同的测序仪测得该特异性条带的长度可能有所差异，但会处于500bp附近。

序列表

<110> 广东省科学院微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）

<120> 一株高产多糖灰树花新菌株W151021及其分子标记

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 595

<212> DNA

<213> 灰树花HMGIM-W151021(Grifola frondosa)

<400> 1

gggctacgag tcgaacggtt gtcgctggcc tcaaatccgg ggcatgtgca caccctgctc 60

atccactctc acacctgtgc actttctgta ggtcggttcg ggatctggtc cctcgcgggg 120

tcgggttctg cgccttccta tgtacgatca caaacgcttc agtattcaga atgtcattgc 180

gataattaaa acgcatctta tacaactttc agcaacggat ctcttggctc tcgcatcgat 240

gaagaacgca gcgaaatgcg ataagtaatg tgaattgcag aattcagtga atcatcgaat 300

ctttgaacgc accttgcgct ccttggtatt ccgaggagca tgcctgtttg agtgtcatgg 360

aattctcaac ccacacatcc ttgtgacgtg gacgggcttg gactttggag gtttctgccg 420

gccccccatt cgggtcggct cctctggaat gcattagctc catcccttgc ggatcggctc 480

tcggtgtgat aattgtctac gccgcggtcg ttgaagcctc agtcgggaga gctcataatc 540

gtcccttcgg gacaattgaa tatgacatct gacctcaaat cagtagacgc attcc 595

<210> 2

<211> 51

<212> DNA

<213> 灰树花HMGIM-W151021(Grifola frondosa)

<400> 2

tgtagagaac aagccggcga gcaatcgaat agggcccgat gcccgcacgt a 51

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggcgagcaat cgaatagggc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tctgtccttc ggcgtcctca 20

<210> 5

<211> 465

<212> DNA

<213> 灰树花HMGIM-W151021(Grifola frondosa)

<400> 5

aatagggccc gatgcccgca cgtaaagggt tacaaacgag tgaggaatac taccaacgac 60

gcccgctgca aactcttccc agctttccca cggtcatgca cttcacgccg ctcgccacaa 120

ccaatccaaa agccaacatc ggtatggggg tattcgcacc agtgctagcg gggctcttcg 180

cgagcgagtt cgacagtgca ccgataagcg attgtgcagc agcggatgtt gcgggaaggt 240

tcgtattgcc agagggtagg gtcagtccgg agaaggtcgc aaatggattt gttggctctg 300

cgcgcggtgt cgtaatcgga ctcgcatgac gagactgaca ataaaaatgt cagatggtag 360

gagagttggg acagataaga aaggctgctc catggaaagt aattatatca tgcgaatttc 420

aaccttgacc tcaacggcta ctggatcaat gactttgagg acgcc 465

Claims (10)

1.一株灰树花(Grifola frondosa)菌株HMGIM-W151021，其保藏编号为GDMCC No：61165。

2.权利要求1所述的灰树花菌株HMGIM-W151021在如下(1)-(5)至少一项中的应用：

(1)制备多糖；

(2)作为亲代培育优良性状品种；

(3)工厂化栽培；

(4)制备灰树花子实体、菌丝体和/或孢子；

(5)制备食品和/或药品。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的优良性状包括高产多糖、耐缺氧、生长周期短、出菇数量高、子实体朵型完整、出菇整齐度高、菌质脆嫩中的一种或多种。

4.一种权利要求1所述灰树花菌株HMGIM-W151021的栽培方法，其特征在于，包括以下步骤：

a.将所述灰树花菌株HMGIM-W151021的菌种或子实体接种到母种培养基上培养得到母种菌丝；

b.将所述母种菌丝接种到原种培养基中扩大培养得到原种菌丝；

c.将所述原种菌丝接种到栽培料培养基中进行栽培和出菇管理。

5.根据权利要求4所述的栽培方法，其特征在于，所述母种培养基的成分及其质量分数为：马铃薯20％+葡萄糖2％+蛋白胨0.3％+酵母提取粉0.1％+琼脂2％+磷酸二氢钾0.3％+硫酸镁0.15％+维生素B1微量；所述原种培养基的成分及其质量分数为：38-42％棉籽壳+35-40％木屑+18-20％麸皮+1-2％碳酸钙；所述栽培料培养基的成分及其质量分数为：48-52％木屑+28-32％棉籽壳+18-22％麸皮+1-2％硫酸钙。

6.根据权利要求4所述的栽培方法，其特征在于，步骤c所述的菌袋栽培，其栽培条件为：菌丝培养时，置于22-24℃恒温、遮光培养，其中湿度65-75％，二氧化碳浓度2500-3000ppm，培养温度不超过25℃；待菌丝成熟后，置于25℃遮光处，继续培养5-7天。

7.根据权利要求4所述的栽培方法，其特征在于，步骤c所述的出菇管理，包括原基诱导、原基分化开叶和子实体采收，其中，所述原基诱导的条件为：每天光照24小时，湿度80-90％，温度18-20℃，二氧化碳浓度小于3000ppm；所述原基分化开叶的条件为：光照每天12-20小时，湿度95-98％，温度18-20℃，二氧化碳浓度小于1000ppm；所述子实体采收是在叶片增厚即分化菌孔前及时采收。

8.一种灰树花菌株HMGIM-W151021的特异性InDel位点，其特征在于，所述InDel位点是在灰树花染色体LUGG01000006.1第568442位碱基(T)处插入碱基如下片段：

TGTAGAGAACAAGCCGGCGAGCAATCGAATAGGGCCCGATGCCCGCACGTA。

9.一种鉴定灰树花菌株HMGIM-W151021的特异性引物，其特征在于，所述的特异性引物为：

G3-F：GGCGAGCAATCGAATAGGGC，

G3-R：TCTGTCCTTCGGCGTCCTCA。

10.一种灰树花菌株HMGIM-W151021的鉴定试剂盒，其特征在于，包括权利要求9所述的特异性引物。

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