CN111484940A - 一种真菌类产品的制备方法及应用 - Google Patents

一种真菌类产品的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种真菌类产品的制备方法及应用，该方法包括：选取食用真菌灰树花菌种，依次进行液体发酵和固体发酵，得到含灰树花菌丝体的固体发酵产物；再经后处理，得到真菌类产品。本发明利用食用真菌灰树花菌种进行液体发酵和固体发酵，获得含灰树花菌丝体的固体发酵产物，即真菌类产品，以该真菌类产品作为畜牧饲料添加剂，能够有效提高小鼠免疫能力、围产期奶牛产奶量、犊牛机体的抗氧化能力和免疫功能、断奶仔猪健康状况以及蛋鸡的产蛋能力。

Description

一种真菌类产品的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种真菌类产品的制备方法及应用。
背景技术
灰树花，又称粟蘑、莲花菌、贝叶多孔菌、千佛菌等，日本称“舞茸”，是食、药兼用蕈菌，夏秋间常野生于栗树周围，肉食鲜美，营养丰富。灰树花(Grifola frondosa)隶属于担子菌亚门，层菌纲，无革担子菌亚纲，非褶菌目，多孔菌科，树花属，学名灰树花。
1984年日本学者0hno等首次报道了灰树花多糖具有增强免疫和抗肿瘤活性。以栽培灰树花子实体为原料，浙江方格药业研制的灰树花胶囊被批准为肿瘤辅助用药(国药准字B20020023)。
无抗生素养殖是大势所趋，采用能够显著提高动物免疫功能的饲料添加剂，则是一种解决方案。比如，一种采用虫草真菌地顶孢霉发酵产物制备的产品，能显著提升小鼠适应性细胞免疫水平(CN2014100166172，李洋等,2016,动物营养学报,28:2657)，降低牛乳体细胞数量、改善奶牛乳房炎(CN201410691428，YZ.Wang et al,2019,Animal FeedScience&Technology,256:114260)，具有抗疲劳活性并能缓解癌症恶病质(Qiang Shen etal,2019,RSC Advances,9:17440)。
目前，利用灰树花制备饲料添加剂的研究已有报道，其主要集中于灰树花子实体的利用，例如：申请公开号为CN104543345A的发明专利申请文献公开了一种全灰树花饲料添加剂的制备方法，其采用人工栽培的食药两用菌灰树花经热水提取、浓缩提取液、浓缩液与菇体混合、干燥、粉碎等步骤制备获得。亦或是，采用灰树花多糖提取物作为饲料添加剂的其中一个辅助组分，例如：申请公开号为CN106359902A的发明专利申请文献公开了一种可替代抗生素的中药饲料添加剂，其中就包含少量灰树花多糖以及大量其他中药材。在该饲料添加剂中灰树花多糖并非主要成分，而仅作为辅助成分进行使用。
但是，关于灰树花菌种发酵物的使用却鲜有报道，尤其是作为饲料添加剂的主要成分在改善畜牧动物生长、发育和生产等方面的研究更是未见报道。
发明内容
本发明提供了一种真菌类产品的制备方法及应用，具体涉及灰树花菌种发酵物的制备方法以及其在改善畜牧动物生长、发育和生产等方面的应用，该灰树花菌种发酵物通过液体和固体发酵后获得的发酵产物能够有效提高小鼠免疫能力、围产期奶牛产奶量、犊牛机体的抗氧化能力和免疫功能、断奶仔猪健康状况以及蛋鸡的产蛋能力。
具体技术方案如下：
一种真菌类产品的制备方法，包括：选取食用真菌灰树花菌种，依次进行液体发酵和固体发酵，得到含灰树花菌丝体的固体发酵产物；再经后处理，得到真菌类产品。
进一步地，所述真菌类产品的具体制备步骤，包括：
(1)将食用真菌灰树花菌种接种到种子培养液中进行增殖培养，得到种子液；
(2)将步骤(1)所述的种子液转接至发酵培养液中进行液体发酵，得到发酵液；
(3)将步骤(2)所述的发酵液与固体基质混合均匀后，得到混合物，调节混合物的含水量至75～80％后，进行固体发酵，得到含灰树花菌丝体的固体发酵产物；再经烘干、粉碎，得到真菌类产品。
本发明采用的种子培养液、发酵培养液和固体基质均为常规培养液/基，主要包括氮源、碳源和微量元素。
进一步地，步骤(1)中，所述种子培养液的配方包括：玉米粉0.8-1.5％，黄豆粉0.8-1.5％，蔗糖1-5％和KH2PO4 0.1％；所述增殖培养的条件为：20～30℃，100～130转/分钟。
进一步地，步骤(2)中，以发酵培养液的质量百分数计，所述发酵培养液的组分和用量，包括：玉米粉0.8-1.5％，黄豆粉0.8-1.5％，蔗糖1-5％和KH2PO4 0.1％；
所述液体发酵的条件为：温度为25～28℃，每分钟通气量为1:0.4-0.6(v/v)，时间为30～50小时。
进一步地，步骤(3)中，步骤(3)中，固体基质以干重计，所述发酵液与固体基质混合时的体积质量比为1L:3-20kg；
以固体基质的质量百分数计，所述固体基质的组分和用量，包括：玉米粉40-70％，豆粕10-40％和麸皮5-20％；
所述固体发酵的条件为：温度为22-28℃，湿度为75-80％，时间为3-7天；
调节混合物的含水量至75-80％，并将所述混合物均匀摊薄至5～10cm的疏松薄层后，再进行固体发酵。
本发明还提供了一种如上文所述的制备方法制得的真菌类产品。
本发明还提供了所述的真菌类产品在制备饲料添加剂中的应用。
进一步地，所述饲料添加剂用于提高围产期奶牛产奶量，和/或犊牛机体的抗氧化能力和免疫功能，和/或断奶仔猪健康状况，和/或蛋鸡的产蛋能力。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明利用食用真菌灰树花菌种进行液体发酵和固体发酵，获得含灰树花菌丝体的固体发酵产物，即真菌类产品，以该真菌类产品作为畜牧饲料添加剂，能够有效提高小鼠免疫能力、围产期奶牛产奶量、犊牛机体的抗氧化能力和免疫功能、断奶仔猪健康状况以及蛋鸡的产蛋能力。
(2)本发明采用工厂化工业生产，能快速获取大量活性培养物，而且工艺和质量稳定可控。
附图说明
图1为实施例1中PDA平板上灰树花菌株的菌落照片。
图2为实施例2中灰树花固体培养物的照片。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。
实施例1真菌类产品的制备
1制备种子液
取4℃保藏的灰树花菌株(Grifola frondosa,CGMCC5.736)，接种于PDA斜面，25℃培养5天；斜面菌落转接至装有200ml的液体培养基的1000ml三角瓶中，26℃、120r/min震荡培养3至4天，液体培养基配方为玉米粉1.0％、黄豆粉1.0％，蔗糖3.0％、KH2PO4 0.1％；按体积分数10％的接种量将培养液再转接一次，在相同条件下震荡培养2天，获得种子液。
2液体发酵
在50L气升式发酵罐中，加入30L发酵培养液，并加入适量泡敌，115℃保温灭菌20分钟；待温度降至26℃，接入600ml种子液；保持罐内温度26℃，通气量20L/min，发酵48h放罐，得一级发酵液。
一级发酵液可直接接种固体基质进行液固二相发酵，也可作为种子液接种500L发酵罐进行扩大发酵。
扩大发酵时，在500L发酵罐中，加入300L发酵培养液，并加入适量泡敌，115℃保温灭菌20分钟，待温度降至26℃，接入30L一级发酵液，保持温度26℃，通气量250L/min，发酵36h放罐，得二级发酵液。
发酵培养液的配方为：玉米粉1.0％、黄豆粉1.0％，蔗糖3.0％、KH2PO4 0.1％，pH自然。
3固体发酵
将二级发酵液通过无菌管道接种至位于万级洁净车间内，经过蒸汽灭菌的固体培养中，以20L：100kg混合均匀，调节混合物的含水量80％，然后将混合物铺盘，均匀摊薄为5cm左右疏松薄层。
保持培养车间内温度26℃、空气湿度80％，根据需要可以间歇喷射无菌水雾至固体发酵物上。以混合物表面和间隙完全被白色紧实菌丝充满为发酵终点，一般需四至五天。
将固体发酵产物置于50至60℃沸腾烘干，粉碎、过筛后，获得真菌类产品，即灰树花发酵物。
固体培养基的配方为：玉米粉60％，豆粕25％，麸皮15％。
实施例2灰树花发酵物提升小鼠免疫功能
取体重18～20g的C57 SPF小鼠，雌雄各半，随机分成试验组(低剂量组和高剂量组)和对照组，每组10只。将灰树花发酵物溶于灭菌水中(0.2ml)灌胃动物，剂量分别为0.6g/kg(低剂量组)、1.8g/kg(高剂量组)；对照组仅灌胃同等体积的灭菌水的。两周以后，逐组处死动物，摘取脾脏，取脾细胞，测定相关免疫学细胞指标。具体步骤如下：
1)分离的小鼠脾脏，100目金属网研磨，得到单细胞悬液，1500rmp离心去上清，红细胞裂解液(Yeasen，USA)裂解，用PBS洗涤两遍，调整细胞浓度为107/ml，培养于完全RPMI1640(Hyclone)培养基中。
2)加入刺激剂PMA(佛波酯)，离子霉素(Ionomycin)以及蛋白转运抑制剂莫能霉素(Monensin)至终浓度分别为30ng/ml、1μg/ml、1.7μg/ml。37℃CO2刺激培养4小时。
3)收获细胞于EP管中，100μl/管，PBS缓冲液洗两遍，小鼠脾细胞重悬于100μl PBS缓冲液中并加入新鲜大鼠血清或者大鼠IgG放置30min以封闭细胞表面Fc段受体，然后加入抗-CD3，-CD4，-CD8，-NK1.1，-γδ的抗体，4℃，避光染色30min，用PBA洗三次，加入100μl固定液，4℃，避光固定30min。
4)用穿膜液洗一次，重悬于100μl穿膜液中，加入新鲜大鼠血清或者大鼠IgG放置封闭30min后，分别加入PE标记抗胞内因子抗体(抗-IL-4和-IFNγ)，染色1小时。穿膜液和PBS各洗一遍后重悬于PBA中，用流式细胞仪检测。
上述各步骤中所用的各种抗体和标记物等试剂，均为美国Santa Cruz公司产品。免疫学指标测定结果如表1所示。
表1菌丝提取物对小鼠免疫学指标的影响(n＝10)
Figure BDA0002462399640000041
Figure BDA0002462399640000051
注：a、b分别表示与对照组相比各免疫学指标的差异显著性(P<0.05,P<0.01)
表1结果显示：连续两周饲喂灰树花发酵物，高剂量组CD3细胞比例显著增加，CD4和γδT细胞比例则在各个剂量组都显著增加，其中CD4 IFNγ也均显著升高，CD4IL-4在高剂量组显著降低；NK和NKT细胞则没有明显变化。
结果表明，灰树花发酵物能刺激CD4细胞的增殖，促进其分泌IFNγ、抑制IL4合成，调整Th1/Th2平衡，进而显著改善小鼠的适应型细胞介导的免疫功能。
实施例3灰树花发酵物作为饲料添加剂饲喂围产期奶牛试验
成年健康Holstein围产期奶牛(600±25kg)20头，随机分为两组(试验组和对照组)，每组十头。与对照组相比，试验组于预产期前14±3天开始每日每头牛额外给予30克(50mg/kg)灰树花发酵物，持续到产后21天；对照组仅饲喂基础日粮。
表2.灰树花发酵物饲喂围产期奶牛试验(n＝10)
Figure BDA0002462399640000052
试验结果表明，采食灰树花发酵物能够增加日采食量，极显著提高产奶量16％(21.36vs24.87)。
乳房炎是奶牛养殖行业长期未解的痼疾。本实验结果显示，灰树花发酵物还极显著降低了奶品中体细胞计数，说明奶牛乳腺的炎症程度显著缓解。
实施例4灰树花发酵物作为饲料添加剂饲喂犊牛试验
两月龄Holstein犊牛(85.8±4.6kg)24头，随机分为两组(试验组和对照组)，每组12头。与对照组相比，试验组每日每头牛额外给予50mg/kg灰树花发酵物；对照组仅饲喂基础日粮。
试验开始后第20天和第40天，分别测定犊牛相应生长指标；并抽血分离血浆，比色法测定总抗氧化活性(T-AOC)、超氧化物歧化酶活性(SOD)、谷胱甘肽超氧化物酶活性(GSH-Px)，试剂盒为南京建成生物工程公司产品；ELISA测定血清免疫球蛋白A/G/M(IgA/IgG/IgM)、白细胞介素1/2/4/6(IL1/IL2/IL4/IL6)、肿瘤坏死因子(TNF)、可溶性CD4/CD8(sCD4/sCD8)等，试剂盒为BD公司产品。
表3.灰树花饲料添加剂饲喂犊牛试验(n＝12)
Figure BDA0002462399640000061
a、b分别表示与对照组相比的差异显著性(P<0.05,P<0.01)
从表3可见，灰树花发酵物(50mg/kg)能够显著提升犊牛的生长能力。饲喂20天，已出现组间体重差异，饲料转化率升高；饲喂40天，体重差异显著，日增重差异极显著，提高了24.02％(826.3vs1026.8)，饲料转化率升高显著。
灰树花发酵物的良好功效，可能源自改善了犊牛机体的抗氧化能了和免疫功能。
表3结果显示，灰树花发酵物饲喂以后，第20天，T-AOC和GSH-Px活性显著提升；第40天，T-AOC和GSH-Px活性极显著提升，SOD活性也显著提升。
表3结果显示，50mg/kg的灰树花发酵物饲喂以后，几种免疫球蛋白的含量均有所提升，达显著水平，提示动物粘膜和体液免疫的增强；IL1、IL6和TNF等炎症因子水平下降，而IL4的水平则有所提升。
这一结果貌似和实施实例2中的小鼠试验(600mg/kg、1800mg/kg)结果相左，其实这恰恰说明灰树花发酵物的双向免疫调节作用，在合适的剂量下能够维持机体合适的免疫稳态，不让免疫系统占用过多的物质资源，有利于动物生长。还应该注意到，灰树花发酵物饲喂以后，sCD4/sCD8的比例还是显著升高，表明动物机体内适应性细胞免疫仍处在一种良好的“备战”状态。
实施例5灰树花发酵物饲喂仔猪试验
选取30日龄、体重(7.95±0.87kg)相近的健康杜-长-大三元杂交仔猪150头，公母各半，按大小、性别相近原则随机分成3组(0.1％添加组、0.5％添加组和对照组)，每组50头。
两组试验组仔猪，在基础日粮中分别按0.1％、0.5％的比例添加灰树花发酵物；连续饲喂一个月，试验结果分别见表4。
表4灰树花发酵物饲喂仔猪试验(n＝50)
Figure BDA0002462399640000071
注：a、b分别表示与对照组之间的差异显著性(P<0.05,P<0.01)。
由表4可以看出，试验期(30-69日龄)内所制备的饲料添加剂使肉猪日增重分别提高了18.50％和29.61％，采食量分别提高了6.01％、和7.23％，料肉比分别降低了10.41％和17.1％。由表4结果可看出，本发明所制备的灰树花发酵物作为饲料添加剂可以改善断奶仔猪健康状况，与对照组相比，试验组仔猪的死淘率和腹泻率均明显下降。
实施例6灰树花发酵物饲喂蛋鸡试验
选取180只52周龄的健康海兰蛋鸡，随机分为3组(0.1％添加组、0.5％添加组和对照组)。两组试验组，在基础日粮中分别按0.1％、0.5％的比例添加灰树花发酵物。连续饲喂一个月，试验结果分别见表5。
表5.灰树花饲料添加剂饲喂蛋鸡试验
Figure BDA0002462399640000081
注：a、b分别表示与对照组之间的差异显著性(P<0.05,P<0.01)。
表5的结果表明，灰树花饲料添加剂饲喂后，对平均蛋重、采食量无明显影响；产蛋率提高(0.5％添加组差异显著)，蛋重更均匀；日产蛋重的提升、料蛋比的下降，都达到显著水平，且有剂量效应。

Claims (9)

1.一种真菌类产品的制备方法，其特征在于，包括：选取食用真菌灰树花菌种，依次进行液体发酵和固体发酵，得到含灰树花菌丝体的固体发酵产物；再经后处理，得到真菌类产品。
2.如权利要求1所述的真菌类产品的制备方法，其特征在于，所述真菌类产品的具体制备步骤，包括：
(1)将食用真菌灰树花菌种接种到种子培养液中进行增殖培养，得到种子液；
(2)将步骤(1)所述的种子液转接至发酵培养液中进行液体发酵，得到发酵液；
(3)将步骤(2)所述的发酵液与固体基质混合均匀后，得到混合物，调节混合物的含水量至75～80％后，进行固体发酵，得到含灰树花菌丝体的固体发酵产物；再经烘干、粉碎，得到真菌类产品。
3.如权利要求2所述的真菌类产品的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述种子培养液的配方包括：玉米粉0.8-1.5％，黄豆粉0.8-1.5％，蔗糖1-5％和KH2PO40.1％；所述增殖培养的条件为：20-30℃，100-130转/分钟。
4.如权利要求2所述的真菌类产品的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，以发酵培养液的质量百分数计，所述发酵培养液的组分和用量，包括：玉米粉0.8-1.5％，黄豆粉0.8-1.5％，蔗糖1-5％和KH2PO4 0.1％。
5.如权利要求2所述的真菌类产品的制备方法，其特征在于，所述液体发酵的条件为：温度为25～28℃，每分钟通气量为1:0.4-0.6(v/v)，时间为30-50小时。
6.如权利要求3所述的真菌类产品的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，固体基质以干重计，所述发酵液与固体基质混合时的体积质量比为1L:3-20kg；
以固体基质的质量百分数计，所述固体基质的组分和用量，包括：玉米粉40-70％，豆粕10-40％和麸皮5-20％；
所述固体发酵的条件为：温度为22-28℃，湿度为75～80％，时间为3-7天；
调节混合物的含水量至75～80％，并将所述混合物均匀摊薄至5-10cm的疏松薄层后，再进行固体发酵。
7.一种如权利要求1～6任一项所述的制备方法制得的真菌类产品。
8.如权利要求7任一项所述的真菌类产品在制备饲料添加剂中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述饲料添加剂用于提高围产期奶牛产奶量，和/或犊牛机体的抗氧化能力和免疫功能，和/或断奶仔猪健康状况，和/或蛋鸡的产蛋能力。
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CN108477595A (zh) * 2018-02-27 2018-09-04 山东惠民齐发果蔬有限责任公司 一种菌菇酵素食品添加剂的制备方法及所用装置

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