BR112019008405A2 - Método de cultura contínua de sementes de aspergillus niger e método para produzir ácido cítrico - Google Patents
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Abstract
é revelado um método de cultura contínua de sementes de aspergillus niger, compreendendo as etapas de: (1) em um estágio inicial, esporos de aspergillus niger são inoculados em um meio de cultura de sementes para obter um líquido de sementes; (2) em um estágio de cultura contínua de sementes, um tratamento de dispersão contínua é realizado no líquido de sementes obtido na etapa (1), uma cultura contínua é realizada no líquido de sementes obtido por dispersão e, enquanto isso, um meio de alimentação de sementes fresco é reabastecido; e (3) em um estágio final, o reabastecimento do meio de alimentação de sementes fresco e o tratamento de dispersão são interrompidos, uma cultura contínua é realizada para obter um líquido de sementes e então o líquido de sementes é transferido para o meio de fermentação para cultura de fermentação. o método de acordo com a presente invenção faz uma descoberta para resolver problemas de que as bactérias filamentosas multicelulares crescem lentamente e os grânulos de micélio são fáceis de perder em cultura contínua, atingindo assim, plenamente, a cultura contínua da semente, mantendo o ambiente de crescimento do talo em um estado ideal e evitando a degeneração da cepa, de modo a que o líquido de sementes possa estar em um estado de alta vitalidade contínuo e estável, e o desempenho de produção de ácido cítrico de fermentação correspondente pode ser significativamente melhorado.
Description
“MÉTODO DE CULTURA CONTÍNUA DE SEMENTES DE ASPERGILLUS NIGER E MÉTODO PARA PRODUZIR ÁCIDO CÍTRICO”
Campo Técnico
[001] A presente invenção refere-se ao campo técnico de cultura microbiana e, em particular, a uma cultura contínua de sementes de Aspergillus nigere a um método para produzir ácido cítrico a partir da mesma.
Antecedentes da Invenção
[002] O ácido cítrico é um ácido orgânico com a maior produção e uso no mundo, e é um importante produto químico com aplicações generalizadas. O ácido cítrico é usado principalmente na indústria de alimentos, como agente azedo, antioxidante, gelificante e similares, tem amplas perspectivas de aplicação em campos industriais, como medicina, forragem, indústria química, indústria eletrônica e têxtil, e a demanda do mercado está aumentando ano a ano. Como o maior país produtor e exportador de ácido cítrico, a China possui tecnologia avançada de produção, forte competitividade de mercado e, em particular, está no topo do mundo com seus índices criativos de fermentação submersa profunda de matérias-primas amiláceas, como milho e batata doce seca.
[003] Embora a tecnologia de fermentação biológica tenha se desenvolvido rapidamente e a tecnologia de fermentação inovadora tenha surgido continuamente nos últimos anos, uma pluralidade de modos de cultura contínua de alta eficiência tem sido amplamente aplicada a diferentes produtos de fermentação, no entanto, devido ao fato de que cepa produtora de ácido cítrico, Aspergillus niger, pertence ao fungo filamentoso multinucleado, e possui características de crescimento e morfologia de talo totalmente diferentes de microrganismos unicelulares, como levedura e bactérias, os modos de fermentação maduros de alta eficiência, considerando leveduras e bactérias como as cepas produtoras, não podem ser aplicados à produção de fermentação
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2/20 de ácido cítrico com Aspergillus niger, e assim o desenvolvimento da indústria de fermentação de ácido cítrico considerando fungos filamentosos como cepa produtora foi seriamente restringido.
[004] Atualmente, a produção de fermentação de ácido cítrico ainda segue uma maneira tradicional, isto é, um grande número de esporos de Aspergillus niger é preparado primeiro; os esporos são inoculados em um meio de cultura de sementes para serem cultivados para obter uma solução de semente madura; e depois o líquido de sementes restante é transferido para um meio de fermentação para ser fermentado para obter um líquido de fermentação de ácido cítrico. O modo tradicional de fermentação de ácido cítrico tem os seguintes problemas:
[005] (1) Preparação incômoda, de ciclo longo e de baixa eficiência de esporos de Aspergillus niger. a cepa de Aspergillus niger precisa ser submetida a rejuvenescimento, peneiramento em placa plana e propagação em três estágios, e o período de preparação do mesmo excede 30 dias; a operação manual é incômoda e o risco de contaminação bacteriana é alto.
[006] 2) Baixa estabilidade e consistência da cepa: o grau atual de mecanização da preparação de esporos é baixo, o recipiente de cultura de farelo koji é pequeno, a consistência em diferentes recipientes é pobre e, como resultado, a qualidade da cultura de sementes e o resultado da fermentação são instáveis.
[007] (3) Baixa eficiência de cultura de sementes: leva-se um tempo de germinação de 8 a 12 horas para inocular esporos na cultura de sementes, e assim a eficiência de utilização do tanque de sementes é reduzida.
[008] (4) Cultura intermitente de lotes de sementes instáveis: em cultura em batelada, o ambiente de crescimento do talo (como concentração de açúcar, pH e similares) está mudando constantemente, de modo que o talo não pode crescer em um ambiente ideal por um longo período de tempo.
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3/20
[009] Atualmente, não existe um método de cultura contínua para sementes de bactérias filamentosas na indústria, e a razão é que as bactérias filamentosas são geralmente multicelulares, o crescimento é lento, blocos e esferas são formados, e as células são facilmente perdidas em cultura contínua. A cultura contínua comum concentra-se principalmente nos aspectos de microrganismos, tais como bactérias, leveduras e afins, os quais são células individuais, simples em morfologia e fáceis de controlar. A patente CN 201410329652.X revela um método de cultura contínua de semente de Aspergillus niger de ácido cítrico baseado na tecnologia de dispersão de grânulos de micélio, embora tal método seja referido como cultura “contínua”, a essência do método é uma cultura circulante, e o método é para inocular o lote anterior de micélios dispersos remanescentes em um novo meio de cultura de sementes para cultivar o líquido de sementes, de modo a obter uma cultura circulante de sementes. O método reduz a quantidade de uso de esporos e economiza o tempo de germinação dos esporos; no entanto, as sementes precisam estar em tanques diferentes para trocar a cultura, o sistema do dispositivo é aumentado e a operação é relativamente incômoda. Além disso, cada lote de líquido de sementes é ainda submetido a cultura intermitente em lote, o ambiente de cultura é mudado constantemente, não se pode garantir que as sementes crescerão sob a condição de ambiente ideal; não só é instável entre lotes, e mais importante, a degeneração de cepas ocorre facilmente, e o nível de fermentação será influenciado. Portanto, não há método de cultura contínua de sementes em um sentido verdadeiro na indústria atual.
[010] Em comparação com a cultura intermitente em lote na patente CN 201410329652.X, a cultura contínua de sementes de Aspergillus niger precisa superar as seguintes dificuldades técnicas: (1) os talos crescem lentamente; os grânulos de micélio são fáceis de perder; (2) como reduzir o número de passagens das cepas e evitar a degradação dos talos; (3) como
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4/20 determinar o tempo de retenção adequado do líquido de sementes, evitar que os talos percam demasiado rápido e, enquanto isso, garantir que a quantidade de talos na semente transferindo o líquido de sementes é suficiente e o ambiente de cultura é estável; (4) como determinar o tamanho apropriado dos micélios, de modo que a taxa de crescimento e a taxa de diluição dos talos possam alcançar um equilíbrio.
[011] Portanto, é um problema que precisa ser resolvido com urgência na produção de ácido cítrico atual como romper a limitação de bactérias filamentosas multicelulares, melhorar o processo de preparação de líquido de sementes, reduzir a quantidade de uso de esporos e, enquanto isso, melhorar a eficiência de cultura de semente, manter o ambiente de crescimento de sementes em um estado ideal, responder e ajustar o ambiente de cultura em tempo real de acordo com o estado de crescimento do talo, evitar a degradação de cepa, garantir a qualidade do líquido de sementes para ser estável e melhorar o nível de fermentação.
Descrição Resumida
[012] Em vista dos problemas acima existentes no estado da técnica, o depositante da presente invenção fornece uma cultura contínua de sementes de Aspergillus niger e um método para a produção de ácido cítrico a partir da mesma. O método de acordo com a presente invenção faz uma descoberta para resolver problemas de que as bactérias filamentosas multicelulares crescem lentamente e os grânulos de micélio são fáceis de perder em cultura contínua, atingindo assim, plenamente, a cultura contínua de sementes, mantendo o ambiente de crescimento do talo em um estado ideal e evitando a degeneração de cepas, de modo que o líquido de sementes possa estar em um estado de alta vitalidade contínuo e estável, e os índices de fermentação correspondentes podem ser significativamente melhorados.
[013] As soluções técnicas da presente invenção são descritas a
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5/20 seguir:
[014] É fornecido um método de cultura contínua de semente de Aspergillus niger, compreendendo as etapas de:
(1) em um estágio inicial, inocular esporos de Aspergillus niger em um meio de cultura de sementes, e cultivar durante 16 a 36 horas para obter um líquido de sementes;
(2) em um estágio de cultura contínua de sementes, realizar um tratamento de dispersão contínua no líquido de sementes obtido na etapa (1), realizar uma cultura contínua no líquido de sementes obtido por dispersão, realizar uma cultura de fermentação após o líquido de sementes fluir continuamente para um meio de fermentação no processo de cultura e, enquanto isso, reabastecer um meio de alimentação de sementes fresco à mesma velocidade com o líquido de sementes de saída;
(3) em um estágio final, interromper o reabastecimento do meio de alimentação de sementes fresco e o tratamento de dispersão, realizar a cultura contínua para obter um líquido de sementes, e então transferir o líquido de sementes para o meio de fermentação para cultura de fermentação.
[015] A concentração final dos esporos de Aspergillus niger na etapa (1) após a incubação é de 1 a 9 χ 105 esporos/ mL; o açúcar total do meio de cultura de sementes na etapa (1) é de 100 a 180 g/L, o C/ N é de 20 a 40; as condições de cultura de semente na etapa (1) são as seguintes: a temperatura é de 35 a 39 °C, o volume de ar é de 0,2 a 0,4 vvm, a pressão do tanque é de 0,05 a 0,1 MPa e a velocidade de agitação é de 100 a 200 rpm.
[016] O açúcar total do meio de alimentação de sementes fresco reabastecido na etapa (2) é de 150 a 200 g/ L, C/ N é 15 a 30; as condições de cultura contínua na etapa (2) são as seguintes: a temperatura é de 35 a 37 °C, o volume de ar é de 0,3 a 0,6 vvm, a pressão do tanque é de 0,05 a 0,07 MPa e a velocidade de agitação é de 150 a 200 rpm.
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6/20
[017] As condições de cultura contínua na etapa (3) são as seguintes: a temperatura é de 35 a 39 °C, o volume de ar é de 0,3 a 0,6 vvm, a pressão do tanque é de 0,05 a 0,1 MPa e a velocidade de agitação é de 150 a 200 rpm.
[018] O método de tratamento de dispersão contínua do líquido de sementes na etapa (2) é para dispersar grânulos de micélio no líquido de sementes em 10 a 80 pm de hifas flocosas adotando um dispersor.
[019] A taxa de reabastecimento do meio de alimentação de sementes fresco e a taxa de saída do líquido de sementes na etapa (2) são F = V/t, em que V é o volume do líquido de sementes em um tanque de sementes e é determinado por diferentes tanques; t é o tempo de retenção do líquido de sementes e é ajustado de acordo com a resposta da concentração celular das hifas flocosas, é geralmente tomado um valor de 6 a 24 h.
[020] A proporção de inoculação de fermentação na etapa (2) e na etapa (3) é de 5 a 25% (v/ v).
[021] O açúcar total do meio de fermentação na etapa (2) e na etapa (3) é 160 a 200 g/L, C/ N é 50 a 90; as condições de cultura de fermentação na etapa (2) e na etapa (3) são as seguintes: a temperatura é de 35 a 39 °C, o volume de ar é de 0,1 a 0,4 vvm, a pressão do tanque é de 0,05 a 0,1 MPa, a velocidade de agitação é de 100 a 200 rpm, e a fermentação termina quando a concentração de um açúcar redutor é inferior a 5 g/L.
[022] O meio de cultura de sementes, o meio de alimentação de sementes fresco e o meio de fermentação são formulados com um líquido de liquefação de matéria-prima amilácea e uma fonte de nitrogênio, respectivamente; em que as matérias-primas amiláceas compreendem pelo menos uma farinha de milho, farinha de mandioca, farinha de sorgo e amido de trigo; a fonte de nitrogênio compreende pelo menos um dentre sulfato de amônio, ureia, farinha de soja em pó e licor de infusão de milho.
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7/20
[023] É proporcionado um método para a produção de ácido cítrico, compreendendo a etapa de: fermentar o Aspergillus niger obtido pelo método de cultura contínua de sementes para produzir ácido cítrico.
[024] A presente invenção atinge os seguintes efeitos benéficos:
[025] O método de acordo com a presente invenção alcança plenamente a cultura contínua de sementes de bactérias filamentosas. Comparado com a patente CN 201410329652.X, o método simplifica bastante o sistema do dispositivo e reduz a quantidade de uso do tanque de sementes para 1/3; o método também reduz etapas de operação, melhora significativamente a eficiência de produção, economiza o tempo auxiliar de cultura de semente correspondente a cada lote de tanque de fermentação por 12h; e melhora o nível automático de cultura de sementes.
[026] Comparado com a patente CN 201410329652.X, o método de cultura contínua de sementes de acordo com a presente invenção reduz os números de passagem das cepas, evita eficazmente a degeneração da cepa e mantém a operação contínua durante 15 dias enquanto mantém a vitalidade da semente sem diminuir e mantém a índices de fermentação estáveis. Por meio de um funcionamento contínuo eficiente, o tempo auxiliar de início-fim pode ser reduzido, a quantidade de uso dos esporos de Aspergillus niger pode ser reduzida em 1/3, e o custo de cultura dos esporos de Aspergillus niger pode ser bastante reduzido.
[027] O método de acordo com a presente invenção tem vantagens proeminentes de que o talo é mantido em um ambiente de crescimento ideal, de modo que as sementes estejam sempre em um estado maduro de alta vitalidade contínuo e estável, e a estabilidade e consistência da qualidade do líquido de sementes podem ser garantidas. No entanto, a cultura intermitente em lote é adotada na patente CN 201410329652.X, o pH no tanque é diminuído continuamente e substâncias nutrientes são gradualmente
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8/20 consumidas, e as condições de cultura são gradualmente desfavoráveis para o crescimento do talo e retenção de vitalidade, e assim, a qualidade do líquido de semente é afetada, as diferenças na qualidade do líquido de semente entre lotes são relativamente grandes; um defeito maior é que, o líquido de sementes transferido para o meio de fermentação é o micélio disperso após o tratamento do dispersor, que precisa restaurar o crescimento no estágio inicial do tanque de fermentação, de modo a influenciar os índices de fermentação. Em comparação com a patente CN 201410329652.X, quando a concentração de açúcar inicial da fermentação é de 16%, a intensidade de fermentação é aumentada em 27,5%, a taxa de conversão da fermentação é aumentada em 3,4% e a estabilidade da fermentação é significativamente melhorada.
[028] Além disso, devido ao fato de que a vitalidade da semente é melhorada e a taxa de produção de ácido é aumentada, em comparação com a patente CN 201410329652.X, o método de acordo com a presente invenção tem maiores vantagens sob condições de fermentação de alta concentração, quando a concentração de açúcar inicial de fermentação é aumentada para 18%, a produção de ácido de fermentação excede 18%, o período de fermentação é inferior a 60h, a taxa de conversão de fermentação excede 100%, a intensidade de fermentação é aumentada em 31,6%, e a taxa de conversão de fermentação é aumentada em 4,8%. Portanto, o método de acordo com a presente invenção pode atingir plenamente a alta concentração, alta taxa de conversão e alta eficiência na produção de fermentação de ácido cítrico, e desempenhar um importante papel de promoção na melhoria técnica na indústria de ácido cítrico.
[029] O método para cultura contínua de sementes de Aspergillus niger é realizado pela primeira vez através da adoção de dispersão contínua acoplada a alimentação contínua, o tempo de retenção ideal e o tamanho do micélio são determinados, os parâmetros de cultura da cultura de sementes em diferentes estágios são otimizados, os problemas de que as bactérias
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9/20 filamentosas multicelulares crescem lentamente e os grânulos de micélio são fáceis de perder em cultura contínua são resolvidos, a cultura contínua de sementes é totalmente alcançada, o talo é feito para manter um ambiente de crescimento ideal, a degeneração de cepas é evitada, o líquido de sementes é mantido em um estado de alta atividade contínuo e estável, e os índices de fermentação correspondentes são significativamente melhorados.
Breve Descrição das Figuras
[030] A Figura 1 é um diagrama esquemático do método de cultura de acordo com CN 201410329652.X.
[031 ] A Figura 2 é um diagrama esquemático do método de cultura de acordo com a presente invenção.
Descrição Detalhada
[032] A presente invenção será especificamente descrita com referência às figuras anexas e exemplos.
[033] Todas as matérias primas e os reagentes envolvidos nos seguintes exemplos e exemplos comparativos estão comercialmente disponíveis; Aspergillus niger é do Centro de Coleta de Cultura Microbiológica Industrial da China com o ns de acesso CICC 40021. O açúcar total e o açúcar redutor são determinados com o método de titulação de Fehling, a fonte de nitrogênio é determinada pela determinação de Kjeldahl, o teste de ácido cítrico adota titulação de NaOH 0,1429 mol/L, e a contagem de esporos adota a câmara de contagem de glóbulos sanguíneos. A menos que especialmente indicado, são utilizados dispositivos e métodos de processo normalmente utilizados na técnica.
Exemplo 1
[034] A farinha de milho e a água de torneira foram uniformemente misturadas de acordo com a razão em massa de 1: 3, o pH da pasta fluida foi ajustado para 6,0 com Ca(OH)2, e a a-amilase termoestável foi adicionada em uma quantidade adicional de 20 U7g de farinha de milho; a liquefação por ejeção
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10/20 foi realizada e o líquido liquefeito de milho qualificado foi obtido após o teste de iodo ser castanho claro; 80% do líquido liquefeito de milho foi filtrado através de uma estrutura de placa para remover resíduos de filtro para obter xarope de milho.
[035] Estágio inicial: líquido liquefeito de milho e sulfato de amônio foram formulados em um meio de cultura de sementes (o açúcar total foi de 100 g/L, C/N foi de 20), esporos de Aspergillus niger foram inoculados no meio de cultura de sementes após esterilização e arrefecimento, e a concentração final dos esporos foi de 9 x 105 esporos/ mL e cultivados durante 16 horas a uma temperatura de 35 °C, um volume de ar de 0,2 vvm, uma pressão do tanque de 0,05 MPa e uma velocidade de agitação de 100 rpm para obter um líquido de sementes.
[036] Fase contínua: líquido liquefeito de milho e sulfato de amônio foram formulados em um meio de cultura de alimentação de sementes (o açúcar total foi de 150 g/L, C/ N foi de 15). O líquido de sementes obtido foi submetido a tratamento de dispersão contínua para dispersar grânulos de micélio em 10 pm de hifas flocosas, adotando um dispersor; e enquanto isso, a velocidade de reabastecimento contínuo do meio de alimentação de sementes fresco foi controlada com um tempo de retenção de 6 horas, e o líquido de sementes fluiu continuamente na mesma velocidade para um meio de fermentação para cultura de fermentação. No estágio de cultura contínua de semente, a temperatura da cultura foi de 35 °C, o volume de ar foi de 0,3 vvm, a pressão do tanque foi de 0,05 MPa e a velocidade de agitação foi de 150 rpm.
[037] Estágio final, ao detectar que a vitalidade da semente tende a diminuir, o reabastecimento do meio de alimentação de sementes fresco e o tratamento de dispersão foram interrompidos, e então o líquido de sementes restante foi transferido para o meio de fermentação para cultura de fermentação. As condições de cultura de semente neste estágio: a temperatura foi de 35 °C,
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11/20 o volume de ar foi de 0,3 vvm, a pressão do tanque foi de 0,05 MPa e a velocidade de agitação foi de 150 rpm.
[038] O meio de fermentação foi formulado com líquido liquefeito de milho, xarope de milho e sulfato de amônio (o açúcar total era de 160 g/L, C/ N era de 50); a proporção de inoculação de fermentação foi de 25% (v/v); as condições da cultura de fermentação foram as seguintes: a temperatura foi de 35 °C, o volume de ar foi de 0,1 vvm, a pressão do tanque foi de 0,05 MPa, a velocidade de agitação foi de 100 rpm e a fermentação terminou quando a concentração de um açúcar redutor foi inferior a 5 g/ L, a acidez e o açúcar residual correspondentes a cada lote de fermentação foram determinados, e os índices, tais como taxa de conversão e intensidade de fermentação, foram calculados.
Exemplo 2
[039] A farinha de milho e a água de torneira foram uniformemente misturadas de acordo com a razão em massa de 1: 3, o pH da pasta fluido foi ajustado para 6,0 com Ca(OH)2, e a a-amilase termoestável foi adicionada em uma quantidade adicional de 20 U/g de farinha de milho; a liquefação por ejeção foi realizada e o líquido liquefeito de milho qualificado foi obtido após o teste de iodo ser castanho claro; 80% do líquido liquefeito de milho foi filtrado através de uma estrutura de placa para remover resíduos de filtro para obter xarope de milho. A farinha de mandioca e a água de torneira foram uniformemente misturadas de acordo com a razão em massa de 1: 3, o pH da pasta fluida foi ajustado para 6,0 com Ca(OH)2, e a-amilase termoestável foi adicionada em uma quantidade adicional de 20 U/g de farinha de mandioca; foi realizada liquefação por ejecção e foi obtido xarope de mandioca qualificado após o teste de iodo ser castanho claro.
[040] Estágio inicial: líquido liquefeito de milho e ureia foram formulados em um meio de cultura de sementes (o açúcar total foi de 140 g/ L,
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C/N foi de 30), esporos de Aspergillus n/gerforam inoculados no meio de cultura de sementes após esterilização e arrefecimento, e a concentração final dos esporos foi de 4,5 x 105 esporos/ mL, e cultivados por 26 horas a uma temperatura de 37 °C, um volume de ar de 0,3 vvm, uma pressão do tanque de 0,075 MPa e uma velocidade de agitação de 150 rpm para obter um líquido de sementes.
[041] Fase contínua: líquido liquefeito de milho e ureia foram formulados em um meio de cultura de alimentação de sementes (o açúcar total foi de 175 g/L, C/ N foi de 23). O líquido de sementes obtido foi submetido a tratamento de dispersão contínua para dispersar grânulos de micélio em 45 pm de hifas flocosas, adotando um dispersor; e enquanto isso, a velocidade de reabastecimento contínuo do meio de alimentação de sementes fresco foi controlada com um tempo de retenção de 15 horas, e o líquido de sementes fluiu continuamente na mesma velocidade para um meio de fermentação para cultura de fermentação. No estágio de cultura contínua de semente, a temperatura da cultura foi de 36 °C, o volume de ar foi de 0,45 vvm, a pressão do tanque foi de 0,06 MPa e a velocidade de agitação foi de 175 rpm.
[042] Estágio final, ao detectar que a vitalidade da semente tende a diminuir, o reabastecimento do meio de alimentação de sementes fresco e o tratamento de dispersão foram interrompidos, e então o líquido de sementes restante foi transferido para o meio de fermentação para cultura de fermentação. As condições de cultura de semente neste estágio: a temperatura foi de 37 °C, o volume de ar foi de 0,45 vvm, a pressão do tanque foi de 0,075 MPa e a velocidade de agitação foi de 175 rpm.
[043] O meio de fermentação foi formulado com líquido liquefeito de milho, xarope de milho, xarope de mandioca e ureia (o açúcar total era de 180 g/L, C/ N era de 70); a proporção de inoculação de fermentação foi de 15% (v/v); as condições da cultura de fermentação foram as seguintes: a temperatura foi
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13/20 de 37 °C, o volume de ar foi de 0,25 vvm, a pressão do tanque foi de 0,075 MPa, a velocidade de agitação foi de 150 rpm e a fermentação terminou quando a concentração de um açúcar redutor foi inferior a 5 g/ L, a acidez e o açúcar residual correspondentes a cada lote de fermentação foram determinados, e os índices, tais como taxa de conversão e intensidade de fermentação, foram calculados.
Exemplo 3
[044] A farinha de milho e a água de torneira foram uniformemente misturadas de acordo com a razão em massa de 1: 3, o pH da pasta fluida foi ajustado para 6,0 com Ca(OH)2, e a a-amilase termoestável foi adicionada em uma quantidade adicional de 20 U/g de farinha de milho; a liquefação por ejeção foi realizada e o líquido liquefeito de milho qualificado foi obtido após o teste de iodo ser castanho claro; 80% do líquido liquefeito de milho foi filtrado através de uma estrutura de placa para remover resíduos de filtro para obter xarope de milho. O amido de trigo e a água de torneira foram uniformemente misturados de acordo com a razão em massa de 1: 3, o pH da pasta fluida foi ajustado para 6,0 com Ca(OH)2 e a-amilase termoestável foi adicionada em uma quantidade adicional de 20 U/g de amido de trigo; foi realizada liquefação por ejecção, e um xarope de trigo qualificado foi obtido após o teste de iodo ser castanho claro.
[045] Estágio inicial: líquido liquefeito de milho e farinha de soja em pó foram formulados em meio de cultura de sementes (o açúcar total foi de 180 g/ L, C/N foi de 40), esporos de Aspergillus niger foram inoculados no meio de cultura de sementes após esterilização e arrefecimento e a concentração final dos esporos foi de 1 x 105 esporos/ mL, e cultivados por 36 horas a uma temperatura de 39 °C, um volume de ar de 0,4vvm, uma pressão do tanque de 0,1 MPa, e uma velocidade de agitação de 200 rpm para obter um líquido de sementes.
[046] Fase contínua: líquido liquefeito de milho e farinha de soja
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14/20 em pó foram formulados em um meio de cultura de alimentação de sementes (o açúcar total foi de 200 g/ L, C/ N foi de 30). O líquido de sementes obtido foi submetido a tratamento de dispersão contínua para dispersar os grânulos de micélio em 80 pm de hifas flocosas, adotando um dispersor; e, enquanto isso, a velocidade de reabastecimento contínuo do meio de alimentação de sementes fresco foi controlada com um tempo de retenção de 24 horas e o líquido de sementes fluiu continuamente na mesma velocidade para um meio de fermentação para cultura de fermentação. No estágio de cultura contínua da semente, a temperatura da cultura foi de 37 °C, o volume de ar foi de 0,6 vvm, a pressão do tanque foi de 0,07 MPa e a velocidade de agitação foi de 200 rpm.
[047] Estágio final, ao detectar que a vitalidade da semente tende a diminuir, o reabastecimento do meio de alimentação de sementes fresco e o tratamento de dispersão foram interrompidos, e então o líquido de sementes restante foi transferido para o meio de fermentação para cultura de fermentação. As condições de cultura de semente neste estágio: a temperatura foi de 39 °C, o volume de ar foi de 0,6 vvm, a pressão do tanque foi de 0,1 MPa e a velocidade de agitação foi de 200 rpm.
[048] O meio de fermentação foi formulado com líquido liquefeito de milho, xarope de milho, xarope de trigo e farinha de soja em pó (o açúcar total foi de 200 g/ L, C/ N foi de 90); a proporção de inoculação de fermentação foi de 5% (v/v); as condições da cultura de fermentação foram as seguintes: a temperatura foi de 39 °C, o volume de ar foi de 0,4 vvm, a pressão do tanque foi de 0,1 MPa, a velocidade de agitação foi de 200 rpm e a fermentação terminou quando a concentração de um açúcar redutor foi inferior a 5 g/ L, a acidez e o açúcar residual correspondentes a cada lote de fermentação foram determinados, e os índices, tais como taxa de conversão e intensidade de fermentação, foram calculados.
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Exemplo Comparativo 1 (Exemplo 1 em CN 201410329652.X)
[049] A glicose e a farinha de soja em pó foram formuladas em meio de cultura de sementes (o açúcar total foi de 80 g/ L, o nitrogênio total foi de 1,5 g/L) e o meio de fermentação (o açúcar total foi de 160 g/L, o nitrogênio total foi de 1,5 g/L), respectivamente; após a transplantação das sementes, a concentração de esporos foi de 550.000 esporos/ mL de inoculação; cultivadas por 20 horas para obter uma solução madura de sementes, as hifas líquidas de semente foram tratadas por um dispersor, os grânulos de micélio após o tratamento tiveram um diâmetro médio de 100 pm e inoculados no estágio seguinte do meio de cultura de sementes e a cultura de fermentação; onde o estágio seguinte era uma cultura de fermentação, a fermentação terminou quando a concentração do açúcar redutor na cultura de fermentação foi reduzida para ser inferior a 5 g/L. Tais ciclos foram repetidos até que a viabilidade das sementes decresceu significativamente. A acidez e o açúcar residual correspondentes a cada lote de fermentação foram determinados, e os índices, tais como taxa de conversão e intensidade de fermentação, foram calculados.
Exemplo Comparativo 2
[050] O meio de fermentação tinha um açúcar total de 180 g/ L e um nitrogênio total de 1,5 g/ L; outras condições foram as mesmas que no Exemplo 1.
Exemplo Comparativo 3
[051] A preparação de líquido de liquefação de farinha de milho e xarope de milho foi a mesma do Exemplo 1. Líquido liquefeito de milho e sulfato de amônio foram formulados em um meio de cultura de sementes (o açúcar total foi de 120 g/L, o nitrogênio total foi de 2 g/ L) e um meio de fermentação (o açúcar total foi de 160 g/ L, o nitrogênio total foi de 1,0 g/ L). Esporos de Aspergillus n/gerforam inoculados no meio de cultura de sementes, a concentração final dos
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16/20 esporos foi de 4 x 105 esporos/ mL e cultivados durante 20 horas para obter um líquido de sementes maduro primário. 70% do líquido de sementes maduro foi transferido para o primeiro lote de meio de fermentação para cultura e a fermentação terminou quando a concentração do açúcar redutor era inferior a 5 g/L. Os 30% restantes do líquido de sementes foram tratados por um dispersor, os grânulos de micélio obtidos ou blocos de fungos com diâmetro médio de 62 pm foram transferidos para o meio de cultura de sementes e cultivados por 16 horas para recuperar um líquido de sementes maduro secundário. Tais ciclos foram repetidos até que a viabilidade das sementes decresceu significativamente. A acidez e o açúcar residual correspondentes a cada lote de fermentação foram determinados, e os índices, tais como taxa de conversão e intensidade de fermentação, foram calculados.
Exemplo Comparativo 4
[052] A preparação de líquido de liquefação de farinha de milho e xarope de milho foi a mesma do Exemplo 1. Líquido liquefeito de milho e sulfato de amônio foram formulados em um meio de cultura de sementes (o açúcar total foi de 120 g/ L, o nitrogênio total foi de 2 g/ L) e um meio de fermentação (o açúcar total foi de 160 g/ L, o nitrogênio total foi de 1,0 g/ L). Esporos de Aspergillus niger foram inoculados no meio de cultura de sementes, a concentração final dos esporos foi de 4 x 105 esporos/ mL e cultivados durante 20 horas para obter um líquido de sementes maduro primário. 70% do líquido de sementes maduro foi transferido para o primeiro lote de meio de fermentação para cultura e a fermentação terminou quando a concentração do açúcar redutor era inferior a 5 g/L. Os 30% restantes do líquido de sementes foram tratados por um dispersor para obter grânulos de micélio ou blocos de fungos com um diâmetro médio de 50 pm, o meio de alimentação de sementes fresco foi reabastecido no óleo de semente restante e cultivado por 16 horas para recuperar um líquido de semente maduro secundário. Tais ciclos foram repetidos
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17/20 até que a viabilidade das sementes decresceu significativamente. A acidez e o açúcar residual correspondentes a cada lote de fermentação foram determinados, e os índices, tais como taxa de conversão e intensidade de fermentação, foram calculados.
Exemplo Comparativo 5
[053] A velocidade de reabastecimento contínuo do meio de alimentação de sementes fresco no estádio de cultura contínua de semente foi controlada com um tempo de retenção de 4 horas; outras condições foram as mesmas que no Exemplo 1.
Exemplo Comparativo 6
[054] O C/N do meio de cultura de alimentação de sementes no estágio de cultura contínua de semente foi de 40; outras condições foram as mesmas que no Exemplo 1.
Exemplo de Testei
[055] Os efeitos técnicos do Exemplo 1 e dos Exemplos
Comparativos 1,3 e 4 são comparados, como mostrado na Tabela 1.
Tabela 1
| Exemplo 1 | Exemplo comparativo 1 | Exemplo comparativo 3 | Exemplo comparativo 4 | |
| Tempo de operação contínua da semente (h) | 288 | 260 | 260 | 260 |
| Número de tanques de sementes | 1 | 3 | 3 | 1 |
| Cada lote de tempo auxiliar do tanque de sementes (h) | 0 | 12 | 9 | 1 |
| Quantidade de uso de farelo koji (barril/ tanque de fermentação) | 0,22 | 0,33 | 0,33 | 0,33 |
| Número de tanques de fermentação correspondentes | 18 | 12 | 12 | 12 |
| Média de açúcar total inicial de fermentação correspondente (g/L) | 160 | 160 | 160 | 160 |
| Média de produção de ácido de fermentação correspondente (g/L) | 162,5 | 157,0 | 159,0 | 158,5 |
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| Exemplo 1 | Exemplo comparativo 1 | Exemplo comparativo 3 | Exemplo comparativo 4 | |
| Média de período de fermentação correspondente (h) | 52,5 | 64,7 | 57,2 | 56,6 |
| Média de taxa de conversão de fermentação correspondente (%) | 101,6 | 98,1 | 99,4 | 99,1 |
| Média de intensidade de fermentação correspondente (g/(h-L)) | 3,10 | 2,43 | 2,78 | 2,80 |
[056] Uma comparação dos efeitos técnicos do Exemplo 1 e dos Exemplos comparativos 1,3 e 4 mostra que: (1) em comparação com a patente CN 201410329652.X, o método de acordo com a presente invenção simplifica o sistema do dispositivo e reduz a quantidade de uso do tanque de sementes para 1/3; o método também reduz as etapas de operação, melhora significativamente a eficiência de produção e economiza o tempo auxiliar de cultura de sementes correspondente a cada lote de tanque de fermentação por 12 horas. (2) O método de acordo com a presente invenção tem um tempo de operação contínua mais longo, o tempo auxiliar de iníciofim pode ser encurtado, a quantidade de uso dos esporos de Aspergillus niger pode ser reduzida em 1/3 e o custo de cultura dos esporos de Aspergillus niger pode ser bastante reduzido. (3) Comparada com a patente CN 201410329652.X, quando a concentração de açúcar inicial de fermentação é de 16%, a intensidade da fermentação é aumentada em 27,5% e a taxa de conversão da fermentação é aumentada em 3,4%.
Exemplo de Teste 2
[057] Os efeitos técnicos do Exemplo 2 e do Exemplo Comparativo são comparados, como mostrado na Tabela 2.
Tabela 2
| Exemplo 2 | Exemplo Comparativo 2 | |
| Tempo de operação contínua da semente (h) | 360 | 260 |
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| Exemplo 2 | Exemplo Comparativo 2 | |
| Número de tanques de sementes | 1 | 3 |
| Tempo auxiliar de tanque de semente simples (h) | 34 | 480 |
| Quantidade de uso de farelo koji (barril/ tanque de fermentação) | 0,16 | 0,33 |
| Número de tanques de fermentação correspondentes | 25 | 12 |
| Média de açúcar total inicial de fermentação correspondente (g/L) | 180 | 180 |
| Média de produção de ácido de fermentação correspondente (g/L) | 181,2 | 172,6 |
| Média de período de fermentação correspondente (h) | 59,4 | 78,2 |
| Média de taxa de conversão de fermentação correspondente (%) | 100,7 | 95,9 |
| Média de intensidade de fermentação correspondente (g/(h-L)) | 3,03 | 2,30 |
[058] Uma comparação dos efeitos técnicos do Exemplo 2 e
Exemplo Comparativo 2 mostra que: em comparação com a patente CN 201410329652.X, o método de acordo com a presente invenção tem maiores vantagens sob condições de fermentação de alta concentração, quando a concentração de açúcar inicial de fermentação é aumentada para 18%, a produção de ácido de fermentação excede 18%, o período de fermentação é inferior a 60 horas, a taxa de conversão de fermentação excede 100%, a intensidade de fermentação é aumentada em 31,6% e a taxa de conversão de fermentação é aumentada em 4,8%. Portanto, o método de acordo com a presente invenção pode atingir plenamente a alta concentração, alta taxa de conversão e alta eficiência na produção de fermentação de ácido cítrico, e desempenha um importante papel de promoção na melhoria técnica na indústria de ácido cítrico.
[059] Exemplo de teste 3: são comparados os desempenhos do Exemplo 1 da presente invenção e os Exemplos Comparativos 5 e 6, como mostrado na Tabela 3.
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Tabela 3
| Exemplo 1 | Exemplo comparativo 5 | Exemplo comparativo 6 | |
| Tempo de operação contínua da semente (h) | 288 | 136 | 152 |
| Número de tanques de sementes | 1 | 1 | 1 |
| Tempo auxiliar de tanque de semente simples (h) | 24 | 24 | 24 |
| Quantidade de uso de farelo koji (barril/ tanque de fermentação) | 0,22 | 0,50 | 0,44 |
| Número de tanques de fermentação correspondentes | 18 | 8 | 9 |
| Média de açúcar total inicial de fermentação correspondente (g/L) | 160 | 160 | 160 |
| Média de produção de ácido de fermentação correspondente (g/L) | 162,5 | 158,7 | 157,3 |
| Média de período de fermentação correspondente (h) | 52,5 | 55,9 | 58,1 |
| Média de taxa de conversão de fermentação correspondente (%) | 101,6 | 99,2 | 98,3 |
| Média de intensidade de fermentação correspondente (g/(h-L)) | 3,10 | 2,84 | 2,71 |
[060] Uma comparação dos desempenhos do Exemplo 1 da presente invenção e dos Exemplos Comparativos 5 e 6 mostra que, quando parâmetros tais como o tempo de retenção e C/N do meio de cultura de alimentação no estágio de cultura contínua de semente são alterados, o tempo de operação contínua da semente será significativamente afetado, o tempo de operação será reduzido, a vitalidade da semente será rapidamente reduzida e os índices correspondentes à taxa de conversão da fermentação e à intensidade de fermentação também serão significativamente reduzidos.
[061 ] As formas de realização descritas acima são apenas formas de realização preferidas da presente invenção e não limitam a presente invenção. Pode ser entendido que qualquer melhoria e variação diretamente derivada ou concebida por técnicos no assunto sem se afastar do sentido e conceito da presente invenção, deve ser considerada dentro do escopo de proteção da presente invenção.
Claims (10)
- (1) em um estágio inicial, inocular esporos de Aspergillus nigerem um meio de cultura de sementes e cultivar durante 16 a 36 horas para obter um líquido de sementes;1. MÉTODO DE CULTURA CONTÍNUA DE SEMENTES DE ASPERGILLUS NIGER, caracterizado por compreender as etapas de:
- 2/3 ar ser de 0,3 a 0,6 vvm, a pressão do tanque ser de 0,05 a 0,07 MPa e a velocidade de agitação ser de 150 a 200 rpm.2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela concentração final dos esporos de Aspergillus niger na etapa (1) após a incubação ser de 1 a 9 χ 105 esporos/mL; o açúcar total do meio de cultura de sementes na etapa (1) ser de 100 a 180 g/L, o C/N ser de 20 a 40; as condições de cultura de semente na etapa (1) serem as seguintes: a temperatura ser de 35 a 39 °C, o volume de ar ser de 0,2 a 0,4 vvm, a pressão do tanque ser de 0,05 a 0,1 MPa e a velocidade de agitação ser de 100 a 200 rpm.(2) em um estágio de cultura contínua de sementes, realizar um tratamento de dispersão contínua no líquido de sementes obtido na etapa (1), realizar uma cultura contínua no líquido de sementes obtido por dispersão, realizar uma cultura de fermentação após o líquido de sementes fluir continuamente para um meio de fermentação no processo de cultura e, enquanto isso, reabastecer um meio de alimentação de sementes fresco à mesma velocidade de saída do líquido de sementes; e (3) em um estágio final, interromper o reabastecimento do meio de alimentação de sementes fresco e o tratamento de dispersão, realizar a cultura contínua para obter um líquido de sementes, e então transferir o líquido de sementes para o meio de fermentação para cultura de fermentação.
- 3/33. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo açúcar total do meio de alimentação de sementes fresco reabastecido na etapa (2) ser de 150 a 200 g/L, C/N ser 15 a 30; as condições de cultura contínua na etapa (2) serem as seguintes: a temperatura ser de 35 a 37 °C, o volume dePetição 870200041594, de 31/03/2020, pág. 29/32
- 4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelas condições de cultura contínua na etapa (3) serem as seguintes: a temperatura ser de 35 a 39 °C, o volume de ar ser de 0,3 a 0,6 vvm, a pressão do tanque ser de 0,05 a 0,1 MPa e a velocidade de agitação ser de 150 a 200 rpm.
- 5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo método de tratamento de dispersão contínua do líquido de sementes na etapa (2) ser para dispersar grânulos de micélio no líquido de sementes em 10 a 80 pm de hifas flocosas adotando um dispersor.
- 6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela taxa de reabastecimento do meio de alimentação de sementes fresco e a taxa de saída do líquido de sementes na etapa (2) serem F = V/t, em que V é o volume do líquido de sementes em um tanque de sementes e é determinado por diferentes tanques; t é o tempo de retenção do líquido de sementes e é ajustado de acordo com a resposta da concentração celular das hifas flocosas, é geralmente tomado um valor de 6 a 24 h.
- 7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela proporção da inoculação de fermentação na etapa (2) e na etapa (3) serem de 5 a 25% (v/ v).
- 8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo açúcar total do meio de fermentação na etapa (2) e na etapa (3) ser de 160 a 200 g/L, C/N é 50 a 90; as condições de cultura de fermentação na etapa (2) e na etapa (3) serem as seguintes: a temperatura ser de 35 a 39 °C, o volume de ar ser de 0,1 a 0,4 vvm, a pressão do tanque ser de 0,05 a 0,1 MPa, a velocidade de agitação ser de 100 a 200 rpm, e a fermentação termina quando a concentração de um açúcar redutor é inferior a 5 g/L.Petição 870200041594, de 31/03/2020, pág. 30/32
- 9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo meio de cultura de sementes, o meio de alimentação de sementes frescas e o meio de fermentação serem formulados com um líquido de liquefação de matéria-prima amilácea e uma fonte de nitrogênio, respectivamente; em que as matérias-primas amiláceas compreendem pelo menos uma farinha de milho, farinha de mandioca, farinha de sorgo e amido de trigo; a fonte de nitrogênio compreende pelo menos um dentre sulfato de amônio, ureia, farinha de soja em pó e licor de infusão de milho.
- 10. MÉTODO PARA PRODUZIR ÁCIDO CÍTRICO, caracterizado por compreender a etapa de: fermentar o Aspergillus niger obtido pelo método de cultura contínua de sementes, conforme definido na reivindicação 1, para produzir ácido cítrico.
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