CN103497977A - 一种发酵制备柠檬酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种发酵制备柠檬酸的方法，该方法包括，在能够生成柠檬酸的条件下，将黑曲霉接种到发酵培养基中进行发酵，其中，当发酵培养基中黑曲霉的含量达到1-1.7重量%时开始向发酵培养基中添加抑制剂，所述抑制剂的添加量使得黑曲霉的含量能够增加，但增加量不超过0.2重量%/小时。通过采用本发明的技术方案进行柠檬酸发酵，有效的抑制了发酵菌种的过快生长，并使发酵菌体和营养物质都向更有利于产柠檬酸的趋势发展，从而提高了发酵水平。同时，发酵菌种的菌球小而紧密，菌丝较短，使得在保证发酵所需的溶氧量的前提下有效地降低了搅拌功率，从而易于操作并降低了生产成本。

Description

一种发酵制备柠檬酸的方法

技术领域

本发明涉及一种发酵制备柠檬酸的方法。

背景技术

柠檬酸是目前可以用微生物代谢生产的重要有机酸，其用途非常广泛，主要用于食品工业，其次是医药、纺织、建筑等工业部门；在各种重要器材的清洗、除锈和日用化工等方面也有重要用途。

目前柠檬酸发酵行业采取的发酵技术通常为一次投料一次放料的间歇式液体深层二级发酵技术。其发酵过程为：将淀粉质原料酶解制备发酵培养基，然后将黑曲霉菌种接种到发酵罐中的发酵培养基中进行发酵生产柠檬酸，发酵停止后发酵培养基经板框分离出菌体残渣和发酵清液，发酵清液进入后续工序提取柠檬酸，菌体残渣进入饲料烘干工序。

但采用现有技术生产柠檬酸，柠檬酸的产量和发酵转化率均较低，并且发酵过程中对培养基的搅拌功率较大，因此，发酵成本较高。

发明内容

本发明的目的是为了克服采用现有技术生产柠檬酸中，柠檬酸的产量和发酵转化率均较低，并且发酵成本高的缺陷，提供一种柠檬酸的产量和发酵转化率均较高，且发酵成本低的发酵制备柠檬酸的方法。

本发明的发明人发现，采用现有技术生产柠檬酸，柠檬酸的产量和发酵转化率均较低的原因在于：由于在配制用于柠檬酸发酵的培养基时，一般都是一次性将发酵所需的营养物质全部加入到发酵罐中，但这样致使在发酵过程中，由于发酵培养基中营养过剩，导致发酵菌种生长过快。一方面，发酵菌种生长过快，会偏向于将绝大部分营养物质和时间用于自身的生长上，使得用于合成柠檬酸的营养物质和时间大大减少，造成了营养物质的浪费，并且其合成柠檬酸的效率会大大下降。另一方面，由于发酵菌种生长过快，导致其菌球过大且蓬松，菌丝过长，使得在发酵过程中保证溶氧量的情况下会增加搅拌功率，从而造成了能源的浪费，增加了发酵成本。

本发明的发明人发现，在柠檬酸发酵过程中，在发酵菌种对数生长的早期通过向发酵培养基中添加抑制剂，使得发酵菌种的生长以及产柠檬酸处于相协调的状态，因此，能够在一定程度上抑制发酵菌种的过快生长，使其维持在正常的生长水平上，使其用于自身生长的营养物质大大减少，在保证了发酵菌体向更有利于产柠檬酸的趋势发展的同时，也增加了用于产柠檬酸的营养物质，从而提高了柠檬酸的发酵水平。另外，发酵菌体的状态相对于现有技术的发酵菌体的状态，菌球小而紧密，菌丝较短，使得在保证发酵所需的溶氧量的前提下有效地降低了搅拌功率，从而易于操作并降低了生产成本。

基于以上发现，本发明提供了一种发酵制备柠檬酸的方法，该方法包括，在能够生成柠檬酸的条件下，将黑曲霉接种到发酵培养基中进行发酵，其中，当发酵培养基中黑曲霉的含量达到1-1.7重量%时开始向发酵培养基中添加抑制剂，所述抑制剂的添加量使得黑曲霉的含量能够增加，但增加量不超过0.2重量%/小时。

优选地，所述抑制剂的添加量使得黑曲霉的含量的增加量为0.02-0.08重量%/小时。

优选地，当发酵培养基中黑曲霉的含量达到1.2-1.5重量%时开始向发酵培养基中添加所述抑制剂。

优选地，当发酵培养基中黑曲霉的含量达到1.6-2.5重量%时停止向发酵培养基中添加所述抑制剂。

通过采用本发明的技术方案进行柠檬酸发酵，在发酵过程中添加抑制剂，有效的抑制了发酵菌种的过快生长，并使其维持在正常的生长水平上，无论从菌体本身还是营养物质上都向更有利于产柠檬酸的趋势发展，从而提高了发酵水平。同时，在适当的时机加入抑制剂，还能够使得发酵菌种的菌球小而紧密，菌丝较短，使得在保证发酵所需的溶氧量的前提下有效地降低了搅拌功率，从而易于操作并降低了生产成本。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

图1为实施例1在添加抑制剂的情况下，发酵24小时的菌体形态的显微镜图片，放大倍数为150倍。

图2为对比例1在不添加抑制剂的情况下，发酵24小时的菌体形态的显微镜图片，放大倍数为150倍。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

一方面，本发明提供了一种发酵制备柠檬酸的方法，该方法包括，在能够生成柠檬酸的条件下，将黑曲霉接种到发酵培养基中进行发酵，其中，当发酵培养基中黑曲霉的含量达到1-1.7重量%时开始向发酵培养基中添加抑制剂，所述抑制剂的添加量使得黑曲霉的含量能够增加，但增加量不超过每小时0.2重量%。

根据本发明，柠檬酸发酵过程中，在黑曲霉生长的对数期，其主要进行自身的生长。而由于目前柠檬酸发酵行业，为了节省操作步骤，采取的发酵技术通常为一次投料，因此，发酵培养基中的营养物质相对于黑曲霉生长所需的营养是过剩的。在这种情况下，黑曲霉的主要活动会偏向于将大部分营养物质用于有利于其自身生长的基础代谢上，因此，产柠檬酸的代谢会受到抑制；同时，由于其自身生长消耗了过多的营养，也导致了营养物质的浪费。并且，其过快的生长导致其菌球过大且疏松、菌丝过长，使得在保证溶氧量的前提下搅拌功率剧增，从而造成了成本的浪费。因此，本发明中，通过在黑曲霉生长的对数期向发酵培养基中添加一定量的抑制剂，以抑制黑曲霉的过快生长，使其维持在正常的生长水平上，以能够在自身的生长代谢和产柠檬酸的代谢中达到平衡，从而发挥其产柠檬酸的最佳水平。

通常情况下，当发酵培养基中黑曲霉的含量达到1-1.7重量%时，黑曲霉正处于其生长的对数期早期，在此时间段内开始向发酵培养基中添加抑制剂，能够有效的抑制黑曲霉的过快生长，使其趋于正常的生长水平。同时，本发明的发明人还发现，过早加入抑制剂会使得发酵菌体还来不及正常的生长就受到抑制，从而不能正常的生产柠檬酸。过晚加入抑制剂会使的抑制剂对发酵菌体无法起到抑制的作用，从而不能实现本发明的目的。因此，本发明中，当发酵培养基中黑曲霉的含量达到1-1.7重量%时开始向发酵培养基中添加抑制剂。

优选地，本发明的发明人发现，当发酵培养基中黑曲霉的含量达到1.2-1.5重量%时开始向发酵培养基中添加抑制剂能够更好地实现本发明的发明目的。

根据本发明的发明人的实践经验，在正常的柠檬酸发酵过程中，当将黑曲霉菌种接种到发酵培养基中后的12-18小时，发酵培养基中黑曲霉的含量一般可达到1-1.7重量%。因此，在本发明的一种可替代的实施方式中，为了节省操作步骤，还可以在当将黑曲霉菌种接种到发酵培养基中后的12-18小时时开始向发酵培养基中添加抑制剂。

本发明的发明人通过研究发现，在保证黑曲霉能够生长，且其含量的增加量不超过每小时0.2重量%的情况下，黑曲霉菌体能够在自身的生长代谢和产柠檬酸的代谢中达到很好的平衡。

根据本发明，尽管当黑曲霉的含量的增加量在如上所述范围内时，即可实现本发明的目的。但优选地，当黑曲霉的含量的增加量为0.02-0.08重量%/小时，更优选为0.04-0.08重量%/小时时，黑曲霉菌体能够在自身的生长代谢和产柠檬酸的代谢中达到更好的平衡，从而可以更进一步实现本发明的目的。

需要注意的是，本发明中的术语“增加量”是指单位时间内黑曲霉湿菌体增加的重量百分含量。

根据本发明，对所述发酵培养基中菌体含量进行测定的方法为本领域技术人员所公知。例如，每隔一段时间对发酵培养基进行取样，并离心（3000-5000rpm离心10-15分钟）收集菌体沉淀，然后对所述菌体沉淀进行称重得到黑曲霉湿菌体的含量。

本发明中，对发酵培养基进行取样的时间间隔没有特别的限定，可以根据黑曲霉的实际生长状况进行调整，例如，当黑曲霉的含量增加较慢时，其间隔时间可以适当延长，例如，可以为2-3小时；当增加较快时，其间隔时间可以适当缩短，例如，可以为1-2小时。

本发明中，对抑制剂的种类没有特别的限制，只要能够抑制黑曲霉菌体的生长并不影响黑曲霉的产酸以及后续柠檬酸的分离即可。优选地，所述抑制剂为抗生素和/或表面活性剂。

本领域技术人员公知，表面活性剂的分子结构具有两亲性：一端为亲水基团，另一端为憎水基团。因此，表面活性剂通常用作乳化剂。尤其是在培养基的配制中，常添加表面活性剂以使不易溶于水的物质能够在水中较好的溶解，以达到促溶的作用。在有些研究中，例如，表面活性剂对白腐真菌降解多环芳烃的影响（陈静等，环境科学，2006年1月，第27卷第1期）中，表面活性剂还可以促进菌体的生理活动。而本发明的发明人却意外的发现，在柠檬酸的发酵培养基中添加表面活性剂却可以起到抑制黑曲霉菌体过快生长作用，且不会影响黑曲霉的产酸以及后续柠檬酸的分离。

优选地，所述抗生素选自青霉素；所述表面活性剂选自吐温-60和/或吐温-20。

根据本发明，所述抑制剂的添加状态可以以固体状态添加，也可以以其水溶液的状态添加，优选情况下，以其水溶液的状态添加到所述发酵培养基中。同时，一方面为了不使当所述抑制剂的水溶液加入到发酵培养基中时引起发酵培养基中局部抑制剂浓度过高而对菌体造成杀伤作用；另一方面，为了不使所述抑制剂的水溶液由于浓度过低而加入的量过多，从而对发酵培养基造成稀释，优选情况下，当所述抑制剂为抗生素时，其浓度为1.5-2.0U/ml发酵液，当所述抑制剂为表面活性剂时，其浓度为0.5-1.0g/l发酵液。

根据本发明，对所述抑制剂的添加方式以及添加量没有特别的限制，只要保证添加后能够将黑曲霉的含量的增加量控制在本发明的范围内即可。例如，可以向所述发酵培养基中连续添加所述抑制剂。当以连续添加的方式添加抑制剂时，通常以抑制剂的水溶液的状态添加，并优选使所述抑制剂的水溶液的浓度在上述优选范围内，其流速的控制可以根据菌体含量，以及通过对发酵培养基中菌体含量的检测得到的数据进行调整，以使黑曲霉的含量的增加量不超过0.2重量%/小时，并优选控制在0.02-0.08重量%/小时，更优选控制在0.04-0.08重量%/小时之间。通常情况下，以每升发酵培养基为基准，所述抑制剂的流速为0.4-0.6L/h。

或者，还可以分多次向所述发酵培养基中添加所述抑制剂。当以分多次添加的方式加入抑制剂时，所述抑制剂的加入状态可以以固体的状态加入，也可以以其水溶液的状态加入，但通常以其水溶液的状态加入，并优选使所述抑制剂水溶液的浓度在上述优选范围内，每次的添加量和相邻两次添加的间隔时间可以根据发酵培养基中的菌体含量，以及通过对发酵培养基的菌体含量每隔一段时间进行检测得到的数据进行调整（例如，添加一次后，每隔1-2小时对发酵培养基的菌体含量进行检测，当菌体含量的增加量刚刚不超过0.2重量%/小时，优选不超过0.08重量%/小时时，再次进行添加），以使黑曲霉的含量的增加量不超过0.2重量%/小时，并优选控制在0.02-0.08重量%/小时，更优选控制在0.04-0.08重量%/小时之间。通常情况下，以每升发酵培养基为基准，其每次的添加量为0.4-0.5g/L，相邻两次添加的时间间隔优选为1-2小时。

本发明的发明人发现，由于以连续性的方法向发酵培养基中添加抑制剂，可使发酵培养基中菌体的含量的增加量始终控制在本发明的最优范围内。因此，优选情况下，采用连续添加的方式向发酵培养基中添加所述抑制剂。

本发明中，尽管可以一直添加所述抑制剂直到发酵的终点，但通常当发酵培养基中菌体的含量达到1.6-2.5重量%（大致相应于将黑曲霉接种到发酵培养基中后的28-40小时），优选达到1.7-2重量%（大致相应于将黑曲霉接种到发酵培养基中后的30-35小时）时，黑曲霉正处于生长的稳定期，发酵培养基中菌体的含量变化不大，因此，为了节省成本及操作时间，并降低抑制剂对发酵培养基的影响，优选地，当发酵培养基中菌体的含量达到1.6-2.5重量%，优选达到1.7-2重量%时停止向发酵培养基中添加所述抑制剂。

根据本发明，还可以根据发酵过程中黑曲霉菌体的形态的变化判断开始加入抑制剂的时间以及添加量。黑曲霉菌体形态的变化的判断标准具体可以为：获得上述控制点的黑曲霉形态的显微镜图片，并将不同控制点的黑曲霉形态的显微镜图片做成比对卡，并以此作为参考。

根据本发明，对发酵培养基的成分没有特别的要求，只要可以用于柠檬酸发酵的发酵培养基即可。优选地，所述发酵培养基含有淀粉质原料酶解产物，氮源含量为0.06-0.14重量%，磷源含量为0.005-0.07重量%，无机盐含量0.1-2.6重量%，水含量为77-86重量%；所述发酵培养基的总糖含量为10-20重量%。一般地，淀粉质原料酶解得到液化液，液化液经过分离得到淀粉质原料酶解残渣和淀粉质原料酶解液化清液，通常可以将淀粉质原料酶解液化清液用于制备发酵培养基，也可以将淀粉质原料酶解液化清液与淀粉质原料酶解残渣混合后用于制备发酵培养基，还可以将淀粉质原料酶解液化清液与液化液混合后用于制备发酵培养基。本发明所述淀粉质原料酶解产物优选由液化液和淀粉质原料酶解液化清液与水混合或不与水混合得到，且进一步优选以所述发酵培养基的总重量为100重量份为基准，所述淀粉质原料酶解液化清液的用量为75-85重量份，所述液化液的用量为15-20重量份，水的用量为0-5重量份。

其中，所述总糖的含量是指以利用菲林试剂法测定的葡萄糖计的糖含量。

根据本发明，所述淀粉质原料酶解液化清液可以通过多种方法制备得到，例如，可以通过如下方法制备得到：将淀粉质原料粉碎，将粉碎后的产物进行酶解，得到酶解产物，将酶解产物固液分离，得到淀粉质原料酶解液化清液和淀粉质原料酶解残渣，所述固液分离的条件使淀粉质原料酶解残渣的固含量为5-60重量%，更优选为30-50重量%。

根据本发明，所述淀粉质原料可以为本领公知的各种可以用于酶解、发酵制备柠檬酸的含有淀粉的原料，例如，可以选自玉米、薯类（如木薯）和小麦中的一种或几种，优选情况下，所述淀粉质原料为玉米。

所述酶解步骤可以通过本领域常用的方法完成，比如向粉碎产物中添加产酶微生物和/或酶，在产酶微生物的生长温度和/或酶有活力的温度下保温完成。所述产酶微生物为能够分泌淀粉酶的产酶微生物。所述酶包括淀粉酶。

由于微生物生长会产生副产物，因此优选直接加入酶。所述酶的用量越多越好，出于成本考虑，优选以每克粉碎后的粉碎产物的干重计，所述淀粉酶的用量为15-50个酶活力单位。

本发明所述酶的酶活力单位的定义为：在pH值为6.0、温度为70℃的条件下，1分钟将1毫克淀粉转化为还原糖所需的酶量为一个酶活力单位。

所述酶解的温度可以在很大范围内改变，优选为80-120℃，更优选为90-105℃。所述酶解的时间理论上越长越好，考虑到设备利用率，优选所述酶解的时间为90-150分钟，更优选为100-120分钟。所述酶解的pH值可以在很大范围内改变，优选为5.0-7.0，更优选pH值为5.6-6.0。

淀粉酶是指能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，其具体选择为本领域技术人员所公知，例如，所述淀粉酶一般包括α-淀粉酶、β-淀粉酶和异淀粉酶。

根据本发明，优选使用α-淀粉酶和/或异淀粉酶。

根据本发明，所述黑曲霉的接种量可以在很大范围内改变，优选情况下，以每毫升发酵培养基为基准，黑曲霉的接种量为1×10⁴-2.5×10⁵个孢子，更优选3×10⁴-1.5×10⁵个孢子。

所述孢子数可以通过本领域公知的方法测定，例如，通过血球计数板计数。

本发明发酵所使用的黑曲霉可以为商购的黑曲霉固体制剂或黑曲霉菌种，例如，黑曲霉Co827（上海工业微生物研究所）和黑曲霉T01（天津工业微生物所）。

所述黑曲霉可以采用常规的方法接种，例如，在被接种至发酵培养基中之前，将所述黑曲霉经过种子培养处理，之后将得到的种子液加入到发酵培养基中。黑曲霉种子培养的程度可以通过取样显微镜镜检、酸度测定和pH测定对黑曲霉的生长进行观察，当pH在2.0-2.5、酸度0.8-2.0%、菌球大小均匀、菌丝粗壮伸出时停止培养。

优选情况下，所述种子培养处理的方法包括：将黑曲霉接种在黑曲霉培养液中进行培养，所述黑曲霉培养液中含有10-17重量%的玉米粉，接种后黑曲霉培养液中黑曲霉的浓度为3×10⁵-4×10⁵个孢子/毫升。

根据本发明，所述黑曲霉培养液的制备方法没有特别的限制，只要得到的培养液能够适用于黑曲霉的培养即可。

根据本发明，所述黑曲霉种子的培养条件可以在很大范围内改变，例如所述培养的条件可以包括：培养的温度可以为30-42℃，pH值可以为1-7，通气量可以为0.1-1.0体积：（体积·分钟），压力可以为0-0.1Mpa，培养的时间可以为18-35小时，搅拌速度为700-800rpm；优选的情况下，培养的温度为32-40℃，pH值为2-6，通气量为0.1-0.8（体积：体积·分钟），压力为0-0.08Mpa，培养的时间为20-30小时。

根据本发明，所述发酵的条件除向发酵培养基中添加抑制剂以使黑曲霉的含量的增加量控制在本发明的范围内之外没有特别的限制，可以为本领域常规的发酵条件，例如，所述发酵的条件可以包括：温度为33-40℃，优选为34-38℃；通气量为0.1-1体积：（体积·分钟），优选为0.3-1.0体积：（体积·分钟）；搅拌速度为800-900rpm；时间为50-65小时，优选为55-62小时。

术语“通气量”一般以通气比来表示，通常以每分钟内通过单位体积培养液的空气体积比来表示（V／(V·min)），例如通气比为1:0.1-1，简称通气量为0.1-1体积：（体积·分钟）。

所述培养的设备为本领域技术人员所公知，例如，可以使用发酵罐进行培养。

按照本发明的方法制备得到的发酵产物柠檬酸可以用常规的方法，根据不同工业产品的要求分离并精制，比如中和、酸解、脱色、浓缩、结晶、包装。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

下面根据制备例、实施例和对比例详细说明本发明提供的柠檬酸的发酵方法。

其中，发酵酸度和发酵转化率通过如下方法计算。

青霉素购买华北制药股份有限公司。吐温-60、吐温-20购买佛山市科的气体化工有限公司。

发酵酸度：根据GB1987-2007标准检测发酵后发酵培养基的浓度（简称酸度）。

发酵转化率：通过上述发酵酸度计算柠檬酸的转化率，转化率（%）=发酵培养基的浓度（简称酸度）×发酵培养基的体积/总糖的重量×100%，其中，总糖的重量包括种子罐用糖重量和发酵罐用糖重量。所述总糖的浓度是指以利用菲林试剂法测定的葡萄糖计的糖浓度。

黑曲霉菌体含量的测定：取50ml发酵液，以4000rpm的转速离心10min，去掉上清后测定黑曲霉湿菌体沉淀的重量，并计算黑曲霉湿菌体的含量。

制备例1

发酵用发酵培养基的制备

1）原料的粉碎：将收获的玉米在热水槽浸润，直至玉米的含水量为15重量%，然后通过粉碎机（江苏牧羊集团有限公司，968-3型）进行粉碎，得到淀粉质原料粉碎产物（粉碎颗粒中50重量%的颗粒直径小于0.1cm）；

2）调浆：将50℃的水与1）中得到的淀粉质原料粉碎产物混合进行调浆得到淀粉浆液，所述淀粉质原料粉碎产物与水的重量比为1：3，淀粉浆液的pH值为5.5；

3）酶解：将步骤2）得到的淀粉浆液与淀粉酶（诺维信公司，α-淀粉酶，本发明实施例中均为此淀粉酶）的总重量的1/2的酶（添加淀粉酶的总重量以15U/g玉米粉粉碎产物）混合，在95℃、pH为5.5的条件下进行一次喷射液化5分钟，然后在125℃进行二次喷射液化，之后闪蒸降温至95℃，再添加另外总重量的1/2的淀粉酶进行酶解直至酶解产物的DE值达到18重量%，得到酶解产物，也即玉米液化液；

4）过滤：将3）得到的80重量%的酶解产物通过用液压式板框压滤机进行压滤，分离出玉米液化清液和玉米酶解残渣；

5）配制发酵培养基：将上述玉米液化清液和玉米液化液以80：15的体积比混合后加入到发酵罐中，高温高压灭菌后得到发酵培养基。所述发酵培养基中总糖的含量为15.5重量%，氮源含量为0.1重量%，磷源含量为0.035重量%，无机盐的含量为2.1重量%，水的含量为81.0重量%。其中，所述总糖含量为以葡萄糖计的糖含量。

制备例2

发酵菌种种子液的制备

将制备例1的步骤3）中的部分玉米液化液加水稀释至总糖的含量为11重量%，将培养液投入种子罐，加热到121℃消毒，维持20分钟后快速降温至36℃，接入黑曲霉菌种（黑曲霉T01，天津工业微生物所，本发明实施例中均为此黑曲霉菌种，接种量为：每毫升培养液为基准，接种1×10⁵个孢子），温度为37℃，通气量为0.4V／V·min，通入的空气压力为0.05-0.06Mpa，搅拌速度为750rpm，并在此阶段内维持此罐压的条件下进行菌种培养；通过取样显微镜镜检、酸度测定和pH测定对黑曲霉的生长进行观察，24小时之后，当pH在2.0、酸度1.0g/L、菌球大小均匀、菌丝粗壮伸出时，停止培养。其中，所述总糖含量为以葡萄糖计的糖含量。

实施例1

本实施例用于说明本发明提供的发酵制备柠檬酸的方法。

将制备例2中培养的黑曲霉种子液加入到制备例1的发酵培养基中开始发酵，其中，以每毫升发酵培养基计，黑曲霉的接种量为3.0×10⁴个孢子，发酵条件包括温度为37℃，培养的压力为0.04Mpa，通气量为0.8体积：（体积·分钟），搅拌速度为850rpm。发酵过程中不断取样测定培养基中的菌体含量。

当发酵培养基中黑曲霉的含量达到1.4重量%时开始向发酵培养基中连续添加浓度为0.6g/L发酵液的吐温-60溶液。其中，以每升发酵培养基计，所述吐温-60溶液添加的流速为0.4L/h，维持发酵培养基中菌体的增加量在0.05-0.07重量%/小时之间（整个过程每隔3小时检测一次发酵培养基中的菌体含量，以保证菌体的增加量在0.05-0.07重量%/小时之间，同时，镜检菌体的形态）。当菌体含量达到1.9重量%时停止向发酵培养基中添加所述抑制剂。发酵至60小时，对发酵产物进行固液分离得到柠檬酸溶液，并通过中和、酸解、脱色、浓缩、结晶、包装等过程精制得到的柠檬酸溶液。

根据GB1987-2007标准检测所得柠檬酸溶液的浓度（简称酸度），计算柠檬酸的转化率。结果如表1所示，图1为发酵24小时的菌体形态的显微镜图片，放大倍数为150倍。

实施例2

本实施例用于说明本发明提供的发酵制备柠檬酸的方法。

将制备例2中培养的黑曲霉种子液加入到制备例1的发酵培养基中开始发酵，其中，以每毫升发酵培养基计，黑曲霉的接种量为3.0×10⁴个孢子，发酵条件包括温度为37℃，培养的压力为0.04Mpa，通气量为0.8体积：（体积·分钟），搅拌速度为800rpm。发酵过程中不断取样测定培养基中的菌体含量。

当发酵培养基中黑曲霉的含量达到1.2重量%时开始向发酵培养基中连续添加浓度为1.5U/ml发酵液的青霉素溶液。其中，以每升发酵培养基计，所述青霉素溶液添加的流速为0.5L/h，维持发酵培养基中菌体的增加量在0.06-0.08重量%/小时之间（整个过程每隔3小时检测一次发酵培养基中的菌体含量，以保证菌体的增加量在0.06-0.08重量%/小时之间，同时，镜检菌体的形态）。当菌体含量达到1.7重量%时停止向发酵培养基中添加所述抑制剂。发酵至60小时，对发酵产物进行固液分离得到柠檬酸溶液，并通过中和、酸解、脱色、浓缩、结晶、包装等过程精制得到的柠檬酸溶液。

根据GB1987-2007标准检测所得柠檬酸溶液的浓度（简称酸度），计算柠檬酸的转化率。结果如表1所示。

实施例3

本实施例用于说明本发明提供的发酵制备柠檬酸的方法。

将制备例2中培养的黑曲霉种子液加入到制备例1的发酵培养基中开始发酵，其中，以每毫升发酵培养基计，黑曲霉的接种量为3.0×10⁴个孢子，发酵条件包括温度为37℃，培养的压力为0.04Mpa，通气量为0.8体积：（体积·分钟），搅拌速度为900rpm。发酵过程中不断取样测定培养基中的菌体含量。

当发酵培养基中黑曲霉的含量达到1.5重量%时开始向发酵培养基中连续添加浓度为0.5g/L的吐温-20溶液。其中，以每升发酵培养基计，所述吐温-20溶液添加的流速为0.4L/h，维持发酵培养基中菌体的增加量在0.04-0.07重量%/小时之间（整个过程每隔3小时检测一次发酵培养基中的菌体含量，以保证菌体的增加量在0.04-0.07重量%/小时之间，同时，镜检菌体的形态）。当菌体含量达到2.0重量%时停止向发酵培养基中添加所述抑制剂。发酵至60小时，对发酵产物进行固液分离得到柠檬酸溶液，并通过中和、酸解、脱色、浓缩、结晶、包装等过程精制得到的柠檬酸溶液。

根据GB1987-2007标准检测所得柠檬酸溶液的浓度（简称酸度），计算柠檬酸的转化率。结果如表1所示。

实施例4

本实施例用于说明本发明提供的发酵制备柠檬酸的方法。

按照实施例1的方法进行柠檬酸的制备，其中，不同的是，当发酵培养基中黑曲霉的含量达到1.7重量%时开始向发酵培养基中连续添加所述吐温-60溶液。发酵至60小时，对发酵产物进行固液分离得到柠檬酸溶液，并通过中和、酸解、脱色、浓缩、结晶、包装等过程精制得到的柠檬酸溶液。

根据GB1987-2007标准检测所得柠檬酸溶液的浓度（简称酸度），计算柠檬酸的转化率。结果如表1所示。

实施例5

本实施例用于说明本发明提供的发酵制备柠檬酸的方法。

按照实施例1的方法进行柠檬酸的制备，其中，不同的是，当发酵培养基中黑曲霉的含量达到1重量%时开始向发酵培养基中连续添加所述吐温-60溶液。发酵至60小时，对发酵产物进行固液分离得到柠檬酸溶液，并通过中和、酸解、脱色、浓缩、结晶、包装等过程精制得到的柠檬酸溶液。

根据GB1987-2007标准检测所得柠檬酸溶液的浓度（简称酸度），计算柠檬酸的转化率。结果如表1所示。

实施例6

本实施例用于说明本发明提供的发酵制备柠檬酸的方法。

按照实施例1的方法进行柠檬酸的制备，其中，不同的是，所述抑制剂一直添加到发酵的终点。发酵至60小时，对发酵产物进行固液分离得到柠檬酸溶液，并通过中和、酸解、脱色、浓缩、结晶、包装等过程精制得到的柠檬酸溶液。

根据GB1987-2007标准检测所得柠檬酸溶液的浓度（简称酸度），计算柠檬酸的转化率。结果如表1所示。

实施例7

本实施例用于说明本发明提供的发酵制备柠檬酸的方法。

按照实施例1的方法进行柠檬酸的制备，其中，不同的是，向发酵培养基中分2次添加所述吐温-60溶液，相邻两次添加所述抑制剂的时间间隔为1.5小时。其中，以每升发酵培养基计，每次添加的吐温-60量为0.5g/L，并每隔1小时对发酵培养基中的菌体含量进行检测，根据检测数据调整添加量，以保证使得黑曲霉菌的含量能够增加，且增加量不超过0.2重量%/小时。

发酵至60小时，对发酵产物进行固液分离得到柠檬酸溶液，并通过中和、酸解、脱色、浓缩、结晶、包装等过程精制得到的柠檬酸溶液。

根据GB1987-2007标准检测所得柠檬酸溶液的浓度（简称酸度），计算柠檬酸的转化率。结果如表1所示。

对比例1

本对比例用于说明现有技术提供的发酵制备柠檬酸的方法。

按照实施例1的方法进行柠檬酸的制备，其中，不同的是，不向发酵培养基中添加浓度抑制剂。发酵至60小时，对发酵产物进行固液分离得到柠檬酸溶液，并通过中和、酸解、脱色、浓缩、结晶、包装等过程精制得到的柠檬酸溶液。

根据GB1987-2007标准检测所得柠檬酸溶液的浓度（简称酸度），计算柠檬酸的转化率。结果如表1所示。图2为发酵24小时的菌体形态的显微镜图片，放大倍数为150倍。

对比例2

本对比例用于说明加入抑制剂的时机不在本发明范围内的发酵制备柠檬酸的方法。

按照实施例1的方法进行柠檬酸的制备，其中，不同的是，当发酵培养基中黑曲霉的含量达到0.5重量%时开始向发酵培养基中连续添加所述吐温-60溶液。发酵至60小时，对发酵产物进行固液分离得到柠檬酸溶液，并通过中和、酸解、脱色、浓缩、结晶、包装等过程精制得到的柠檬酸溶液。

根据GB1987-2007标准检测所得柠檬酸溶液的浓度（简称酸度），计算柠檬酸的转化率。结果如表1所示。

对比例3

本对比例用于说明加入抑制剂的时机不在本发明范围内的发酵制备柠檬酸的方法。

按照实施例1的方法进行柠檬酸的制备，其中，不同的是，当发酵培养基中黑曲霉的含量达到2.5重量%时开始向发酵培养基中连续添加所述吐温-60溶液。发酵至60小时，对发酵产物进行固液分离得到柠檬酸溶液，并通过中和、酸解、脱色、浓缩、结晶、包装等过程精制得到的柠檬酸溶液。

根据GB1987-2007标准检测所得柠檬酸溶液的浓度（简称酸度），计算柠檬酸的转化率。结果如表1所示。

表1

实施例/对比例编号	酸度（%）	转化率（%）
			实施例1	14.65	96.35
实施例2	14.35	96.15
			实施例3	14.52	96.25
实施例4	14.23	96.18
			实施例5	14.18	96.08
实施例6	14.,24	96.12
			实施例7	14.12	96.06
对比例1	13.05	95.29
			对比例2	13.25	95.08
对比例3	13.35	94.95

从上表1的数据可以看出，与对比例1-3相比，实施例1-7采用本发明提供的柠檬酸的制备方法，当发酵培养基中黑曲霉的含量达到1-1.7重量%时开始向发酵培养基中添加抑制剂，所述抑制剂的添加量使得黑曲霉菌的含量能够增加，且增加量不超过0.2重量%/h，有效地提高了发酵终点时柠檬酸的发酵酸度和发酵转换率。并且，将实施例1与实施例4和5相比，可以看出，当将发酵培养基中黑曲霉的含量的增加量控制在本发明优选的范围内，发酵水平更高。将实施例1和实施例6相比，可以看出，当发酵培养基中黑曲霉的含量达到1.7-2重量%时停止向发酵培养基中添加所述抑制剂，发酵水平较高。将实施例1和实施例7相比，连续性添加所述抑制剂比分多次添加发酵水平要高。

另外，通过图1和图2的比较可以看出，在同一时间点对黑曲霉的菌体形态进行检测，实施例1中添加抑制剂的黑曲霉菌体的菌球小而紧密，菌丝较短；而对比例1中不添加抑制剂的黑曲霉菌体的菌球大而疏松，菌丝较长。因此，在发酵过程中保证溶氧量的情况下，采用本发明的方法，其搅拌功率较小，能耗低，从而节省了成本。

Claims (11)

1.一种发酵制备柠檬酸的方法，该方法包括，在能够生成柠檬酸的条件下，将黑曲霉接种到发酵培养基中进行发酵，其特征在于，当发酵培养基中黑曲霉的含量达到1-1.7重量%时开始向发酵培养基中添加抑制剂，所述抑制剂的添加量使得黑曲霉的含量能够增加，但增加量不超过0.2重量%/小时。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述抑制剂的添加量使得黑曲霉的含量的增加量为0.02-0.08重量%/小时。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，当发酵培养基中黑曲霉的含量达到1.2-1.5重量%时开始向发酵培养基中添加所述抑制剂。

4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，所述抑制剂为抗生素和/或表面活性剂。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述抗生素为青霉素；所述表面活性剂为吐温-60和/或吐温-20。

6.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，向所述发酵培养基中添加所述抑制剂的方法包括：向所述发酵培养基中连续添加所述抑制剂；或者，向所述发酵培养基中分多次添加所述抑制剂，相邻两次添加所述抑制剂的时间间隔为1-2小时。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，当发酵培养基中黑曲霉的含量达到1.6-2.5重量%时停止向发酵培养基中添加所述抑制剂。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，当发酵培养基中黑曲霉的含量达到1.7-2重量%时停止向发酵培养基中添加所述抑制剂。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述发酵的条件包括：温度为33-40℃，通气量为0.1-1体积：（体积·分钟），时间为50-65小时。

10.根据权利要求1所述的方法，其中，以每毫升发酵培养基为基准，黑曲霉的接种量为1×10⁴-2.5×10⁵个孢子。

11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述发酵培养基中氮源含量为0.06-0.14重量%，磷源含量为0.005-0.07重量%，无机盐含量0.1-2.6重量%，水含量为77-86重量%；所述发酵培养基的总糖含量为10-20重量%。

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