CN102409066A - 一种柠檬酸的发酵方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种柠檬酸的发酵方法，该方法包括在发酵条件下，将柠檬酸发酵菌种接入柠檬酸发酵培养基中，其中，所述发酵分连续的多阶段进行，所述多阶段包括第一发酵阶段和第一发酵阶段以后的发酵阶段，在第一发酵阶段中，向发酵罐中流加柠檬酸发酵培养基以及流加发酵菌种种子液，柠檬酸发酵培养基的流加量以及发酵菌种种子液的流加量使得该阶段的发酵液中的柠檬酸的酸度为50-100g/L，还原糖浓度为60-100g/L，并使第一发酵阶段的发酵液依次连续流入后续阶段的发酵罐中进行发酵，发酵终点的发酵液中柠檬酸的酸度为不小于140g/L，且残还原糖含量为0-4g/L。本发明提供的柠檬酸的发酵方法能够提高发酵设备的利用效率，缩短了生产周期，达到降低柠檬酸发酵成本的目的。

Description

一种柠檬酸的发酵方法

技术领域

本发明涉及一种柠檬酸的发酵方法，特别地，涉及一种能够提高发酵设备的利用率、缩短生产周期、降低成本的柠檬酸连续发酵方法。

背景技术

柠檬酸是有机酸中第一大酸，由于物理、化学等方面的优异性能，广泛应用于医药、化学、电子、纺织、石油、皮革、建筑、摄影、塑料、铸造和陶瓷等工业领域。

目前我国柠檬酸发酵绝大多数采用间歇发酵的方法，发酵采用每罐按照一定的比例投入发酵培养基，并接入一定的柠檬酸菌种进行发酵培养，通过一次装液和菌种接种发酵至终点，当发酵残糖降低至一定程度后即判断为发酵终点。但是采用现有技术的这种发酵方法，随着发酵的进行，尽管柠檬酸酸度逐渐提高，残糖逐渐降低，但是，当发酵残糖降低到一定程度时，柠檬酸发酵菌种的代谢能力下降，致使发酵培养周期延长，且设备的利用率较低。

发明目的

本发明的目的在于解决现有技术的柠檬酸发酵方法中存在的上述问题，提供一种能够提高设备利用率、缩短发酵周期的柠檬酸的发酵方法。

为了实现上述目的，本发明提供了一种柠檬酸的发酵方法，该方法包括在发酵条件下，将柠檬酸发酵菌种接入柠檬酸发酵培养基中，其中，所述发酵分连续的多阶段进行，所述多阶段包括第一发酵阶段和第一发酵阶段以后的发酵阶段，在第一发酵阶段中，向发酵罐中流加柠檬酸发酵培养基以及流加发酵菌种种子液，柠檬酸发酵培养基的流加量以及发酵菌种种子液的流加量使得该阶段的发酵液中的柠檬酸的酸度为50-100g/L，还原糖浓度为60-100g/L，并使第一发酵阶段的发酵液依次连续流入后续阶段的发酵罐中进行发酵，发酵终点的发酵液中柠檬酸的酸度为不小于140g/L，且残还原糖含量为0-4g/L。

根据本发明实施例1-4的连续发酵方法与对比例1的现有技术的间歇发酵方法相比较的结果，实施例1-4中将总体积为8×10⁵-12.5×10⁵L的发酵培养基发酵至柠檬酸的酸度为140-150g/L，且残还原糖含量为0-2g/L所需的时间为54-56小时；而对比例1中将同等体积相同组分的发酵培养基发酵至柠檬酸的酸度为139g/L，且残还原糖含量为1g/L所需的时间为73小时。由此说明，采用本发明的连续发酵柠檬酸的方法能够显著降低发酵周期，并提高了设备的利用率。

本发明的柠檬酸连续发酵方法具有以下优点：

1、在所述连续发酵过程中的第一发酵阶段将发酵培养基和培养成熟的发酵菌种的种子液连续流加到发酵罐中，从而达到连续发酵的目的，降低发酵周期，提高发酵设备的利用效率。

2、优选情况下，在所述连续发酵过程中的第一发酵阶段以及最后一个发酵阶段之间的任意一个发酵阶段选择性地流加一定的营养液来提高柠檬酸发酵强度，提高了发酵中后期柠檬酸菌种的代谢能力，从而进一步缩短了生产周期，达到降低柠檬酸发酵成本的目的。

附图说明

图1为根据本发明一实施例的连续发酵柠檬酸的示意图。

具体实施方式

根据本发明，所述第一发酵阶段的发酵液含有发酵产物以及不断流加的新鲜的发酵培养基和发酵菌种的种子液。

根据本发明，在所述第一发酵阶段中，对所述发酵培养基和发酵菌种种子液的流加速率没有特别的限定，只要保证发酵培养基在发酵罐中滞留一定时间而进行充分发酵，并达到第一发酵阶段的发酵液中的柠檬酸的酸度和还原糖浓度要求即可。优选情况下，在所述第一发酵阶段中，所述柠檬酸发酵培养基的流加速率为10-25立方米/小时，优选15-23立方米/小时；所述发酵菌种种子液的流加速率为1-5立方米/小时；优选，1-2立方米/小时；更优选1.4-1.8立方米/小时。

根据本发明，优选，所述柠檬酸发酵培养基的流加量以及发酵菌种种子液的流加量使得该第一发酵阶段的发酵液中，柠檬酸的酸度为50-100g/L，还原糖浓度为60-100g/L。

根据本发明，通常情况下，所述发酵终点的发酵液中柠檬酸的酸度为不小于140g/L，例如，140-150g/L，且残还原糖含量为0-4g/L，优选，残还原糖含量为0-2g/L。

根据本发明，在所述第一发酵阶段中，每毫升所述发酵液中的发酵菌种的量可以为2×10⁴-5×10⁴个孢子；优选，每毫升所述发酵液中的发酵菌种的量为2.5×10⁴-4×10⁴个孢子。

根据本发明，在第一发酵阶段中，可以是直接在空的发酵罐中流加柠檬酸发酵培养基和发酵菌种的种子液，流加量满足第一发酵阶段的发酵液的酸度和还原糖的浓度要求，也可以是在所述第一发酵阶段中，将柠檬酸发酵培养基和发酵菌种的种子液流加到含有发酵菌种和柠檬酸发酵培养基的发酵液的发酵罐中，即，将一部分发酵培养基和种子液先装入第一个发酵罐中进行预发酵，预发酵到柠檬酸酸度大于等于50g/L，还原糖浓度小于等于100g/L，然后再按照本发明的方法流加柠檬酸发酵培养基和发酵菌种的种子液。

根据本发明，对于所述营养液的流加量没有特别的限制，只要保证营养液的流加量使得该阶段的发酵液中的总氮含量≥400mg/L，优选达到600-1000mg/L，每小时增酸≥2.6g/L，优选每小时增酸为2.6-4.0g/L即可；更优选，所述营养液的流加量使得该阶段的发酵液中的总氮含量达到800-900mg/L，每小时增酸为3.0-4.0g/L。换言之，在第一发酵培养阶段之后以及最后一个发酵培养阶段之间的至少一个发酵培养阶段的发酵过程中，如果其中至少一个发酵阶段中的发酵液的总氮含量＜400mg/L、每小时增酸＜2.6g/L，有可能说明发酵液中的营养液过量或不足，这种情况可能导致菌种代谢下降，因此，优选需要向发酵液中流加发酵培养所需营养液。例如，以营养液中的氮元素为计，以每100L该发酵阶段中的发酵液为准，所述营养液的流加量可以为20-40g。

根据本发明，对于所述营养液的流加速率没有特别的限制，在保证整个发酵体系的动态平衡和保证发酵培养基的充分的发酵时间的条件下，以营养液中的氮元素为计，所述营养液的流加速率为0.4-0.8kg/小时。

根据本发明的柠檬酸连续发酵方法，所述营养液为含有氮源的溶液。所述氮源可以是本领域常用的各种氮源，例如，可以使用尿素、硫酸铵、硝酸铵和玉米浆中的一种或多种(使用玉米浆时玉米浆中有效氮源的量可以采用国标GB/T6432-1994的凯式定氮法检测)；优选使用尿素，例如，所述营养液可以通过如下方法配制：将60g尿素溶解在100ml的蒸馏水中作为营养液。

根据本发明，对于所述连续发酵阶段的数目没有特别的限制，保证发酵培养基充分发酵的条件下可以设置为数个发酵阶段，考虑到发酵培养时间和设备利用率等问题，本发明优选所述连续发酵阶段为3-5个，发酵培养的总时间使得最后一个发酵阶段得到的发酵培养混合中柠檬酸的酸度为大于140g/L，残还原糖含量为0-4g/L。

根据本发明，为了使发酵培养基在每个发酵阶段中都能够得到有效的发酵，以保证最终流出的发酵液发酵充分，在第二个发酵阶段以后的发酵阶段中，后一个发酵阶段中柠檬酸酸度均比前一个发酵阶段中柠檬酸酸度高20-40g/L；优选为20-30g/L。且后一个发酵阶段中残还原糖含量均比前一个发酵阶段中残还原糖含量低20-40g/L；优选为20-30g/L。

根据本发明，在第一发酵阶段，流加的发酵培养基(或者是第一发酵阶段中进行预发酵的发酵培养基)可以根据本领域公知的各种方法制备，例如，所述发酵培养基可以通过如下方法制备：将淀粉质原料粉碎，将粉碎后的产物进行调浆制备淀粉浆液，所述淀粉浆液在酶解条件下进行酶解，得到酶解产物，将部分酶解产物固液分离，得到液化清液和酶解残渣，并用酶解清液与未经固液分离的酶解产物混合成一定比例配制发酵培养基。为了更易于发酵的进行，优选情况下，以培养基体积为基准，所述酶解清液的含量为70-90体积％，所述未经固液分离的酶解产物的含量为10-30体积％。更优选情况下，所述酶解清液含量为75-85体积％，未经固液分离的酶解产物体积为15-25体积％。对所述柠檬酸发酵培养基中还原糖含量没有特别的限制，可以是本领域中常用的含量，优选情况下，所述柠檬酸发酵培养基中还原糖含量为140-180g/L。

所述淀粉浆液的制备方法可以采用本领域技术人员公知的各种常规的方法，例如，将淀粉质原料粉碎，将粉碎后的产物与水混合得到淀粉浆液，淀粉原料和水的混合重量比为65∶35-75∶25；优选为70∶30-80∶20。所述淀粉浆液的pH值优选为4.5-6.0；更优选为5-5.5。将淀粉质原料粉碎的条件和方式没有特别的限制，只要能够使淀粉质原料充分破碎即可，优选情况下，得到的粉碎后的产物的颗粒中50-60重量％的颗粒直径小于0.1cm。所述淀粉质原料可以为本领公知的各种可以用于酶解、发酵制备柠檬酸的含有淀粉的原料，例如，可以选自玉米、薯类(如木薯)、小麦和高粱中的一种或多种。

根据本发明，将淀粉浆液酶解的方法为本领域技术人员所公知。例如，将淀粉浆液与产酶微生物和/或酶混合，在产酶微生物的生长温度和/或酶有活力的温度下保温完成酶解得到酶解产物。

根据本发明，所述酶解条件可以为本领域技术人员所公知的制备柠檬酸的酶解条件，例如，所述酶解的温度可以为淀粉酶的任何最适作用温度，一般为70-98℃，更优选80-90℃；酶解的时间理论上越长越好，考虑到设备利用率，优选所述酶解的时间为60-180分钟，更优选为100-130分钟；所述酶解的pH值可以为淀粉酶的任何最适作用pH，一般为5.0-6.5，更优选pH值为5.3-6.3，最优选pH值为5.5-6.0。

由于微生物生长会产生副产物，因此优选直接加入酶。所述酶的用量越多越好，出于成本考虑，优选以每克淀粉质原料的干重计，所述淀粉酶的用量为10-60酶活力单位，更优选以每克淀粉质原料的干重计，所述淀粉酶的用量为15-50酶活力单位。

本发明所述酶的酶活力单位的定义为：在pH值为6.0、温度为70℃的条件下，1分钟将1毫克淀粉转化为葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。

所述酶包括淀粉酶。

淀粉酶是指能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，所述淀粉酶一般包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶。本发明所述酶包括淀粉酶。

α-淀粉酶又称淀粉1，4-糊精酶，它能够任意地、不规则地切开淀粉链内部的α-1，4-糖苷键，将淀粉水解为麦芽糖、含有6个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖。生产此酶的微生物主要有枯草杆菌、黑曲霉、米曲霉和根霉。

β-淀粉酶又称淀粉1，4-麦芽糖苷酶，能够从淀粉分子非还原性末端切开1，4-糖苷键，生成麦芽糖。此酶作用于淀粉的产物是麦芽糖与极限糊精。此酶主要由曲霉、根霉和内孢霉产生。

糖化酶又称淀粉α-1，4-葡萄糖苷酶，此酶作用于淀粉分子的非还原性末端，以葡萄糖为单位，依次作用于淀粉分子中的α-1，4-糖苷键，生成葡萄糖。糖化酶作用于支链淀粉后的产物有葡萄糖和带有α-1，6-糖苷键的寡糖；作用于直链淀粉后的产物几乎全部是葡萄糖。此酶产生菌主要是黑曲霉(左美曲霉、泡盛曲霉)、根霉(雪白根酶、德氏根霉)、拟内孢霉、红曲霉。

异淀粉酶又称淀粉α-1，6-葡萄糖苷酶、分枝酶，此酶作用于枝链淀粉分子分枝点处的α-1，6-糖苷键，将枝链淀粉的整个侧链切下变成直链淀粉。此酶产生菌主要是嫌气杆菌、芽孢杆菌及某些假单孢杆菌等细菌。

根据本发明所述的方法，所述发酵培养基中还可以含有氮源，添加氮源的作用是为了更好的维持黑曲霉的生长和代谢。其中，所述氮源的种类为本领域技术人员所公知，例如，所述氮源可以为尿素、硫酸铵和硝酸铵和玉米浆中的一种或多种。所述氮源的加入量可以在很大范围内改变，优选情况下，以所述发酵培养基的总重量为基准，以氮元素计，氮源的加入量为5-50g。

根据本发明，对于所述发酵菌种没有特别的限制，能够发酵单糖如葡萄糖和/或果糖、寡糖如蔗糖和/或半乳糖的微生物都可以用于本发明的发酵过程，优选所述发酵菌种使用黑曲霉。

根据本发明，所述发酵菌种种子液可以根据本领域公知的各种方法制备，例如，所述发酵菌种种子液可以通过如下方法制备：将部分酶解产物加水稀释得到培养液，将培养液投入种子罐，接入黑曲霉菌种，培养的温度为30-45℃，pH值为1-7，通气量为0.03-0.4V/V·min；通过取样显微镜镜检、酸度测定和pH测定对黑曲霉的生长进行观察，培养18-30小时之后，当pH在2.0-2.5、酸度5-20g/L、菌球大小均匀、菌丝粗壮成长时，停止培养。所述黑曲霉的接种量可以在很大范围内改变，优选情况下，将黑曲霉接种在黑曲霉培养液中进行培养，接种后黑曲霉培养液中黑曲霉的浓度为每毫升黑曲霉培养液中2×10⁵-5×10⁵个孢子。

所述孢子的个数可以通过本领域公知的方法测定，例如，通过血球计数板计数。具体可以通过如下方法测定：取一瓶培养黑曲霉的麸曲，将0.5％的吐温-80倒入瓶中定容到V1＝500mL，同时放入转子搅拌至悬液均匀。取V2＝5mL均匀孢子液稀释定容至V3＝100mL，超声分散10分钟，倒入烧杯内用磁力搅拌器使其均匀，取样采用血球计数板计数，计数得出每毫升稀释后孢子悬液孢子数N，则每瓶麸曲孢子数＝V1×(N×V3/V2)。

根据本发明，所述发酵步骤中发酵的条件可以在很大范围内改变，只要能够发酵得到柠檬酸即可，例如，发酵的条件包括：发酵的温度为25-45℃，pH值为1-7，罐压为0.04-0.1Mpa，通气量为0.15-0.5V/V·min，发酵的时间为45-75小时；更优选的情况下，所述发酵的条件包括：发酵的温度为30-40℃，pH值为1-4，罐压为0.05-0.09Mpa，通气量为0.2-0.3V/V·min。

术语“通气量”一般以通气比来表示，通常以每分钟内通过单位体积培养液的空气体积比来表示(V/V·min)，例如通气比为1∶0.05-0.5，简称通气量为0.05-0.5体积∶体积·分钟。

按照本发明的柠檬酸的连续发酵方法能够有效缩短发酵周期，如，总的发酵时间可以在60小时以内，优选为52-58小时。

每个发酵阶段的发酵条件只要满足上述要求即可，并可根据具体情况进行调整。以本发明实施例1为例，进一步优选情况下，第一发酵阶段的发酵条件为：发酵温度为30-40℃，pH值为2-4，罐压为0.06-0.09Mpa，通气量为0.2-0.3V/V·min；第二发酵阶段的发酵条件为：发酵温度30-40℃，pH值为1-3，罐压为0.06-0.09Mpa，通气量为0.2-0.3V/V·min；第三发酵阶段的发酵条件为：发酵温度为30-40℃，pH值为1-3，罐压为0.06-0.09Mpa，通气量为0.2-0.26V/V·min；第四发酵阶段的发酵条件为：发酵温度为30-40℃，pH值为1-3，罐压为0.05-0.08Mpa，通气量为0.2-0.25V/V·min；第五发酵阶段的发酵条件为：发酵温度为30-40℃，pH值为1-3，罐压为0.05-0.07Mpa，通气量为0.2-0.22V/V·min。

本发明发酵所使用的黑曲霉可以为商购的黑曲霉固体制剂或黑曲霉菌种，例如，黑曲霉Co827(上海新立工业微生物科技有限公司)、黑曲霉T01(天津工业微生物所)和黑曲霉菌株(中科院微生物所)。

所述发酵的设备为本领域技术人员所公知，例如，可以使用发酵罐进行培养。对于所述发酵罐没有特别的限制，可以使用本领域常用的各种发酵罐，优选，所述发酵罐的体积为300立方米。

本发明为多个发酵罐串联而进行的连续发酵。所述多罐串联连续发酵是在一组串联的几个发酵罐中进行的，罐的数量及位置可以不同。优选，采用3-5个发酵罐串联使用。根据本发明的实施例，每个发酵罐对应于一个发酵阶段，即3-5个发酵罐对应于本发明优选的3-5个发酵阶段。它们的位置可以在高度相同的一个平面上或者高度不同的平面上，呈梯级式。本发明优选多个发酵罐在一个平面上串联连接。在所述多个发酵阶段中，后一发酵阶段的发酵罐的入口分别与前一发酵阶段的发酵罐的出口相连通，且每个发酵阶段的发酵罐的入口位于发酵罐的下部，出口位于发酵罐的上部；在发酵第一发酵阶段中，从发酵罐的下部流加柠檬酸发酵培养基以及流加发酵菌种的种子液，并使第一发酵阶段的发酵液从发酵罐的上部流出而依次连续流入后续阶段的发酵罐中进行发酵。所述发酵罐的结构及发酵罐的串联连接方式都是本领域公知的，在此不再赘述。每个罐中物料的初始装液量为每个发酵罐体积的50-70％；当物料的流入和流出达到平衡后，将每个罐的装液量调节到80％左右。

以本发明一实施例中的多级串联发酵罐为例，如图1所示，所述多级串联发酵罐由5个串联的相同的发酵罐组成，物料在发酵罐中的具体发酵过程如下：发酵培养基和发酵菌种种子液分别以一定的速率从第一发酵罐底部连通管连续地流入第一发酵罐，发酵培养基在所述第一发酵罐中的发酵过程称为第一发酵阶段，经过所述第一发酵阶段的发酵产物—发酵液从第一发酵罐上部沿连通管从第二发酵罐底部流入，经第二发酵罐发酵后的发酵液从第二发酵罐上部沿连通管从第三发酵罐底部流入，这样顺序连续流动，经过一组串联的5个发酵罐进行连续发酵，发酵完全的发酵液从最后的发酵罐中连续排出。

根据本发明，终点糖度的测定方法可以是本领域公知的各种方法，优选，费林法参照国标GBT50099-2008。

根据本发明，残还原糖和每小时增酸的测定方法可以是本领域公知的各种方法，优选，费林法参照国标GBT50099-2008和NaOH滴定法参照国标GBT 8269-2006。

根据本发明，发酵液终点酸度的测定方法可以是本领域公知的各种方法，优选，NaOH滴定法参照国标GBT 8269-2006。

通过下列实施例进一步更详细地说明本发明，实施例是为了说明而非限制本发明。本领域中任何普通技术人员能够理解这些实施例不以任何方式限制本发明，可以适当的修改而不违背本发明的实质和偏离本发明的范围。

下面根据制备例、实施例和对比例详细说明本发明提供的柠檬酸的发酵方法。

制备例1

发酵培养基的制备

1)原料的粉碎：将收获的玉米在热水槽润焖，直至玉米的含水量为15重量％，然后通过粉碎机(江苏牧羊集团有限公司，968-3型)进行粉碎，得到淀粉质原料粉碎产物(粉碎颗粒中50重量％的颗粒直径小于0.1cm)；

2)调浆：用水与淀粉质原料混合进行调浆得到淀粉浆液，所述淀粉质原料与水的重量比为7∶3，淀粉浆液的pH值为5.3；

3)酶解：在2)得到的淀粉浆液与淀粉酶(诺维信公司，α-淀粉酶，本发明实施例中均为此淀粉酶)混合，在90℃、pH为5.5的条件下进行酶解100分钟，相对于每克粉碎后的产物，淀粉酶的用量为40酶活力单位，得到酶解产物，终点糖度为160g/L；

4)过滤：将3)得到的80重量％的酶解产物通过用液压式板框压滤机进行压滤，分离出酶解清液和酶解残渣；

5)配制发酵培养基：将酶解清液和经固液分离的酶解产物以85∶15的体积比混合后加入到发酵罐中，灭菌后得到发酵培养基，所述发酵培养基中碳源含量为19.6重量％，氮源含量为0.1重量％，磷源质量含量为350mg/L。

制备例2

发酵菌种种子液的制备

将制备例1的步骤3)中的部分酶解产物加水稀释至重量的1/10，得到培养液，将培养液投入种子罐，加热到121℃消毒，维持30分钟后快速降温至36℃，接入黑曲霉菌种(黑曲霉T01，天津工业微生物所，本发明实施例中均为此黑曲霉菌种，接种量为：每升培养液为基准，接种3×10⁵个孢子)，在pH值为3、温度为36℃、0.4V/V·min的通气条件下进行菌种培养；通过取样显微镜镜检、酸度测定和pH测定对黑曲霉的生长进行观察，27小时之后，当pH在2.0、酸度10g/L、菌球大小均匀、菌丝粗壮伸出时，停止培养。

制备例3

营养液的制备

将60g的尿素溶解在100ml的蒸馏水中用作营养液。

实施例1

本实施例用于说明使用5个串联连接的发酵罐进行柠檬酸发酵的方法。

从第一发酵罐的原料入口向第一发酵罐中流加由制备例1制备的发酵培养基和制备例2制备的发酵菌种种子液，连续流加总体积为12.5×10⁵L的发酵培养基，所述柠檬酸发酵培养基的流加速率为23立方米/小时，所述发酵菌种种子液的流加速率为1.8立方米/小时。12小时之后，从第一发酵罐上部出口流出的发酵液中的柠檬酸酸度为50g/L、还原糖浓度为100g/L，黑曲霉的浓度为4×10⁴个孢子/毫升。

将所述第一发酵罐流出的发酵液依次流经后面的发酵罐(即，发酵液从前一发酵罐的上部出口流出，从后一发酵罐的下部入口流入)，从第二发酵罐上部出口流出的发酵液中的柠檬酸酸度为75g/L、还原糖浓度为74g/L；从第三发酵罐上部出口流出的发酵液中的柠檬酸酸度为101g/L、还原糖浓度为45g/L；从第四发酵罐上部出口流出的发酵液中的柠檬酸酸度为126g/L、还原糖浓度为20g/L；从第五发酵罐上部出口流出的发酵液中的柠檬酸酸度为146g/L、还原糖浓度为0g/L，最终发酵完全的发酵液从第五发酵罐上部的流出口排出，总发酵时间为54小时。

物料的流入和流出达到平衡后，每个罐的装液量为每个发酵罐体积的80％。测定每个罐发酵液中的发酵液的总氮含量和每小时增酸量，从第三发酵罐开始总氮含量小于400mg/L、每小时增酸小于2.6g/L，第三发酵罐的发酵液中总氮含量为380mg/L、每小时增酸为2.5g/L，因此，从第三发酵罐的底部以0.5kg/小时的流加速率流加制备例3制备的营养液(以有效氮源计)，以有效氮源计，每100L发酵液中加入量为20克。使得上述发酵罐的发酵液的总氮含量达到860mg/L，每小时增酸为3.7g/L。

各参数请见表1。

实施例2

本实施例用于说明使用4个串联连接的发酵罐进行柠檬酸发酵的方法。

从第一发酵罐的原料入口向第一发酵罐中流加由制备例1制备的发酵培养基和制备例2制备的发酵菌种种子液，连续流加总体积为10×10⁵L的发酵培养基，所述柠檬酸发酵培养基的流加速率为18立方米/小时，所述发酵菌种种子液的流加速率为1.6立方米/小时。15小时之后，从第一发酵罐上部出口流出的发酵液中的柠檬酸酸度为60g/L、还原糖浓度为90g/L，黑曲霉的浓度为3×10⁴个孢子/毫升。

将所述第一发酵罐流出的发酵液依次流经后面的发酵罐，从第二发酵罐上部出口流出的发酵液中的柠檬酸酸度为85g/L、还原糖浓度为62g/L、从第三发酵罐上部出口流出的发酵液中的柠檬酸酸度为115g/L、还原糖浓度为31g/L；从第四发酵罐上部出口流出的发酵液中的柠檬酸酸度为140g/L、还原糖浓度为2g/L，最终发酵完全的发酵液从第五发酵罐上部的流出口排出，总发酵时间为56小时。

物料的流入和流出达到平衡后，每个罐的装液量为每个发酵罐体积的80％。测定每个罐发酵液中的发酵液的总氮含量和每小时增酸量，从第二发酵罐开始总氮含量小于400mg/L、每小时增酸小于2.6g/L，第三发酵罐的发酵液中总氮含量为350mg/L、每小时增酸为2.5g/L，因此，从第二发酵罐的底部以0.6kg/小时的流加速率流加制备例3制备的营养液(以有效氮源计)。以有效氮源计，每100L发酵液中加入量为30克，使得该发酵罐中发酵液的总氮含量达到800mg/L，每小时增酸为3.5g/L。

各参数请见表1。

实施例3

本实施例用于说明使用3个串联连接的发酵罐进行柠檬酸发酵的方法。

从第一发酵罐的原料入口向第一发酵罐中流加由制备例1制备的发酵培养基和制备例2制备的发酵菌种种子液，连续流加总体积为8×10⁵L的发酵培养基，所述柠檬酸发酵培养基的流加速率为15立方米/小时，所述发酵菌种种子液的流加速率为1.4立方米/小时。20小时之后，第一罐上部出口处的发酵液中的柠檬酸酸度100g/L、还原糖浓度为60g/L，黑曲霉的浓度为2.5×10⁴个孢子/毫升。

将所述第一发酵罐流出的发酵液依次流经后面的发酵罐，从第二发酵罐上部出口流出的发酵液中的柠檬酸酸度为120g/L、还原糖浓度为38g/L、第三发酵罐上部出口流出的发酵液中的柠檬酸酸度为150g/L、还原糖浓度为2g/L；最终发酵完全的发酵液从第三发酵罐上部的流出口排出，总发酵时间为56小时。

物料的流入和流出达到平衡后，每个罐的装液量为每个发酵罐体积的80％。测定每个罐发酵液中的发酵液的总氮含量和每小时增酸量，从第二罐开始总氮含量小于400mg/L、每小时增酸小于2.6g/L，第二发酵罐的发酵液中总氮含量为340mg/L、每小时增酸为2.5g/L，从第二发酵罐的底部以0.7kg/小时流加速率流加制备例3制备的营养液(以有效氮源计)，以有效氮源计，每100L发酵液中加入量为40克。使得该发酵罐中发酵液的总氮含量达到900mg/L，每小时增酸为4.0g/L。

各参数请见表1。

实施例4

本实施例用于说明使用4个串联连接的发酵罐进行柠檬酸发酵的方法。

在第一个发酵罐的原料入口向第一发酵罐中装入2×10⁵L体积的制备例1制备的发酵培养基，并加入2×10⁴L的制备例2的方法得到的发酵菌种种子液，发酵菌种的接种量为3.5×10⁴个孢子/毫升，在表1中的本实施例相应的发酵条件下进行预发酵，当预发酵液中的柠檬酸酸度和还原糖浓度分别达到50g/L和100g/L时，预发酵结束，发酵时间为12小时。

接着从第一发酵罐的原料入口向第一发酵罐中流加制备例1制备的发酵培养基和制备例2制备的发酵菌种种子液，连续流加总体积为10.5×10⁵L的发酵培养基，所述柠檬酸发酵培养基的流加速率为20立方米/小时，所述发酵菌种种子液的流加速率为1.5立方米/小时。14小时之后，从第一发酵罐上部出口流出的发酵液中的柠檬酸酸度80g/L、还原糖浓度为80g/L，黑曲霉的浓度为3.5×10⁴/毫升。

将所述第一发酵罐流出的发酵液依次流经后面的发酵罐，从第二发酵罐上部出口流出的发酵液中的柠檬酸酸度为103g/L、还原糖浓度为55g/L、从第三发酵罐上部出口流出的发酵液中的柠檬酸酸度为130g/L、还原糖浓度为25g/L、从第四发酵罐上部出口流出的发酵液中的柠檬酸酸度为150g/L、还原糖浓度为1g/L，最终发酵完全的发酵液从第四发酵罐上部的流出口排出，总发酵时间为54.5小时。

物料的流入和流出达到平衡后，每个罐的装液量为每个发酵罐体积的80％。测定每个罐发酵液中的发酵液的总氮含量和每小时增酸量，从第三发酵罐开始总氮含量小于400mg/L、每小时增酸小于2.6g/L，第三发酵罐的发酵液中总氮含量为380mg/L、每小时增酸为2.5g/L，因此，从第三发酵罐的底部以0.8kg/小时的流加速率流加制备例3制备的营养液(以有效氮源计)，以有效氮源计，每100L发酵液中加入量为20克。使得上述发酵罐的发酵液的总氮含量达到850mg/L，每小时增酸为3.0g/L。

各参数请见表1。

对比例1

将根据制备例1的方法得到的总体积为12.5×10⁵L的发酵培养基在5个发酵罐中分别等体积的加入，所述培养基中加入15000L的制备例3的方法得到的营养液，使发酵液中的总氮含量达到850mg/L，并在每个发酵罐中接入制备例2的方法制备发酵菌种种子液，发酵液中发酵菌种接种量为30000个孢子/毫升，并按照表1所示的参数条件进行发酵，发酵73小时后，从各个发酵罐的流出口流出的发酵液中柠檬酸酸度139g/L、还原糖浓度为1g/L。

表1

根据表1的结果可以看出，本发明实施例1-4的连续发酵方法与对比例1的现有技术的间歇发酵方法相比，实施例1-4中将8×10⁵-12.5×10⁵L的发酵培养基发酵至柠檬酸的酸度为140-150g/L，且残还原糖含量为0-2g/L，发酵所需的时间为54-56小时；而对比例1中将同等体积相同组分的发酵培养基发酵至柠檬酸的酸度为139g/L，且残还原糖含量为1g/L，发酵所需的时间为73小时，其中包括长达8个小时的辅助时间。

由此可以判断根据本发明的柠檬酸发酵方法，发酵过程中采用发酵培养基和培养成熟的种子液连续流加到发酵罐中，发酵液可以连续地流出，中间并没有间歇时间，因此提高发酵设备的利用效率。此外，在柠檬酸发酵中后期流加一定的营养液来提高柠檬酸发酵强度，提高了发酵中后期柠檬酸菌种代谢能力，从而缩短了生产周期，达到降低柠檬酸发酵成本。

Claims (11)

1.一种柠檬酸的发酵方法，该方法包括在发酵条件下，将柠檬酸发酵菌种接入柠檬酸发酵培养基中，其特征在于，所述发酵分连续的多阶段进行，所述多阶段包括第一发酵阶段和第一发酵阶段以后的发酵阶段，在第一发酵阶段中，向发酵罐中流加柠檬酸发酵培养基以及流加发酵菌种种子液，柠檬酸发酵培养基的流加量以及发酵菌种种子液的流加量使得该阶段的发酵液中的柠檬酸的酸度为50-100g/L，还原糖浓度为60-100g/L，并使第一发酵阶段的发酵液依次连续流入后续阶段的发酵罐中进行发酵，发酵终点的发酵液中柠檬酸的酸度为不小于140g/L，且残还原糖含量为0-4g/L。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述第一发酵阶段中，所述柠檬酸发酵培养基的流加量为10-25立方米/小时；所述发酵菌种种子液的流加量为1-5立方米/小时。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述发酵终点的发酵液中柠檬酸的酸度为140-150g/L，且残还原糖含量为0-2g/L。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在所述第一发酵阶段中，每毫升所述发酵液中的发酵菌种的量为2×10⁴-5×10⁴个孢子。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其中，该方法还包括在所述第一发酵阶段中，将柠檬酸发酵培养基和发酵菌种种子液流加到含有发酵菌种和柠檬酸发酵培养基的发酵液的发酵罐中。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，该方法还包括在第一发酵培养阶段之后以及最后一个发酵培养阶段之间的至少一个发酵阶段的发酵罐中，流加发酵培养所需营养液，所述营养液的流加量使得该阶段的发酵液的总氮含量≥400mg/L，每小时增酸≥2.6g/L。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述营养液的流加量使得该阶段的发酵液中，总氮含量为600-1000mg/L，每小时增酸为2.6-4.0g/L。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其中，以营养液中的氮元素计，所述营养液的流加速率为0.4-0.8kg/小时。

9.根据权利要求6或7所述的方法，其中，所述营养液为含有氮源的溶液；所述氮源选自尿素、硫酸铵、硝酸铵和玉米浆中的一种或多种。

10.根据权利要求1所述的方法，其中，连续发酵阶段为3-5个，在第二个发酵阶段以后的发酵阶段中，后一个发酵阶段中柠檬酸酸度均比前一个发酵阶段中柠檬酸酸度高20-40g/L，且后一个发酵阶段中残还原糖含量均比前一个发酵阶段中残还原糖含量低20-40g/L。

11.根据权利要求1或10所述的方法，其中，在多个发酵阶段中，后一发酵阶段的发酵罐的入口分别与前一发酵阶段的发酵罐的出口相连通，且每个发酵阶段的发酵罐的入口位于发酵罐的下部，出口位于发酵罐的上部；在第一发酵阶段中，从发酵罐的下部流加柠檬酸发酵培养基以及流加发酵菌种种子液，并使第一发酵阶段的发酵液从发酵罐的上部流出而依次连续流入后续阶段的发酵罐中进行发酵。

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