CN104561140A - 一种发酵制备柠檬酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种发酵制备柠檬酸的方法，该方法包括：将柠檬酸发酵菌种接种到发酵培养基中进行发酵以生成柠檬酸，所述发酵过程包括菌种的生长阶段和菌种的产酸阶段，在菌种的生长阶段的发酵温度为30-38℃，在菌种的产酸阶段的发酵温度为32-42℃，且在菌种的生长阶段的发酵温度低于在菌种的产酸阶段的发酵温度。采用上述技术方案来生产柠檬酸，有效地提高了产柠檬酸浓度和发酵转化率，并且缩短了发酵周期、降低了能耗。

Description

一种发酵制备柠檬酸的方法

技术领域

本发明涉及一种发酵制备柠檬酸的方法，具体地，涉及一种在发酵过程中分阶段控制发酵温度的发酵制备柠檬酸的方法。

背景技术

柠檬酸是动植物体内的一种天然成分和生理代谢的中间产物，是第一大类有机酸，广泛应用于食品、医药、化工等行业。柠檬酸及其盐类在食品工业上广泛用作酸味剂、增溶剂、缓冲剂、抗氧化剂、除腥臭剂、螯合剂等；在医药工业上广泛用于补充相应元素；在化学工业中广泛用作缓冲剂、催化剂、激活剂、增塑剂、螯合剂、清洗剂、吸附剂、稳定剂、消泡剂；此外，在印染、原子能工业、石油开采、建筑工业、铸造工业、皮革工业等行业中也有广泛的用途。

现有发酵制备柠檬酸的方法通常为一次投料一次放料的间歇式液体深层二级发酵技术。例如，CN102181490A公开了一种向发酵培养基中通入空气并额外通入CO₂气体辅助发酵的方法；CN102443611A公开了一种在将黑曲霉接种至发酵培养基后的24小时至发酵完成前5小时的时间段内，向发酵液中添加六碳糖进行发酵产酸的方法；CN102409066A公开了一种在柠檬酸的第一发酵阶段中，向发酵罐中流加柠檬酸发酵培养基以及菌种种子液，并保持一定的浓度，并使第一发酵阶段的发酵液依次连续流入后续阶段的发酵罐中进行发酵的方法。

但上述发酵制备柠檬酸的方法，产柠檬酸浓度和发酵转化率均较低，发酵周期长，并且能耗较高。

发明内容

本发明的目的在于克服采用现有技术产柠檬酸浓度和发酵转化率均较低、发酵周期长以及能耗高的缺点，提供一种发酵制备柠檬酸的方法，以提高产柠檬酸浓度和发酵转化率、缩短发酵周期，并降低能耗。

本发明的发明人发现，采用现有技术发酵制备柠檬酸，产柠檬酸浓度和发酵转化率均较低、发酵周期长以及能耗高的原因在于，现有技术在整个发酵过程中均是在相同的温度下进行，或是将发酵温度控制在一定的范围内。或是考虑到虽然较高的温度会促进黑曲霉的生长，但在其主要的产酸阶段，由于温度过高会导致溶氧量的减少，从而会抑制依赖氧气的三羧酸循环，使得中间产物柠檬酸的产量降低，从而将黑曲霉的生长阶段的温度控制在比产酸阶段的温度较高的水平上，以保证前期黑曲霉的大量生长以及后期溶氧量的需求，例如，CN102373242A。

但本发明的发明人却意外地发现，将柠檬酸发酵过程中黑曲霉前期的生长阶段的温度先控制在较低的水平，然后再在后期的产酸阶段将温度控制在较高的水平，这样虽然不能使黑曲霉在发酵前期进行大量生长，但本发明的发明人却惊奇的发现，这种状态下的黑曲霉在进入产酸期后其发酵水平却得到了显著的提高。这主要是：一方面，菌种的快速生长在一定程度上得到了抑制，而会在正常水平上进行生长，使其进入产酸期后更倾向于产酸，从而使得其用于自身生长的营养物质减少，使得用于产酸的营养物质得到了提高，因此，能够提高糖酸转化率；另一方面，在进入大量产酸阶段后适当提高发酵温度，在保证溶氧量的前提下，更有利于用于产酸的酶系统发挥作用，从而使得产酸量增加。

基于以上发现，本发明提供了一种发酵制备柠檬酸的方法，该方法包括，将柠檬酸发酵菌种接种到发酵培养基中进行发酵以生成柠檬酸，所述发酵过程包括菌种生长阶段和菌种产酸阶段，在菌种生长阶段的发酵温度为30-38℃，在菌种产酸阶段的发酵温度为32-42℃，且在菌种生长阶段的发酵温度低于在菌种产酸阶段的发酵温度。

优选地，在菌种生长阶段的发酵温度比在菌种产酸阶段的发酵温度低0.5-5℃。

优选的，所述发酵培养基中还含有外源性碳源、外源性氮源、外源性无机盐和外源性生物素。

采用上述技术方案来生产柠檬酸，有效地提高了产柠檬酸浓度和发酵转化率，并且缩短了发酵周期、降低了能耗。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

本发明提供了一种发酵制备柠檬酸的方法，该方法包括，将柠檬酸发酵菌种接种到发酵培养基中进行发酵以生成柠檬酸，所述发酵过程包括菌种生长阶段和菌种产酸阶段，在菌种生长阶段的发酵温度为30-38℃，在菌种产酸阶段的发酵温度为32-42℃，且在菌种生长阶段的发酵温度低于在菌种产酸阶段的发酵温度。

本发明中，术语“菌种生长阶段”是指将柠檬酸发酵菌种接种至发酵培养基中开始至柠檬酸的生成速率达到2g/L/h时的发酵时间段，“菌种产酸阶段”是指柠檬酸的生成速率大于2g/L/h时至发酵结束时的发酵时间段。根据本发明的发明人的实际经验，当将柠檬酸发酵菌种接种至发酵培养基中开始至发酵12小时时，柠檬酸的生成速率可达到2g/L/h，因此，在实际的操作过程中，还可以以此时间点作为菌种生长阶段和产酸阶段的分界点，对发酵过程中的温度进行如上的分阶段式控制。

根据本发明，将菌种生长阶段的温度先控制在30-38℃，当发酵菌种进入产酸阶段后再将温度控制在32-42℃，同时保证在菌种生长阶段的发酵温度低于菌种产酸阶段的发酵温度。这样在菌种生长阶段可以在一定程度上抑制发酵菌种的快速生长，使其更倾向于向产酸阶段发展，从而使得发酵菌种用于自身生长的营养物质减少，使得糖酸转化率提高。当发酵菌种进入产酸阶段，由于菌种已经进入了生长的稳定期，开始大量合成发酵产物，发酵菌种也难以再向其大量生长的方向发展，此时提高发酵温度有利于三羧酸循环中的各种酶发挥作用，从而，可以提高发酵水平，降低发酵周期。

优选地，当菌种生长阶段的发酵温度为32-36℃，菌种产酸阶段的发酵温度为34-39℃时，更有利于发酵水平的提高，并进一步降低能耗。

本发明的发明人惊奇的发现，当菌种生长阶段的发酵温度比菌种产酸阶段的发酵温度低0.5-5℃，优选2-3.5℃时，在发酵过程中当发酵温度改变时，发酵菌种受发酵温度变化的影响较小，从而能够更快的适应菌种产酸阶段的环境。

根据本发明，对发酵过程中的温度进行控制的方法可以采用本领域公知的任意方法，例如，可以通过电极加热和/或冷却水循环的方法进行控制。

根据本发明，所述柠檬酸发酵菌种的种类不受特别的限制，只要其能够用于柠檬酸的发酵，并产生柠檬酸即可。优选的情况下，所述发酵菌种为黑曲霉，所述黑曲霉为黑曲霉野生菌株和黑曲霉突变株中的一种或多种，所述黑曲霉突变株优选为Co827和Co860（可以在上海工业微生物研究所通过商购得到），以及T01、γ-144和γ-144-131（可以在天津工业微生物研究所通过商购得到）中的一种或多种。

优选地，所述发酵菌种为Co827和T01，本发明发酵所使用的黑曲霉为黑曲霉固体制剂或黑曲霉菌种。

优选情况下，黑曲霉在种子培养基中的接种量为5×10⁴-5×10⁵个孢子/毫升。

所述孢子可以通过本领域公知的方法测定，例如，通过血球计数板计数。

所述黑曲霉可以采用常规的方法接种，例如，在被接种至发酵液中之前，将所述黑曲霉经过种子培养处理，之后将得到的种子液加入到发酵液中。黑曲霉种子培养的程度可以通过取样显微镜镜检、酸度测定和pH测定对黑曲霉的生长进行观察，当pH在2.0-2.5、酸度0.5-2.0%、菌球大小均匀、菌丝粗壮伸出时停止培养。

根据本发明，所述黑曲霉种子的培养条件可以在很大范围内改变，例如所述培养的条件可以包括：培养的温度可以为25-45℃，pH值可以为1-7，通气量可以为0.05-1.0体积：（体积·分钟），压力可以为0-0.1Mpa，培养的时间可以为15-35小时；更优选的情况下，所述培养的条件可以包括：培养的温度可以为30-40℃，pH值可以为2-4，通气量可以为0.1-0.5体积：（体积·分钟），压力可以为0-0.08Mpa，所述培养的时间可以为20-30小时。

根据本发明，对用于培养黑曲霉种子的培养液的制备方法没有特别的限制，只要得到的培养液能够适用于黑曲霉的培养即可。

根据本发明，对发酵培养基的成分没有特别的要求，只要可以用于柠檬酸发酵的发酵培养基即可。优选地，所述发酵培养基含有淀粉质原料酶解产物。一般地，淀粉质原料酶解得到液化液，液化液经过固液分离得到淀粉质原料酶解残渣和淀粉质原料酶解清液，通常可以将淀粉质原料酶解清液用于制备发酵培养基，也可以将淀粉质原料酶解清液与淀粉质原料酶解残渣混合后用于制备发酵培养基，还可以将淀粉质原料酶解清液与液化液混合后用于制备发酵培养基。本发明所述淀粉质原料酶解产物优选由淀粉质原料酶解残渣和淀粉质原料酶解清液与水混合或不与水混合得到，且进一步优选相对于100重量份的淀粉质原料酶解清液，淀粉质原料酶解残渣的含量为0.5-2重量份。

根据本发明，所述淀粉质原料酶解清液可以通过多种方法制备得到，例如，可以通过如下方法制备得到：将淀粉质原料粉碎，将粉碎后的产物进行酶解，得到酶解产物，将酶解产物固液分离，得到淀粉质原料酶解液化清液和淀粉质原料酶解残渣，所述固液分离的条件使淀粉质原料酶解残渣的固含量为5-60重量%，更优选为30-50重量%。

根据本发明，所述淀粉质原料可以为本领公知的各种可以用于酶解、发酵制备柠檬酸的含有淀粉的原料，例如，可以选自玉米、薯类（如木薯）和小麦中的一种或几种，优选情况下，所述淀粉质原料为玉米。

所述酶解步骤可以通过本领域常用的方法完成，比如向粉碎产物中添加产酶微生物和/或酶，在产酶微生物的生长温度和/或酶有活力的温度下保温完成。所述产酶微生物为能够分泌淀粉酶的产酶微生物。所述酶包括淀粉酶。

由于微生物生长会产生副产物，因此优选直接加入酶。所述酶的用量越多越好，出于成本考虑，优选以每克粉碎后的粉碎产物的干重计，所述淀粉酶的用量为15-50个酶活力单位。

本发明所述酶的酶活力单位的定义为：在pH值为6.0、温度为70℃的条件下，1分钟将1毫克淀粉转化为还原糖所需的酶量为一个酶活力单位。

所述酶解的温度可以在很大范围内改变，优选为70-105℃，更优选为80-95℃。所述酶解的时间理论上越长越好，考虑到设备利用率，优选所述酶解的时间为90-150分钟，更优选为100-120分钟。所述酶解的pH值可以在很大范围内改变，优选为5.0-6.0，更优选pH值为5.4-5.7。

淀粉酶是指能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，其具体选择为本领域技术人员所公知，例如，所述淀粉酶一般包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶。

α-淀粉酶又称淀粉1,4-糊精酶，它能够任意地、不规则地切开淀粉链内部的α-1,4-糖苷键，将淀粉水解为麦芽糖、含有6个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖。生产此酶的微生物主要有枯草杆菌、黑曲霉、米曲霉和根霉。

β-淀粉酶又称淀粉1,4-麦芽糖苷酶，能够从淀粉分子非还原性末端切开1,4-糖苷键，生成麦芽糖。此酶作用于淀粉的产物是麦芽糖与极限糊精。此酶主要由曲霉、根霉和内孢霉产生。

糖化酶又称淀粉α-1,4-葡萄糖苷酶，此酶作用于淀粉分子的非还原性末端，以葡萄糖为单位，依次作用于淀粉分子中的α-1,4-糖苷键，生成葡萄糖。糖化酶作用于支链淀粉后的产物有葡萄糖和带有α-1,6-糖苷键的寡糖；作用于直链淀粉后的产物几乎全部是葡萄糖。此酶产生菌主要是黑曲霉（左美曲霉、泡盛曲霉）、根霉（雪白根酶、德氏根霉）、拟内孢霉、红曲霉。

异淀粉酶又称淀粉α-1,6-葡萄糖苷酶、分枝酶，此酶作用于枝链淀粉分子分枝点处的α-1,6-糖苷键，将枝链淀粉的整个侧链切下变成直链淀粉。此酶产生菌主要是嫌气杆菌、芽孢杆菌及某些假单孢杆菌等细菌。

根据本发明，优选使用α-淀粉酶和/或异淀粉酶。

根据本发明，为了进一步提高发酵水平，本发明的发酵培养基中还含有外源性碳源、外源性氮源、外源性无机盐和外源性生物素。其中，外源性碳源、外源性氮源、外源性无机盐和外源性生物素的含量不受特别的限制，本领域技术人员可以根据实际的发酵情况进行调整，一般情况下，相对于100重量份的淀粉质原料酶解清液，所述外源性碳源的含量可以为0.01-0.1重量份、所述外源性氮源的含量可以为0.01-0.1重量份、所述外源性无机盐的含量可以为0.01-0.1重量份、所述外源性生物素的含量可以为0.1×10^-4-1×10^-4重量份。

其中，对以上各物质的具体种类没有特别的限制，只要添加的物质能够为发酵培养基提供以上营养成分即可。例如，以上各物质的非限制性实例包括：所述外源性碳源可以由甜菜糖蜜、甘蔗糖蜜和玉米浆中的一种或多种提供；所述外源性氮源可以由尿素、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、硝酸铵、液氨、氨水、玉米浆、谷氨酸、苏氨酸和蛋氨酸中的一种或多种提供，考虑到成本问题，所述外源性氮源优选由尿素、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、硝酸铵、液氨、氨水和玉米浆中的一种或多种提供；所述外源性无机盐由磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锰、氯化钾和氯化钠中的一种或多种提供。

其中，所述生物素为维生素B群之一，又称维生素H、维生素B7、辅酶R（Coenzyme R）等，是噻吩与尿素相结合的骈环化合物。

根据本发明，将柠檬酸发酵菌种接种至发酵培养基中进行发酵的条件除将发酵的温度按照本发明如上的分阶段式控制外，其它条件可以为本领域常规的用于柠檬酸发酵的条件，例如，所发酵的条件可以包括：通气量为0.1-1体积：（体积·分钟），优选为0.3-1.0体积：（体积·分钟）；压力为0.01-0.1MPa，优选为0.03-0.06MPa；搅拌速度为50-100rpm，优选为70-90rpm。

术语“通气量”一般以通气比来表示，通常以每分钟内通过单位体积培养液的空气体积比来表示V／（V·min），例如通气比为1:0.1-1，简称通气量为0.1-1体积：（体积·分钟）。

根据本发明，发酵终点的判断标准为当发酵液中还原糖的检测量达到0.6g/100mL以下，优选为0时，确定为发酵终点，停止发酵。其中，发酵液中还原糖的测定方法为本领域技术人员所公知，例如，可以使用费林法对发酵液中的还原糖的浓度进行测定。

所述培养的设备为本领域技术人员所公知，例如，种子培养可以在种子罐中进行，发酵培养可以在发酵罐中进行。

按照本发明的方法制备得到的发酵产物柠檬酸可以用常规的方法，根据不同工业产品的要求分离并精制，比如中和、酸解、脱色、浓缩、结晶、包装。

下面根据制备例、实施例和对比例详细说明本发明提供的发酵制备柠檬酸的方法。

将柠檬酸发酵菌种接种至发酵培养基中开始至发酵12小时定义为菌种生长阶段，12小时以后至发酵结束时定义为菌种产酸阶段。

柠檬酸产量：发酵终点时发酵液中含有的柠檬酸溶液精制后得到的柠檬酸晶体的质量。

发酵转化率：（柠檬酸产量/总糖的重量）×100%。其中，总糖的重量包括接入种子中糖的重量和发酵罐用糖重量。

发酵过程中发酵液中还原糖的浓度，以及种子液中糖的初始浓度和发酵罐中糖的初始浓度均使用菲林试剂法测定。

根据GB1987-2007标准检测发酵过程中、发酵终点时柠檬酸溶液的浓度。

制备例1

发酵培养基的制备

1）原料的粉碎：将收获的玉米在热水槽润焖，直至玉米的含水量为15重量%，然后通过粉碎机（江苏牧羊集团有限公司，968-3型）进行粉碎，得到淀粉质原料粉碎产物（粉碎颗粒中50重量%的颗粒直径小于0.1cm）；

2）调浆：用水与淀粉质原料混合进行调浆得到淀粉浆液，所述淀粉质原料与水的重量比为7：3，淀粉浆液的pH值为5.8。

3）酶解：在2）得到的淀粉浆液与淀粉酶（诺维信公司，α-淀粉酶，本发明实施例中均为此淀粉酶）混合，在90℃、pH为5.5的条件下进行酶解100分钟，相对于每克粉碎后的产物，淀粉酶的用量为40个酶活力单位，得到酶解产物。

4）过滤：将3）得到的酶解产物通过用液压式板框压滤机进行压滤，分离出酶解清液和酶解残渣。

5）配制发酵培养基1：将200m³的酶解清液和4m³的酶解残渣混合后加入到发酵罐中，并添加20kg的甜菜糖蜜、200kg重量比为1：2的玉米浆和尿素、60kg重量比为1:1的磷酸氢二钾和氯化钠，以及20g的生物素，90℃灭菌30min，灭菌后得到发酵培养基，所述发酵培养基中糖含量为14.9重量%。

6）配制发酵培养基2：将200m³的酶解清液和1m³的酶解残渣混合后加入到发酵罐中，并添加120kg的甜菜糖蜜、20kg重量比为1:1的硫酸铵和玉米浆、20kg的硫酸镁，以及200g的生物素，90℃灭菌30min，灭菌后得到发酵培养基，所述发酵培养基中糖含量为14重量%。

7)配制发酵培养基3：将200m³的酶解清液和3m³的酶解残渣混合后加入到发酵罐中，添加200kg的甘蔗糖蜜、90kg重量比为1：1：1的氨水、硫酸铵和氯化铵，以及200kg的磷酸二氢钾，以及80g的生物素，90℃灭菌30min，灭菌后得到发酵培养基，所述发酵培养基中糖含量为15重量%。

8)配制发酵培养基4：将200m³的酶解清液和4m³的酶解残渣混合后加入到发酵罐中，并添加65kg的甜菜糖蜜，90℃灭菌30min，灭菌后得到发酵培养基，所述发酵培养基中糖含量为15重量%。

其中，步骤5）-8）中所述发酵培养基中的糖含量均为以菲林试剂法测定的葡萄糖计的单糖的含量。

制备例2

发酵菌种种子液的制备

将制备例1的步骤3）中的部分酶解产物加水稀释至糖含量为10%（重量比），得到培养液，将培养液投入种子罐，加热到121℃灭菌20分钟，之后快速降温至37℃，接入黑曲霉菌种（黑曲霉T01，天津工业微生物研究所，本发明实施例中均为此黑曲霉菌种，接种量为：每克培养液为基准，接种3×10⁵个孢子），在pH值为6、温度为35-37℃、0.4V／（V·min）的通气条件下进行菌种培养；通过取样显微镜镜检、酸度测定和pH测定对黑曲霉的生长进行观察，27小时之后，当pH在2.0、酸度1.0%、菌球大小均匀、菌丝粗壮伸出时，停止培养。

实施例1

本实施例用于说明本发明提供的发酵制备柠檬酸的方法。

将制备例2中培养的黑曲霉种子液加入到制备例1中的发酵培养基1中开始发酵，其中，以每毫升发酵培养基计，黑曲霉的接种量为2.5×10⁵个孢子，发酵条件包括：菌种生长阶段的发酵温度为36℃，菌种产酸阶段的发酵温度为39℃，整个发酵过程中的压力为0.06MPa，通气量为0.3体积：（体积·分钟），搅拌转速为90rpm。

当发酵液中还原糖的浓度为0时停止发酵，测定发酵液的产酸浓度，并记录发酵周期，结果如表1所示。

通过过滤、中和、酸解、脱色、离交、浓缩、结晶、包装等过程精制发酵终点发酵罐中得到的柠檬酸溶液，得柠檬酸晶体，记录柠檬酸的产量并计算发酵转换率，结果如表1所示。

实施例2

本实施例用于说明本发明提供的发酵制备柠檬酸的方法。

将制备例2中培养的黑曲霉种子液加入到制备例1中的发酵培养基2中开始发酵，其中，以每克发酵培养基计，黑曲霉的接种量为5×10⁴个孢子，发酵条件包括：菌种生长阶段的发酵温度为32℃，菌种产酸阶段的发酵温度为34℃，整个发酵过程中的压力为0.03Mpa，通气量为1.0体积：（体积·分钟），搅拌转速为70rpm。

当发酵液中还原糖的浓度为0时停止发酵，测定发酵液的产酸浓度，并记录发酵周期，结果如表1所示。

通过过滤、中和、酸解、脱色、离交、浓缩、结晶、包装等过程精制发酵终点发酵罐中得到的柠檬酸溶液，得柠檬酸晶体，记录柠檬酸的产量并计算发酵转换率，结果如表1所示。

实施例3

本实施例用于说明本发明提供的发酵制备柠檬酸的方法。

将制备例2中培养的黑曲霉种子液加入到制备例1中的发酵培养基3中开始发酵，其中，以每克发酵培养基计，黑曲霉的接种量为3.5×10⁴个孢子，发酵条件包括：菌种生长阶段的发酵温度为34.5℃，菌种产酸阶段的发酵温度为38℃，整个发酵过程中的压力为0.06Mpa，通气量为0.6体积：（体积·分钟），搅拌转速为80rpm。

当发酵液中还原糖的浓度为0时停止发酵，测定发酵液的产酸浓度，并记录发酵周期，结果如表1所示。

通过过滤、中和、酸解、脱色、离交、浓缩、结晶、包装等过程精制发酵终点发酵罐中得到的柠檬酸溶液，得柠檬酸晶体，记录柠檬酸的产量并计算发酵转换率，结果如表1所示。

实施例4

本实施例用于说明本发明提供的发酵制备柠檬酸的方法。

采用实施例3的方法进行柠檬酸的发酵，不同的是，菌种产酸阶段的发酵温度为35℃。产酸浓度、发酵周期以及发酵转换率如表1所示。

实施例5

本实施例用于说明本发明提供的发酵制备柠檬酸的方法。

采用实施例3的方法进行柠檬酸的发酵，不同的是，菌种生长阶段的发酵温度为38℃，产酸阶段的发酵温度为42℃。产酸浓度、发酵周期以及发酵转换率如表1所示。

实施例6

本实施例用于说明本发明提供的发酵制备柠檬酸的方法。

采用实施例3的方法进行柠檬酸的发酵，不同的是，菌种生长阶段的发酵温度为30℃，产酸阶段的发酵温度为35℃。产酸浓度、发酵周期以及发酵转换率如表1所示。

实施例7

本实施例用于说明本发明提供的发酵制备柠檬酸的方法。

采用实施例3的方法进行柠檬酸的发酵，不同的是，所使用的发酵培养基为制备例1中制备的发酵培养基4。产酸浓度、发酵周期以及发酵转换率如表1所示。

对比例1

本对比例用于说明现有技术提供的发酵柠檬酸制备的方法。

采用实施例3的方法进行柠檬酸的发酵，不同的是，不采用分段式控制发酵温度，而是整个发酵过程控制温度为37℃。产酸浓度、发酵周期以及发酵转换率如表1所示。

表1

实施例/对比例编号	产酸浓度（g/100mL）	发酵周期（h）	转化率（%）
				实施例1	14.9	64	95.8
实施例2	15.1	65	95.5
				实施例3	15.4	62	96.4
实施例4	13.7	67	95.7
				实施例5	14.6	68	95.0
实施例6	14.4	67	95.1
				实施例7	14.8	66	95.2
对比例1	13.6	73	93.2

从上表1的数据可以看出，与对比例1相比，实施例1-7采用本发明提供的柠檬酸的制备方法，在发酵过程中分段式控制发酵温度，有效地提高了柠檬酸的产酸浓度、发酵转换率，并且有效地缩短了发酵周期；实施例3与实施例4-6相比，将菌种生长阶段和产酸阶段的温度以及温差控制在本发明优选的范围内，能够进一步提高柠檬酸的发酵水平。并且将实施例3与实施例7进行比较可以看出，在发酵培养基中适当的添加外源性碳源、外源性氮源、外源性无机盐和外源性生物素，能够有效的提高发酵水平。

另外，实施例1-7采用分段式控制发酵温度的发酵方法，可以有效缩短发酵周期，提高设备利用效率，降低发酵过程中的电力和动力等能源消耗；此外，发酵产酸阶段采用较高的发酵温度，可以节省高温物料降温所需的循环冷却水，也起到降低电力和动力能耗的作用。

因此，采用本发明的分段式控制发酵温度制备柠檬酸的方法能够有效的提高柠檬酸的发酵水平，并降低能耗。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (10)

1.一种发酵制备柠檬酸的方法，该方法包括：将柠檬酸发酵菌种接种到发酵培养基中进行发酵以生成柠檬酸，所述发酵过程包括菌种生长阶段和菌种产酸阶段，在菌种生长阶段的发酵温度为30-38℃，在菌种产酸阶段的发酵温度为32-42℃，且在菌种生长阶段的发酵温度低于在菌种产酸阶段的发酵温度。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，在菌种生长阶段的发酵温度为32-36℃，在菌种产酸阶段的发酵温度为34-39℃。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在菌种生长阶段的发酵温度比在菌种产酸阶段的发酵温度低0.5-5℃。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，在菌种生长阶段的发酵温度比在菌种产酸阶段的发酵温度低2-3.5℃。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述菌种生长阶段是指将柠檬酸发酵菌种接种至发酵培养基中开始至柠檬酸的生成速率达到2g/L/h时的发酵时间段，所述菌种产酸阶段是指柠檬酸的生成速率大于2g/L/h时至发酵结束时的发酵时间段。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述发酵菌种为黑曲霉，所述黑曲霉为黑曲霉野生菌株和黑曲霉突变株中的一种或多种，所述黑曲霉突变株为Co827、Co860、T01、γ-144和γ-144-131中的一种或多种。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，以每毫升发酵培养基为基准，所述发酵菌种的接种量为3.5×10⁴-2.5×10⁵个孢子；所述发酵培养的条件包括：通气量为0.1-1体积：（体积·分钟），压力为0.01-0.1MPa。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述发酵培养基含有淀粉质原料酶解清液和淀粉质原料酶解残渣，相对于100重量份的淀粉质原料酶解清液，淀粉质原料酶解残渣的含量为0.5-2重量份；淀粉质原料经酶解并固液分离后得到的上清液为所述淀粉质原料酶解清液，得到的固体残渣为所述淀粉质原料酶解残渣。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述发酵培养基还含有外源性碳源、外源性氮源、外源性无机盐和外源性生物素；相对于100重量份的淀粉质原料酶解清液，所述外源性碳源的含量为0.01-0.1重量份、所述外源性氮源的含量为0.01-0.1重量份、所述外源性无机盐的含量为0.01-0.1重量份、所述外源性生物素的含量为0.1×10^-4-1×10^-4重量份。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述外源性碳源由甜菜糖蜜、甘蔗糖蜜和玉米浆中的一种或多种提供；所述外源性氮源由尿素、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、硝酸铵、液氨、氨水、玉米浆、谷氨酸、苏氨酸和蛋氨酸中的一种或多种提供；所述外源性无机盐由磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锰、氯化钾和氯化钠中的一种或多种提供。