CN103146769B - 一种发酵制备柠檬酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种发酵制备柠檬酸的方法，该方法包括，在能够生成柠檬酸的条件下，将黑曲霉接种到发酵培养基中进行发酵，其中，将发酵过程中产生的柠檬酸进行分离，并使得在发酵过程中以及发酵终点发酵液中柠檬酸的浓度不高于13.5重量%。本发明优选通过采用阴离子交换吸附法对发酵过程中产生的柠檬酸进行分离，有效地提高了柠檬酸的产量、发酵强度和发酵转化率，同时缩短了发酵周期。

Description

一种发酵制备柠檬酸的方法

技术领域

本发明涉及一种发酵制备柠檬酸的方法。

背景技术

柠檬酸是有机酸中第一大酸，由于物理、化学等方面的优异性能，广泛应用于医药、化学、电子、纺织、石油、皮革、建筑、摄影、塑料、铸造和陶瓷等工业领域。

目前柠檬酸发酵行业采取的发酵技术通常为一次投料一次放料的间歇式液体深层二级发酵技术。其发酵过程为：将淀粉质原料酶解制备种子培养基和发酵培养基；在种子罐中接入黑曲霉，扩大培养后转接种到发酵罐中进行发酵生产柠檬酸，发酵停止后发酵液经板框分离出菌体残渣和发酵清液，发酵清液进入后续工序提取柠檬酸，菌体残渣进入饲料烘干工序。

但采用现有技术生产柠檬酸，柠檬酸的产量、发酵强度和发酵转化率均较低，并且发酵周期长。

发明内容

本发明的目的在于克服采用现有技术生产的柠檬酸产量低、发酵强度低、发酵转化率低以及发酵周期长的缺点，提供一种发酵制备柠檬酸的方法，以提高柠檬酸的产量、发酵强度、发酵转化率以及缩短发酵周期。

本发明的发明人发现，采用现有技术生产的柠檬酸产量低、发酵强度低、发酵转化率低以及发酵周期长的一个重要原因是：随着发酵的进行，发酵液中柠檬酸的浓度会越来越高，由于现有黑曲霉种子的耐酸能力在13.5重量%左右，所以当柠檬酸的浓度达到13.5重量%左右时，将会对菌体的活性产生严重地抑制作用，使菌体耗糖和产酸速率均下降，从而会影响柠檬酸的合成，最终影响柠檬酸的产量、发酵强度、发酵转化率以及延长发酵周期。

因此，为了解决上述问题，本发明提供了一种发酵制备柠檬酸的方法，该方法包括，在生成柠檬酸的条件下，将黑曲霉接种到发酵培养基中进行发酵，其中，将发酵过程中产生的柠檬酸进行分离，并使得在发酵过程中以及发酵终点发酵液中柠檬酸的浓度不高于13.5重量%。

优选地，将发酵过程中产生的柠檬酸进行分离，并使得在发酵过程中以及发酵终点发酵液中柠檬酸的浓度不高于12重量%。

采用上述技术方案来生产柠檬酸，实现了对发酵液中柠檬酸浓度的控制，有效地提高了柠檬酸的产量、发酵强度、发酵转化率以及缩短了发酵周期。例如，以实施例3和对比例1为例，在其他生产条件相同的情况下对比，柠檬酸的产量由原来的34.75吨提高到了35.27吨，发酵强度由原来的2.21Kg/m³·h提高到了2.82Kg/m³·h，发酵转化率由原来的95.2%提高到了96.4%，同时发酵周期由原来的63小时短短到了50小时。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

根据本发明，提供了一种发酵制备柠檬酸的方法，该方法包括在生成柠檬酸的条件下，将黑曲霉接种到发酵培养基中进行发酵，其中，将发酵过程中产生的柠檬酸进行分离，并使得在发酵过程中以及发酵终点发酵液中柠檬酸的浓度不高于13.5重量%。

本发明的发明人发现，随着发酵的进行，发酵液中柠檬酸的浓度会越来越高，由于现有黑曲霉种子的耐酸能力在13.5重量%左右，所以当柠檬酸的浓度达到13.5重量%左右时，将对菌体的活性产生严重地抑制作用，使菌体耗糖和产酸速率均下降，最终影响发酵效率。所以，将发酵过程中产生的柠檬酸进行分离并保证发酵液中柠檬酸的浓度处于一定范围内是提高发酵效率的关键。

根据本发明，在发酵过程中，为了使黑曲霉的活性发挥最大的作用，所以，要对发酵过程中产生的柠檬酸进行分离，所述分离的方式可以是间歇性地，也可以是连续性地，只要使得在发酵过程中以及发酵终点发酵液中柠檬酸的浓度不高于13.5重量%即可，优选情况下，为了进一步增加黑曲霉的活性，使得在发酵过程中以及发酵终点发酵液中柠檬酸的浓度不高于12重量%。

优选地，采用连续性的方式对发酵过程中产生的柠檬酸进行分离。

根据本发明，一般情况下，在发酵过程中柠檬酸生成速度的规律为：将黑曲霉接种到发酵培养基后的最初几小时，黑曲霉处于调整期，此阶段内几乎不产酸；调整期结束后黑曲霉进入对数期，此阶段内产酸量迅速增加；对数期结束后黑曲霉进入稳定期，此阶段内产酸量达到最大且比较稳定；最后黑曲霉进入衰亡期，产酸量呈下降趋势。由此可见在整个发酵过程中，黑曲霉的产酸速度呈现一个动态变化的过程，因此，为了使得在发酵过程中以及发酵终点发酵液中柠檬酸的浓度不会波动太大并使其维持在本发明的范围内，以及缩短发酵周期，并综合考虑发酵液的pH值以及柠檬酸的分离速度，开始将发酵液中的柠檬酸进行分离的时机为：发酵液中的柠檬酸浓度优选为2-10重量%，更优选为4-8重量%，并优选使得发酵液中柠檬酸的浓度维持在开始分离柠檬酸时的浓度至不高于13.5重量%，优选不高于12重量%的范围内。

根据本发明，在发酵过程中将发酵液中的柠檬酸进行分离的方法没有特别的限制，例如，可以选自阴离子交换吸附法、钙盐法、萃取法、电渗析法和超滤膜法中一种或多种。为了不影响发酵的正常进行又能够有效、稳定地分离柠檬酸，优选情况下，在发酵过程中将发酵液中的柠檬酸进行分离的方法为阴离子交换吸附法，具体的：将发酵液引入填充有阴离子交换树脂的树脂柱中，进行离子交换，使发酵液中的柠檬酸吸附到所述阴离子交换树脂上，并将分离柠檬酸后的液体返回发酵液中。

按照本发明一种优选的实施方式，将填充有阴离子交换树脂的树脂柱的上部入口和下部出口分别与容纳发酵液的发酵罐连通。优选地，为了防止在分离柠檬酸时，引出的发酵液中的菌体和残渣进入填充有阴离子交换树脂的树脂柱中，在所述树脂柱的入口与发酵罐连通的管道上设置过滤装置，如过滤膜，以在将发酵液引入树脂柱前过滤其中的菌体和残渣；为了顺利地将发酵液引入填充有阴离子交换树脂的树脂柱中，优选在树脂柱下部出口与发酵罐连通的管道上设置离心泵，以将发酵液由发酵罐中引入树脂柱中；为了更好地控制将发酵液引入填充有阴离子交换树脂的树脂柱中的流速，优选分别在树脂柱上部入口和下部出口与发酵罐连通管道上设置阀门。对柠檬酸进行分离时，首先将树脂柱上部入口和下部出口处的阀门打开，并开启离心泵，在离心泵的作用下，将发酵罐中的发酵液引出并经过滤膜以除去菌体和残渣，并将经过过滤的发酵清液从树脂柱的上部入口引入填充有阴离子交换树脂的树脂柱中，所述发酵清液中的柠檬酸与树脂柱中填充的阴离子交换树脂中的离子交换基团进行离子交换，并吸附在树脂上完成柠檬酸的分离，分离柠檬酸后的液体经树脂柱下部出口引出并通过离心泵回到发酵罐中继续发酵，并依次循环（连续或间歇）直至发酵终点。其中，所述过滤膜可以选用本领域常规的生物滤膜，只要可有效地防止发酵液中的菌体和残渣进入树脂柱即可，例如，可以选用孔径为0.2μm的生物滤膜（北京海成世洁过滤器材公司的PTFE滤膜）。

根据本发明，填充有阴离子交换树脂的树脂柱的数量以及与发酵罐连通的方式没有特别限定，根据实际待分离的柠檬酸的量而定，所述树脂柱可以为一根，也可以为多根，可以为并联连接也可以为串联连接，只要能将发酵液中的柠檬酸进行有效地分离，并使得柠檬酸的浓度维持在本发明优选的范围内即可。

根据本发明，所述阴离子交换树脂可以为本领域技术人员所公知的各种阴离子交换树脂。可以为强碱型阴离子交换树脂和弱碱型阴离子交换树脂中的一种或多种。所述强碱型阴离子交换树脂具有的交换离子的离子交换基团选自-NR₃OH，其中，R可以为-CH₃、-CH₂CH₃或-CH₂CH₂CH₃；所述弱碱型阴离子交换树脂具有的交换离子的离子交换基团自NH₂、-NHR和-NR₂中的一种或多种，其中，R可以为-CH₃、-CH₂CH₃或-CH₂CH₂CH₃；所述阴离子交换树脂的工作交换容量大于1毫摩尔/克干树脂，优选为3-5毫摩尔/克干树脂。优选情况下，所述强碱型阴离子交换树脂选自苯乙烯系阴离子交换树脂和丙烯酸系阴离子交换树脂中的一种或多种；所述弱碱型阴离子交换树脂选自苯乙烯系阴离子交换树脂和丙烯酸系阴离子交换树脂中的一种或多种；更优选情况下，所述阴离子交换树脂为弱碱大孔苯乙烯阴离子交换树脂和/或弱碱大孔丙烯酸系阴离子交换树脂。通常情况下，可选自下表1中所示阴离子交换树脂中的至少一种。优选情况下，为了更好地吸附发酵液中的柠檬酸和便于柠檬酸的洗脱以及树脂的再生，选用SQD816阴离子交换树脂树脂（江苏苏青水处理工程集团有限公司）。

本发明中，所述工作交换容量是指根据DL/T772-2001规定的工作条件和测试方法测定的单位体积的离子交换树脂所含有的离子交换基团的摩尔数。

表1

产品牌号	名称	类型
			D311	丙烯酸	大孔弱碱
D313	丙烯酸	大孔弱碱
			709	苯乙烯	大孔弱碱
710	苯乙烯	大孔弱碱
			700	苯乙烯	大孔弱碱
707	苯乙烯	大孔弱碱
			708	苯乙烯	大孔弱碱
704（311×2）	苯乙烯	弱碱
			D390	苯乙烯	大孔弱碱
D301	苯乙烯	大孔弱碱
			D396	苯乙烯	大孔弱碱
D290	苯乙烯	大孔强碱
			D296	苯乙烯	大孔强碱
SQD816	苯乙烯	大孔强碱
			24TD816	苯乙烯	大孔强碱

根据本发明，所述阴离子交换树脂的用量和阴离子交换的条件可选范围较宽，只要使得所述阴离子交换树脂与柠檬酸进行离子交换吸附后发酵液中柠檬酸的浓度维持在本发明的范围内即可。其中，将所述发酵液引入填充有所述阴离子交换树脂的树脂柱中的流速可以根据实际情况进行调节，例如，根据通过每隔一段时间对发酵液中柠檬酸的浓度进行检测得到的数据进行调整，所述检测的时间间隔可以为2-6小时。优选情况下，将所述发酵液引入填充有所述阴离子交换树脂的树脂柱中的流速为0.1-2倍树脂体积/小时；更优选为1-1.5倍树脂体积/小时。具体地，所述阴离子交换树脂的用量也可以根据柠檬酸溶液的体积来选择。优选情况下，所述阴离子交换树脂的体积与所述柠檬酸溶液的体积的比为1:5-15；更优选为1:7-12。优选情况下，离子交换的条件为：温度为30-45℃，更优选为35-39℃。其中，所述柠檬酸溶液的浓度可以采用本领域技术人员公知的方法进行检测，例如，根据GB1987-2007标准检测所得柠檬酸溶液的浓度。

根据本发明，所述发酵制备柠檬酸的方法还进一步包括收集经分离的柠檬酸，所述收集方法包括：发酵结束后用洗脱剂将已吸附到所述阴离子交换树脂上的柠檬酸进行洗脱，得到柠檬酸洗脱液。

根据本发明，所述洗脱剂的选择和洗脱条件的可选范围较宽，只要能将吸附到所述阴离子交换树脂上的柠檬酸洗脱下来即可，优选情况下，所述洗脱剂选自水和/或氢氧化钠溶液，洗脱的条件为：温度为30-80℃；更优选的情况下，选择水作为洗脱剂，洗脱的条件为：温度为70-80℃。洗脱的时间只要能够将柠檬酸充分洗脱即可，例如，当从树脂柱下方流出的洗脱液中柠檬酸的浓度小于1重量%时即可以认为洗脱充分。

根据本发明，将洗脱柠檬酸后的树脂进行再生的方法为本领域技术人员所公知，例如使用水作为洗脱剂时，当洗脱充分后用1-2倍树脂体积的3.5-5重量%的氢氧化钠以2-4倍树脂体积/小时的流速流过树脂，然后用除离子水同样以2-4倍树脂体积/小时的流速流过树脂，当流出液pH低于9以下即可认为再生完毕。将树脂柱中的水排空备用。

根据本发明，按照本发明的方法制备得到的柠檬酸洗脱液可以用常规的方法，根据不同工业产品的要求进行精制，比如水为洗脱剂时，洗脱液直接进入浓缩装置浓缩至柠檬酸含量为42%（重量比）时，进入结晶装置得到柠檬酸晶体，并烘干得到柠檬酸产品。

根据本发明，发酵终点的判断标准为当发酵液中还原糖的检测量达到0.6g/100mL以下时，确定为发酵终点，停止发酵。其中，发酵液中还原糖的测定方法为本领域技术人员所公知，例如，可以使用费林法对发酵液中的还原糖的浓度进行测定。

根据本发明，对发酵培养基的成分没有特别的要求，只要可以用于柠檬酸发酵的发酵培养基即可。优选地，所述发酵培养基含有淀粉质原料酶解产物氮源含量为0.06-0.14重量%，磷源含量为0.005-0.07重量%；所述发酵液的总糖含量为10-20重量%。一般地，淀粉质原料酶解得到液化液，液化液经过分离得到淀粉质原料酶解残渣和淀粉质原料酶解液化清液，通常可以将淀粉质原料酶解液化清液用于制备发酵培养基，也可以将淀粉质原料酶解液化清液与淀粉质原料酶解残渣混合后用于制备发酵培养基，还可以将淀粉质原料酶解液化清液与液化液混合后用于制备发酵培养基。本发明所述淀粉质原料酶解产物优选由液化液和淀粉质原料酶解液化清液与水混合或不与水混合得到，且进一步优选以所述发酵培养基的总重量为100重量份为基准，所述淀粉质原料酶解液化清液的用量为80-95重量份，所述液化液的用量为0.5-10重量份，水的用量为0-15重量份。

根据本发明，所述淀粉质原料酶解液化清液可以通过多种方法制备得到，例如，可以通过如下方法制备得到：将淀粉质原料粉碎，将粉碎后的产物进行酶解，得到酶解产物，将酶解产物固液分离，得到淀粉质原料酶解液化清液和淀粉质原料酶解残渣，所述固液分离的条件使淀粉质原料酶解残渣的固含量为5-60重量%，更优选为30-50重量%。

根据本发明，所述淀粉质原料可以为本领公知的各种可以用于酶解、发酵制备柠檬酸的含有淀粉的原料，例如，可以选自玉米、薯类（如木薯）和小麦中的一种或几种，优选情况下，所述淀粉质原料为玉米。

所述酶解步骤可以通过本领域常用的方法完成，比如向粉碎产物中添加产酶微生物和/或酶，在产酶微生物的生长温度和/或酶有活力的温度下保温完成。所述产酶微生物为能够分泌淀粉酶的产酶微生物。所述酶包括淀粉酶。

由于微生物生长会产生副产物，因此优选直接加入酶。所述酶的用量越多越好，出于成本考虑，优选以每克粉碎后的粉碎产物的干重计，所述淀粉酶的用量为15-50个酶活力单位。

本发明所述酶的酶活力单位的定义为：在pH值为6.0、温度为70℃的条件下，1分钟将1毫克淀粉转化为还原糖所需的酶量为一个酶活力单位。

所述酶解的温度可以在很大范围内改变，优选为70-105℃，更优选为80-95℃。所述酶解的时间理论上越长越好，考虑到设备利用率，优选所述酶解的时间为90-150分钟，更优选为100-120分钟。所述酶解的pH值可以在很大范围内改变，优选为5.0-6.0，更优选pH值为5.4-5.7。

淀粉酶是指能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，其具体选择为本领域技术人员所公知，例如，所述淀粉酶一般包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶。

α-淀粉酶又称淀粉1,4-糊精酶，它能够任意地、不规则地切开淀粉链内部的α-1,4-糖苷键，将淀粉水解为麦芽糖、含有6个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖。生产此酶的微生物主要有枯草杆菌、黑曲霉、米曲霉和根霉。

β-淀粉酶又称淀粉1,4-麦芽糖苷酶，能够从淀粉分子非还原性末端切开1,4-糖苷键，生成麦芽糖。此酶作用于淀粉的产物是麦芽糖与极限糊精。此酶主要由曲霉、根霉和内孢霉产生。

糖化酶又称淀粉α-1,4-葡萄糖苷酶，此酶作用于淀粉分子的非还原性末端，以葡萄糖为单位，依次作用于淀粉分子中的α-1,4-糖苷键，生成葡萄糖。糖化酶作用于支链淀粉后的产物有葡萄糖和带有α-1,6-糖苷键的寡糖；作用于直链淀粉后的产物几乎全部是葡萄糖。此酶产生菌主要是黑曲霉（左美曲霉、泡盛曲霉）、根霉（雪白根酶、德氏根霉）、拟内孢霉、红曲霉。

异淀粉酶又称淀粉α-1,6-葡萄糖苷酶、分枝酶，此酶作用于枝链淀粉分子分枝点处的α-1,6-糖苷键，将枝链淀粉的整个侧链切下变成直链淀粉。此酶产生菌主要是嫌气杆菌、芽孢杆菌及某些假单孢杆菌等细菌。

根据本发明，优选使用α-淀粉酶和/或异淀粉酶。

根据本发明，所述黑曲霉的接种量可以在很大范围内改变，优选情况下，以每克发酵液为基准，黑曲霉的接种量为5×10³-5×10⁵个孢子，更优选1×10⁴-5×10⁵个孢子。

所述孢子可以通过本领域公知的方法测定，例如，通过血球计数板计数。

本发明发酵所使用的黑曲霉可以为商购的黑曲霉固体制剂或黑曲霉菌种，例如，黑曲霉Co827（上海工业微生物研究所）和黑曲霉T01（天津工业微生物所）。

所述黑曲霉可以采用常规的方法接种，例如，在被接种至发酵液中之前，将所述黑曲霉经过种子培养处理，之后将得到的种子液加入到发酵液中。黑曲霉种子培养的程度可以通过取样显微镜镜检、酸度测定和pH测定对黑曲霉的生长进行观察，当pH在2.0-2.5、酸度0.8-2.0%、菌球大小均匀、菌丝粗壮伸出时停止培养。

优选情况下，所述种子培养处理的方法包括：将黑曲霉接种在黑曲霉培养液中进行培养，所述黑曲霉培养液中含有10-17重量%的玉米粉，接种后黑曲霉培养液中黑曲霉的浓度为5×10⁴-5×10⁵个孢子/毫升。

根据本发明，所述黑曲霉培养液的制备方法没有特别的限制，只要得到的培养液能够适用于黑曲霉的培养即可。

根据本发明，所述黑曲霉种子的培养条件可以在很大范围内改变，例如所述培养的条件可以包括：培养的温度可以为25-45℃，pH值可以为1-7，通气量可以为0.05-0.5体积：（体积·分钟），压力可以为0-0.1Mpa，培养的时间可以为15-35小时；更优选的情况下，所述培养的条件可以包括：培养的温度可以为30-40℃，pH值可以为2-4，通气量可以为0.1-0.5体积：（体积?分钟），压力可以为0-0.08Mpa，所述培养的时间可以为20-30小时。

根据本发明，所述将柠檬酸发酵菌接种至所述发酵培养基中进行发酵的条件可以在很大范围内改变，例如所发酵的条件可以包括：培养的温度可以为30-42℃，pH值可以为1-5，培养的时间可以为50-65小时；更优选的情况下，所述培养的条件可以包括：培养的温度可以为34-39℃，pH值可以为1.5-4.0，所述培养的时间可以为51-60小时。

术语“通气量”一般以通气比来表示，通常以每分钟内通过单位体积培养液的空气体积比来表示V／（V·min），例如通气比为1:0.1-1，简称通气量为0.1-1体积：（体积·分钟）。

所述培养的设备为本领域技术人员所公知，例如，可以使用发酵罐进行培养。

按照本发明的方法制备得到的发酵产物柠檬酸可以用常规的方法，根据不同工业产品的要求分离并精制，比如中和、酸解、脱色、浓缩、结晶、包装。

根据本发明，最终所得柠檬酸包括发酵结束后发酵液中的柠檬酸以及从阴离子交换树脂上洗脱下来的柠檬酸。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

下面根据制备例、实施例和对比例详细说明本发明提供的发酵制备柠檬酸的方法。

其中，以下实施例1-4和以及对比例1中采用的SQD816阴离子交换树脂购自江苏苏青水处理工程集团有限公司，工作交换容量4.5毫摩尔/克干树脂，离子交换基团为-NCH₂CH₂CH₃OH；实施例5采用的D311阴离子交换树脂购自上海金凯树脂化工有限公司，工作交换容量为4.3毫摩尔/克干树脂，离子交换基团为-NHCH₃；实施例6和7以及对比例2中采用的24TD816阴离子交换树脂购自上海水益树脂有限公司，工作交换容量4.7毫摩尔/克干树脂，离子交换基团为-NHCH₂CH₃。

柠檬酸产量、发酵转化率及发酵强度通过如下方法计算：

柠檬酸产量：发酵终点时发酵液中含有的柠檬酸溶液精制后得到的柠檬酸晶体和从阴离子交换树脂中洗脱下来的柠檬酸溶液精制后得到的柠檬酸晶体的质量总和。

发酵转化率：（柠檬酸产量/总糖的重量）×100%。其中，总糖的重量包括接入种子中糖的重量和发酵罐用糖重量。使用菲林试剂法测定种子液中糖的浓度以及发酵罐中糖的浓度，然后计算得出总糖的重量。

发酵强度：单位体积的发酵液在单位时间内所生成的柠檬酸质量。

根据GB1987-2007标准检测发酵过程中、发酵终点以及洗脱液中的柠檬酸溶液的浓度。

制备例1

发酵培养基的制备

1）原料的粉碎：将收获的玉米在热水槽润焖，直至玉米的含水量为15重量%，然后通过粉碎机（江苏牧羊集团有限公司，968-3型）进行粉碎，得到淀粉质原料粉碎产物（粉碎颗粒中50重量%的颗粒直径小于0.1cm）；

2）调浆：用水与淀粉质原料混合进行调浆得到淀粉浆液，所述淀粉质原料与水的重量比为7：3，淀粉浆液的pH值为5.8。

3）酶解：在2）得到的淀粉浆液与淀粉酶（诺维信公司，α-淀粉酶，本发明实施例中均为此淀粉酶）混合，在90℃、pH为5.5的条件下进行酶解100分钟，相对于每克粉碎后的产物，淀粉酶的用量为40个酶活力单位，得到酶解产物。

4）过滤：将3）得到的80重量%的酶解产物通过用液压式板框压滤机进行压滤，分离出酶解清液和酶解残渣。

5）配制发酵培养基1：将200m³的酶解清液和20m³的酶解产物混合后加入到发酵罐中，并添加75kg尿素，90℃灭菌30min，灭菌后得到发酵培养基，所述发酵培养基中糖含量为14.5重量%，氮源含量为0.1重量%，磷源质量含量为0.035重量%。

6）配制发酵培养基2：将200m³的酶解清液和20m³的酶解产物混合后加入到发酵罐中，并添加75kg尿素，90℃灭菌30min，灭菌后得到发酵培养基，所述发酵培养基中糖含量为16.5重量%，氮源含量为0.1重量%，磷源质量含量为0.035重量%。

其中，步骤5）和6）中所述发酵培养基中的糖含量均为以菲林试剂法测定的葡萄糖计的单糖的含量。

制备例2

发酵菌种种子液的制备

将制备例1的步骤3）中的部分酶解产物加水稀释至糖含量为10%（重量比），得到培养液，将培养液投入种子罐，加热到121℃消毒，维持30分钟后快速降温至37℃，接入黑曲霉菌种（黑曲霉T01，天津工业微生物所，本发明实施例中均为此黑曲霉菌种，接种量为：每克培养液为基准，接种3×10⁵个孢子），在pH值为6、温度为36℃、0.4V／（V·min）的通气条件下进行菌种培养；通过取样显微镜镜检、酸度测定和pH测定对黑曲霉的生长进行观察，27小时之后，当pH在2.0、酸度10g/L、菌球大小均匀、菌丝粗壮伸出时，停止培养。

实施例1

本实施例用于说明本发明提供的发酵制备柠檬酸的方法。

将制备例2中培养的黑曲霉种子液加入到制备例1中的发酵培养基1中开始发酵，其中，以每克发酵培养基计，黑曲霉的接种量为3.0×10⁴个孢子，发酵条件包括：温度为37℃，压力为0.05Mpa，通气量为0.2体积：（体积·分钟），搅拌转速为80rpm。当发酵液中柠檬酸的浓度达到4重量%时开始启动填充有SQD816阴离子交换树脂的树脂柱（树脂填充量为树脂柱体积的70%；阴离子交换树脂的体积与柠檬酸溶液的体积的比为1:10），即首先将树脂柱上部入口和下部出口处的阀门打开，并开启离心泵，在离心泵的作用下，将发酵罐中的发酵液引出，并经过树脂柱的入口与发酵罐连通管道上设置的孔直径为0.2μm生物滤膜以除去菌体和残渣，将经过生物滤膜过滤的发酵清液引入填充有SQD816阴离子交换树脂的树脂柱中（树脂柱中填充SQD816阴离子交换树脂的填充量70重量%），将分离柠檬酸后的液体经树脂柱下部出口引出并通过离心泵重新回到发酵罐中继续发酵，并依次连续循环直至发酵终点，其中，进行离子交换的温度为37℃。发酵液流入树脂柱中的流速为1.2-1.5倍树脂体积/小时（整个过程中对发酵液中柠檬酸的浓度每隔4h进行检测，并根据检测的柠檬酸浓度对发酵液流入树脂柱中的流速进行调整），使得在发酵过程中发酵液中柠檬酸的浓度不高于12重量%。当发酵液中还原糖的浓度小于0.6g/100ml发酵液时停止发酵，发酵液终点柠檬酸的浓度为10.1重量%，发酵周期为50小时。

通过过滤、中和、酸解、脱色、离交、浓缩、结晶、包装等过程精制发酵终点发酵罐中得到的柠檬酸溶液，得柠檬酸晶体25.25吨。

使用温度为80℃的热水对结合在SQD816阴离子交换树脂上的柠檬酸进行洗脱，得柠檬酸浓度为35重量%的柠檬酸洗脱液28m³，通过浓缩、结晶、包装等精制过程得到柠檬酸晶体9.8吨。

计算柠檬酸的产量、柠檬酸的发酵强度以及发酵转换率，结果如表2所示。

实施例2

本实施例用于说明本发明提供的发酵制备柠檬酸的方法。

采用实施例1的方法进行柠檬酸的发酵，不同的是，当发酵液中柠檬酸的浓度达到8重量%时开始启动填充有SQD816阴离子交换树脂的树脂柱，发酵液流入树脂柱中的流速为1.1-1.2倍树脂体积/小时（整个过程中对发酵液中柠檬酸的浓度每隔3h进行检测，根据检测的柠檬酸浓度对发酵液流入树脂柱中的流速进行调整），使得在发酵过程中柠檬酸的浓度不高于12重量%。当发酵液中还原糖的浓度小于0.6g/100ml发酵液时，停止发酵，发酵液终点柠檬酸浓度为11.8重量%，发酵周期为52小时。制备得到的柠檬酸发酵液以及洗脱液分别得到柠檬酸晶体29.5吨和5.7吨，并计算柠檬酸产量，发酵转化率和发酵强度，结果如表2所示。

实施例3

本实施例用于说明本发明提供的发酵制备柠檬酸的方法。

采用实施例1的方法进行柠檬酸的发酵，不同的是，当发酵液中柠檬酸的浓度达到6重量%时开始启动填充有SQD816阴离子交换树脂的树脂柱装置，发酵液流入树脂柱中的流速为1.1-1.4倍树脂体积/小时（整个过程中对发酵液中柠檬酸的浓度每隔4h进行检测，根据检测的柠檬酸浓度对发酵液流入树脂柱中的流速进行调整），使得在发酵过程中柠檬酸的浓度不高于12重量%。当发酵液中还原糖的浓度小于0.6g/100ml发酵液时，停止发酵，发酵液终点柠檬酸浓度为11.2重量%，发酵周期为50小时。制备得到的柠檬酸发酵液以及洗脱液分别得到柠檬酸晶体28.0吨和7.27吨，并计算柠檬酸产量，发酵转化率和发酵强度，结果如表2所示。

实施例4

本实施例用于说明本发明提供的发酵制备柠檬酸的方法。

采用实施例1的方法进行柠檬酸的发酵，不同的是，当发酵液中柠檬酸的浓度达到10重量%时开始启动填充有SQD816阴离子交换树脂的树脂柱装置，使得在发酵过程中柠檬酸的浓度不高于13.5重量%。当发酵液中还原糖的浓度小于0.6g/100ml发酵液时，停止发酵，发酵液终点柠檬酸浓度为13.0重量%，发酵周期为54小时。制备得到的柠檬酸发酵液以及洗脱液分别得到柠檬酸晶体32.5吨和2.5吨，并计算柠檬酸产量，发酵转化率和发酵强度，结果如表2所示。

实施例5

本实施例用于说明本发明提供的发酵制备柠檬酸的方法。

采用实施例2的方法进行柠檬酸的发酵，不同的是，调节发酵液流入树脂柱中的流速为0.8-0.9倍树脂体积/小时，使得在发酵过程中柠檬酸的浓度不高于13.5重量%。当发酵液中还原糖的浓度小于0.6g/100ml发酵液时，停止发酵，发酵液终点柠檬酸浓度为13.2重量%，发酵周期为54小时。制备得到的柠檬酸发酵液以及洗脱液分别得到柠檬酸晶体32.4吨和2.5吨，并计算柠檬酸产量，发酵转化率和发酵强度，结果如表2所示。

实施例6

本实施例用于说明本发明提供的发酵制备柠檬酸的方法。

采用实施例1的方法进行柠檬酸的发酵，不同的是，当发酵液中柠檬酸的浓度达到6重量%时开始启动填充有D311阴离子交换树脂的树脂柱装置，发酵液流入树脂柱中的流速为1.1-1.4倍树脂体积/小时（整个过程中对发酵液中柠檬酸的浓度每隔3h进行检测，根据检测的柠檬酸浓度对发酵液流入树脂柱中的流速进行调整），使得在发酵过程中柠檬酸的浓度不高于12重量%。当发酵液中还原糖的浓度小于0.6g/100ml发酵液时，停止发酵，发酵液终点柠檬酸浓度为11.6重量%，发酵周期为53小时。制备得到的柠檬酸发酵液以及洗脱液分别得柠檬酸晶体30.75吨和4.46吨，并计算柠檬酸产量，发酵转化率和发酵强度，结果如表2所示。

对比例1

本对比例用于说明现有技术提供的发酵柠檬酸制备的方法。

采用实施例1的方法进行柠檬酸的发酵，不同的是，整个发酵过程中对发酵液中生成的柠檬酸不进行分离，当发酵液中还原糖的浓度小于0.6g/100ml发酵液时，停止发酵，发酵液终点柠檬酸浓度为13.9重量%，发酵周期为63小时。制备得到的柠檬酸发酵液，得柠檬酸晶体34.75吨，并计算柠檬酸产量，发酵转化率和发酵强度，结果如表2所示。

实施例7

本实施例用于说明本发明提供的发酵制备柠檬酸的方法。

采用实施例1的方法进行柠檬酸的发酵，不同的是，发酵培养基选用的是制备例1中的发酵培养基2，当发酵液中柠檬酸的浓度达到4重量%时开始启动填充有24TD816阴离子交换树脂的树脂柱装置，发酵液流入树脂柱中的流速为1.2-1.5倍树脂体积/小时（整个过程中对发酵液中柠檬酸的浓度每隔4h进行检测，根据检测的柠檬酸浓度对发酵液流入树脂柱中的流速进行调整），使得在发酵过程中柠檬酸的浓度不高于12重量%。当发酵液中还原糖的浓度小于0.6g/100ml发酵液时，停止发酵，发酵液终点柠檬酸浓度为11.9重量%，发酵周期为58小时。制备得到的柠檬酸发酵液以及洗脱液分别得到柠檬酸晶体29.75吨和10.17吨，并计算柠檬酸产量，发酵转化率和发酵强度，结果如表2所示。

实施例8

本实施例用于说明采用本发明提供的发酵制备柠檬酸的方法。

采用实施例1的方法进行柠檬酸的发酵，不同的是，发酵培养基选用的是制备例1中的发酵培养基2，当发酵液中柠檬酸的浓度达到8重量%时开始启动填充有24TD816阴离子交换树脂的树脂柱装置，发酵液流入树脂柱中的流速为1.0-1.2倍树脂体积/小时（整个过程中对发酵液中柠檬酸的浓度每隔3h进行检测，根据检测的柠檬酸浓度对发酵液流入树脂柱中的流速进行调整），使得在发酵过程中柠檬酸的浓度不高于13.5重量%。当发酵液中还原糖的浓度小于0.6g/100ml发酵液时，停止发酵，发酵液终点柠檬酸浓度为13.1重量%，发酵周期为59小时。制备得到的柠檬酸发酵液以及洗脱液分别得到柠檬酸晶体32.75吨和7.26吨，并计算柠檬酸产量，发酵转化率和发酵强度，结果如表2所示。

对比例2

本对比例用于说明现有技术提供的发酵柠檬酸制备的方法。

采用实施例1的方法进行柠檬酸的发酵，不同的是，发酵培养基选用的是制备例1中的发酵培养基2，并且整个发酵过程中对发酵液中生成的柠檬酸不进行分离，当发酵液中还原糖的浓度小于0.6g/100ml发酵液时，停止发酵，发酵液终点柠檬酸浓度为14.8重量%，发酵周期为73小时。制备得到的柠檬酸发酵液，得到柠檬酸晶体37吨，并计算柠檬酸产量，发酵转化率和发酵强度，结果如表2所示。

表2

从上表2的数据可以看出，与对比例1实施例1-5相比，对比例2和实施例6和7相比，采用本发明提供的柠檬酸的制备方法，将发酵过程中产生的柠檬酸进行分离，并使柠檬酸的浓度控制在本发明的范围内，有效地提高了柠檬酸的产量、发酵转换率和发酵强度，并且缩短了发酵周期；实施例2与实施例5相比，在其它条件相同的情况下，将柠檬酸的浓度控制在本发明优选的范围内，能够有效地提高柠檬酸的产量、发酵转换率和发酵强度，并且缩短发酵周期；当发酵培养基中糖的含量由14.5重量%提高至16.5重量%时，采用现有技术发酵周期将延长10小时，而采用本发明提供的方法，发酵周期只延长了7-8小时，并且柠檬酸产量、发酵强度和发酵转化率的提高幅度也优于采用现有技术。

Claims (9)

1.一种发酵制备柠檬酸的方法，该方法包括，在能够生成柠檬酸的条件下，将黑曲霉接种到发酵培养基中进行发酵，其特征在于，将发酵过程中产生的柠檬酸进行分离，并使得在发酵过程中以及发酵终点发酵液中柠檬酸的浓度不高于13.5重量％；

其中，开始将发酵液中的柠檬酸进行分离的时机为：发酵液中的柠檬酸浓度为2-10重量％；

其中，所述发酵培养基含有淀粉质原料酶解产物，所述淀粉质原料酶解产物中氮源含量为0.06-0.14重量％，磷源含量为0.005-0.07重量％；所述发酵培养基的总糖含量为10-20重量％；

其中，发酵培养的温度为34-39℃。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，将发酵过程中产生的柠檬酸进行分离，并使得在发酵过程中以及发酵终点发酵液中柠檬酸的浓度不高于12重量％。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，开始将发酵液中的柠檬酸进行分离的时机为：发酵液中的柠檬酸浓度为4-8重量％。

4.根据权利要求1或2项所述的方法，其中，在发酵过程中将发酵液中的柠檬酸进行分离的方法为：将发酵液引入填充有阴离子交换树脂的树脂柱中，进行离子交换，使发酵液中的柠檬酸吸附到所述阴离子交换树脂上，并将分离柠檬酸后的液体返回发酵液中。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述阴离子交换树脂为强碱型阴离子交换树脂和弱碱型阴离子交换树脂中的一种或多种，所述阴离子交换树脂的工作交换容量为1-5毫摩尔/克干树脂；所述强碱型阴离子交换树脂选自苯乙烯系阴离子交换树脂和丙烯酸系阴离子交换树脂中的一种或多种；所述弱碱型阴离子交换树脂选自苯乙烯系阴离子交换树脂和丙烯酸系阴离子交换树脂中的一种或多种。

6.根据权利要求4所述的方法，其中，所述阴离子交换树脂的工作交换容量为3-5毫摩尔/克干树脂。

7.根据权利要求4所述的方法，其中，所述离子交换的条件包括：温度为30-45℃；将所述发酵液引入填充有所述阴离子交换树脂的树脂柱中的流速为0.1-2倍树脂体积/小时。

8.根据权利要求4所述的方法，其中，该方法还包括收集经分离的柠檬酸，所述收集方法包括：用洗脱剂将已吸附到所述阴离子交换树脂上的柠檬酸进行洗脱，得到柠檬酸洗脱液。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述洗脱的条件包括：所述洗脱剂选自水和/或氢氧化钠溶液；洗脱的温度为30-80℃。