CN102864082A - 柠檬酸发酵种子培养的方法及发酵制备柠檬酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种柠檬酸发酵种子培养的方法，所述方法包括，在种子培养条件下，将柠檬酸发酵菌种接入种子罐的种子培养基中进行种子培养，得到种子液，其特征在于，种子培养10-15h后的罐压、通气量和搅拌转速分别高于之前的罐压、通气量和搅拌转速。还公开了一种发酵制备柠檬酸的方法，所述方法包括在种子培养条件下，将柠檬酸发酵菌种进行种子培养，然后在生成柠檬酸的条件下，将种子培养后得到的种子液接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液，其特征在于，柠檬酸发酵菌种按照如上所述的方法进行种子培养。本发明方法，可缩短种龄，提高种子质量，缩短发酵周期，提高转化率和终点柠檬酸含量，降低了水电等动力消耗，节约了成本。

Description

柠檬酸发酵种子培养的方法及发酵制备柠檬酸的方法

技术领域

本发明涉及柠檬酸发酵技术领域，具体地涉及一种柠檬酸发酵种子培养的方法及一种发酵制备柠檬酸的方法。

背景技术

柠檬酸是当今世界上用量最大的一种有机酸，至今世界上消费的柠檬酸主要采用以黑曲霉为菌种的发酵法生产。

柠檬酸发酵生产一般包括种子罐培养阶段和发酵罐发酵阶段。现有柠檬酸发酵生产中，往往只注重发酵罐发酵阶段的调控，对于种子罐培养阶段的控制则相对比较粗放，一般只是在固定的罐压、通气量和搅拌转速条件下进行种子培养，例如培养的条件包括：温度为30-38℃，起始pH值为5-6，通气量为0.3-0.8体积:（体积·min），罐压为0.04-0.12MPa，搅拌转速为250-450rpm。现有的种子培养方法一般造成培养出的种子的种龄偏长，一般为26-35h，菌球形态松散，菌丝长，致使发酵阶段的发酵周期长、转化率低。

种子是影响发酵的最为关键的因素，因此，研发出适合的种子培养方法对柠檬酸发酵生产至关重要。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术中种子培养阶段培养出的种子的种龄长、种子质量差，致使发酵阶段发酵周期长、转化率低的缺陷，提供一种新的柠檬酸发酵种子培养的方法及一种发酵制备柠檬酸的方法。

本发明的发明人在研究中意外发现，在种子培养阶段，种子培养10-15h后的罐压、通气量和搅拌转速分别高于之前的罐压、通气量和搅拌转速，可缩短种子培养的时间，即缩短种龄，并提高种子质量，即使培养出的菌球较密实圆整，菌丝短而粗壮；且采用培养得到的种子液进行发酵，可缩短发酵周期，提高转化率。优选情况下，种子培养10-15h后，罐压提高40-150%，通气量提高50-180%，搅拌转速提高10-80%，可进一步缩短种龄，提高种子质量，缩短发酵周期，提高转化率。

因此，为了实现上述目的，一方面，本发明提供了一种柠檬酸发酵种子培养的方法，所述方法包括，在种子培养条件下，将柠檬酸发酵菌种接入种子罐的种子培养基中进行种子培养，得到种子液，其特征在于，种子培养10-15h后的罐压、通气量和搅拌转速分别高于之前的罐压、通气量和搅拌转速。

优选地，种子培养10-15h后，罐压提高40-150%，通气量提高50-180%，搅拌转速提高10-80%；更优选地，种子培养10-15h后，罐压提高60-100%，通气量提高80-120%，搅拌转速提高25-60%。

优选地，从种子培养开始至种子培养10-15h的时间段内，将罐压控制在0.04-0.06MPa，将通气量控制在0.3-0.6体积:（体积·min），将搅拌转速控制在250-350rpm；在种子培养10-15h后，将罐压控制在0.06-0.1MPa，将通气量控制在0.6-0.8体积:（体积·min），将搅拌转速控制在350-450rpm。

另一方面，本发明提供了一种发酵制备柠檬酸的方法，所述方法包括在种子培养条件下，将柠檬酸发酵菌种进行种子培养，然后在生成柠檬酸的条件下，将种子培养后得到的种子液接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液，其特征在于，柠檬酸发酵菌种按照如上所述的方法进行种子培养。

本发明提供的柠檬酸发酵种子培养的方法，可缩短种龄，且培养出的菌球较密实圆整，菌丝短而粗壮；本发明提供的发酵制备柠檬酸的方法，可缩短发酵周期，提高终点柠檬酸含量和转化率；本发明方法大大降低了种子培养时间和发酵周期，降低了水电等动力消耗，节约了成本。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

图1是为本发明实施例1培养出的种子形态照片（10×15倍）；

图2是为本发明对比例1培养出的种子形态照片（10×15倍）。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

一方面，本发明提供了一种柠檬酸发酵种子培养的方法，该方法包括，在种子培养条件下，将柠檬酸发酵菌种接入种子罐的种子培养基中进行种子培养，得到种子液，种子培养10-15h后的罐压、通气量和搅拌转速分别高于之前的罐压、通气量和搅拌转速。

本发明中，“种子培养”是指将柠檬酸发酵菌种接种至发酵培养基之前，先接种至种子罐的种子培养基中进行培养，使培养后的柠檬酸发酵菌种适合于柠檬酸的发酵。“种子液”是指种子罐的种子培养基接种后经过种子培养得到的含有培养后的柠檬酸发酵菌种的种子培养基。“种子”是指种子液中经过培养后的柠檬酸发酵菌种，即经过培养后的黑曲霉。

本发明中，“种龄”是指从种子培养开始（即将柠檬酸发酵菌种接入种子罐开始）到停止种子培养所经历的时间，即种子培养的时间。

本发明中，术语“通气量”一般以通气比来表示，通常以每min内通过单位体积培养基的空气体积比来表示(V／V·min)，例如通气比为1:0.1-1，简称通气量为0.1-1体积:（体积·min）。

根据本发明，尽管种子培养10-15h后的罐压、通气量和搅拌转速分别高于之前的罐压、通气量和搅拌转速，即可实现本发明的目的，即缩短种龄，提高种子质量，缩短发酵周期，提高转化率。但优选情况下，种子培养10-15h后，罐压提高40-150%，通气量提高50-180%，搅拌转速提高10-80%，可进一步缩短种龄，提高种子质量，缩短发酵周期，提高转化率；更优选情况下，种子培养10-15h后，罐压提高60-100%，通气量提高80-120%，搅拌转速提高25-60%，可更进一步缩短种龄，提高种子质量，缩短发酵周期，提高转化率。

本发明虽然仅对种子培养10-15h前后罐压、通气量和搅拌转速的高低进行了限定，没有限定罐压、通气量和搅拌转速的具体取值范围，但本领域技术人员应该理解的是，罐压、通气量和搅拌转速的具体取值范围应该在适于种子培养的范围内，即应该在本领域常规采用的范围内。优选地，从种子培养开始至种子培养10-15h的时间段内，将罐压控制在0.04-0.06MPa，将通气量控制在0.3-0.6体积:（体积·min），将搅拌转速控制在250-350rpm；在种子培养10-15h后，将罐压控制在0.06-0.1MPa，将通气量控制在0.6-0.8体积:（体积·min），将搅拌转速控制在350-450rpm。更优选地，从种子培养开始至种子培养10-15h的时间段内，将罐压控制在0.04-0.05MPa，将通气量控制在0.3-0.4体积:（体积·min），将搅拌转速控制在250-350rpm；在种子培养10-15h后，将罐压控制在0.07-0.1MPa，将通气量控制在0.6-0.8体积:（体积·min），将搅拌转速控制在400-450rpm。

本发明中，除了对罐压、通气量和搅拌转速有上述限定外，对种子培养的其他条件无特殊要求，可以采用本领域常用的培养条件，例如种子培养条件可以包括：温度为30-38℃，起始pH值为5-6。

本发明中，对于种子培养基无特殊要求，可以采用本领域常用的种子培养基。例如可以采用含有淀粉质原料酶解产物的种子培养基。

淀粉质原料酶解产物即是指将淀粉质原料粉碎，将粉碎后的产物调浆后进行酶解，得到的产物。淀粉质原料可以为本领域公知的各种可以用于酶解、发酵制备柠檬酸的含有淀粉的原料，例如，可以选自玉米、薯类（如木薯）和小麦中的一种或几种，优选情况下，所述淀粉质原料为玉米。

所述酶解步骤可以通过本领域常用的方法完成，比如向粉碎产物中添加产酶微生物和/或酶，在产酶微生物的生长温度和/或酶有活力的温度下保温完成。所述产酶微生物为能够分泌淀粉酶的产酶微生物。所述酶包括淀粉酶。

由于微生物生长会产生副产物，因此优选直接加入酶。所述酶的用量越多越好，出于成本考虑，优选以每克粉碎后的粉碎产物的干重计，淀粉酶的用量为15-50个酶活力单位。

本发明中，淀粉酶的酶活力单位的定义为：在pH值为6.0、温度为70℃的条件下，1min将1毫克淀粉转化为还原糖所需的酶量为一个酶活力单位。

酶解的温度可以在很大范围内改变，优选为70-105℃，更优选为80-95℃。酶解的时间理论上越长越好，考虑到设备利用率，优选酶解的时间为90-150min，更优选为100-120min。酶解的pH值可以在很大范围内改变，优选为5.0-7.0。

淀粉酶是指能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，淀粉酶一般包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶。

根据本发明，优选使用α-淀粉酶和/或异淀粉酶。

本发明的种子培养基优选将淀粉质原料酶解产物加水稀释至总糖为8-12重量%得到。本领域技术人员应该理解的是，种子培养基需高温灭菌后降温，才能接种柠檬酸发酵菌种，此为本领域的常规操作，在此不再赘述。

本发明中，柠檬酸发酵菌种采用本领域常用的发酵菌种，例如黑曲霉。对于黑曲霉在种子培养基中的接种量无特殊要求，可以采用本领域常规接种量，例如，以每升种子培养基为基准，黑曲霉的接种量为2×10⁸-3×10⁸个孢子。

孢子的数量可以通过本领域公知的方法测定，例如，通过血球计数板计数。

黑曲霉种子培养的程度可以通过酸度测定来确定，当种子液酸度≥1g/100mL时停止培养。

另一方面，本发明提供了一种发酵制备柠檬酸的方法，该方法包括在种子培养条件下，将柠檬酸发酵菌种进行种子培养，然后在生成柠檬酸的条件下，将种子培养后得到的种子液接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液，柠檬酸发酵菌种按照如上所述的方法进行种子培养。

本发明中，发酵培养基为本领域技术人员公知的概念，指微生物发酵所需的供微生物生长和维持用的人工配制的养料，一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐（包括微量元素）以及维生素和水等。发酵液也为本领域技术人员公知的概念，指接入微生物菌株的发酵培养基，经过一段时间的培养后所得产物。

根据本发明，对发酵培养基的成分没有特别的要求，只要可以用于柠檬酸发酵即可。优选地，发酵培养基含有淀粉质原料酶解产物，淀粉质原料酶解产物如前所述，在此不再赘述。一般地，淀粉质原料酶解产物称为液化液，液化液经固液分离得到酶解残渣和液化清液。本发明中，发酵培养基优选由液化液和液化清液与水混合或不与水混合得到，且进一步优选以发酵培养基的总重量为100重量份为基准，液化清液的用量为80-85重量份，液化液的用量为15-20重量份。

本发明中，固液分离的条件使酶解残渣的固含量为45-55重量%，优选为49-51重量%。固液分离的方法与装置为本领域技术人员所公知，例如，压滤机或离心机。

本发明中，以每升发酵培养基为基准，种子液的量使得在发酵培养基中的黑曲霉的接种量优选为1.8×10⁷-3.8×10⁷个孢子，进一步优选为2.2×10⁷-3.6×10⁷个孢子。将经过种子培养得到的种子液加入到发酵培养基中进行发酵，通常用接入发酵培养基的种子液的体积占接入种子液后发酵培养基的体积的百分比来表示黑曲霉的接种量，当接入发酵培养基的种子液的体积占接入种子液后发酵培养基的体积的8-12%时，能够满足以每升发酵培养基为基准，接种量在2.2×10⁷-3.6×10⁷个孢子范围内。因此，优选的接种量可以表示为：接种量为8-12%。

本发明中，发酵条件可以为本领域常规的发酵条件，例如，发酵的条件可以包括：温度为30-40℃，优选为35-37℃；起始pH值为4-5；通气量为0.1-1体积:（体积·min），优选为0.3-0.8体积:（体积·min），罐压为0.05-0.06MPa，搅拌转速为350-450rpm。

本发明中，发酵周期是指从在发酵培养基中接种开始至发酵液中还原糖含量达到0.3g/100mL以下的这段时间。

按照GB/T5009.7-2008的方法测定发酵培养基中还原性糖的浓度。

发酵的设备为本领域技术人员所公知，例如，可以使用发酵罐。

按照本发明的方法制备得到的发酵产物柠檬酸可以用常规的方法，根据不同工业产品的要求分离并精制，比如中和、酸解、脱色、浓缩、结晶、包装。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

实施例

以下的实施例将对本发明作进一步的说明，但并不因此限制本发明。

在以下实施例和对比例中：

黑曲霉菌种为黑曲霉Co827。

种子形态：种子液取样，用显微镜(OLYMPUS BX41)观察、拍照。

按照GB/T5009.8-2003的方法测定发酵培养基中总糖的浓度。

按照GB/T5009.7-2008的方法测定发酵培养基中还原性糖的浓度。

根据GB 1987-2007标准检测所得柠檬酸溶液的浓度（即终点柠檬酸含量）。

单罐供酸量=柠檬酸溶液的浓度×柠檬酸溶液的体积。

转化率（%）=单罐供酸量/用糖的总重量×100%，其中用糖的总重量包括种子罐用糖重量和发酵罐用糖重量。

实施例1

本实施例用于说明本发明提供的柠檬酸发酵种子培养的方法及发酵制备柠檬酸的方法。

（1）将收获的玉米进行粉碎，得到平均粒子直径为400微米的粉碎后产物。

（2）将粉碎后产物按24重量%的浓度调浆，相对于每克粉碎后产物，加入20个酶活力单位的淀粉酶（诺维信公司，α-淀粉酶，下同），进入喷射器，在93℃、pH为5.9的条件下酶解100min得到产物，即液化液。

（3）将部分液化液通过用液压式板框压滤机进行压滤，分离出液化清液和酶解残渣，其中，酶解残渣的固含量为51重量%。

（4）将步骤（2）中的部分液化液，加水稀释至总糖为10重量%，得到种子培养基，将种子培养基投入种子罐，加热到121℃消毒，维持30min后快速降温至36℃，接入黑曲霉菌种，以每升种子培养基为基准，黑曲霉的接种量为2.5×10⁸个孢子。在35℃、起始pH值为5的条件下进行种子培养，从种子培养开始至种子培养12h时，将罐压控制在0.04MPa，将通气量控制在0.3体积:（体积·min），将搅拌转速控制在300rpm；在种子培养12h后，将罐压控制在0.07MPa，将通气量控制在0.66体积:（体积·min），将搅拌转速控制在420rpm。通过酸度测定对黑曲霉的生长进行观察，当酸度≥1g/100mL时停止培养，得到种子液。记录培养时间，即种龄，见表1。在显微镜下观察种子形态，照片如图1所示。

（5）配制发酵培养基，将180.5千克的上述液化清液和35.5千克的上述液化液灭菌后加入到300L的发酵罐中，得到发酵培养基。

（6）将步骤（4）得到的种子液加入到步骤（5）的发酵罐中开始发酵，接种量为8%，发酵条件包括温度为35℃，起始pH值为5，通气量为0.3体积:（体积·min），罐压为0.05MPa，搅拌转速为400rpm。发酵至发酵液中还原糖含量达到0.3g/100mL以下停止发酵，记录发酵周期见表1，然后进行固液分离得到柠檬酸溶液。测定柠檬酸溶液的浓度，即终点柠檬酸含量，并计算转化率见表1。

实施例2

本实施例用于说明本发明提供的柠檬酸发酵种子培养的方法及发酵制备柠檬酸的方法。

（1）将收获的玉米进行粉碎，得到平均粒子直径为380微米的粉碎后产物。

（2）将粉碎后的产物按27重量%的浓度调浆，相对于每克粉碎后产物，加入50个酶活力单位的淀粉酶，进入喷射器，在95℃、pH为5.8的条件下酶解110min得到产物，即液化液。

（3）将部分液化液通过用液压式板框压滤机进行压滤，分离出液化清液和酶解残渣，其中，酶解残渣的固含量为50重量%。

（4）将步骤（2）中的部分液化液，加水稀释至总糖为8重量%，得到种子培养基，将种子培养基投入种子罐，加热到121℃消毒，维持30min后快速降温至36℃，接入黑曲霉菌种，以每升种子培养基为基准，黑曲霉的接种量为2×10⁸个孢子。在36℃、起始pH值为5.5的条件下进行种子培养，从种子培养开始至种子培养10h时，将罐压控制在0.05MPa，将通气量控制在0.4体积:（体积·min），将搅拌转速控制在250rpm；在种子培养10h后，将罐压控制在0.1MPa，将通气量控制在0.8体积:（体积·min），将搅拌转速控制在400rpm。通过酸度测定对黑曲霉的生长进行观察，当酸度≥1g/100mL时停止培养，得到种子液。记录种龄，见表1。在显微镜下观察种子形态，与实施例1类似，照片未示出。

（5）配制发酵培养基，将177.1千克的上述液化清液和38.9千克的上述液化液灭菌后加入到300L的发酵罐中，得到发酵培养基。

（6）将步骤（4）得到的种子液加入到步骤（5）的发酵罐中开始发酵，接种量为10%，发酵条件包括温度为36℃，起始pH值为4.5，通气量为0.8体积:（体积·min），罐压为0.06MPa，搅拌转速为350rpm。发酵至发酵液中还原糖含量达到0.3g/100mL以下停止发酵，记录发酵周期见表1，然后进行固液分离得到柠檬酸溶液。测定终点柠檬酸含量，并计算转化率见表1。

实施例3

本实施例用于说明本发明提供的柠檬酸发酵种子培养的方法及发酵制备柠檬酸的方法。

（1）将收获的玉米进行粉碎，得到平均粒子直径为370微米的粉碎后产物。

（2）将粉碎后的产物按26重量%的浓度调浆，相对于每克粉碎后产物，加入15个酶活力单位的淀粉酶，进入喷射器，在90℃、pH为6.0的条件下酶解120min得到产物，即液化液。

（3）将部分液化液通过用液压式板框压滤机进行压滤，分离出液化清液和酶解残渣，其中，酶解残渣的固含量为49重量%。

（4）将步骤（2）中的部分液化液，加水稀释至总糖为12重量%，得到种子培养基，将种子培养基投入种子罐，加热到121℃消毒，维持30min后快速降温至36℃，接入黑曲霉菌种，以每升种子培养基为基准，黑曲霉的接种量为3×10⁸个孢子。在37℃、起始pH值为6的条件下进行种子培养，从种子培养开始至种子培养15h时，将罐压控制在0.05MPa，将通气量控制在0.4体积:（体积·min），将搅拌转速控制在350rpm；在种子培养15h后，将罐压控制在0.08MPa，将通气量控制在0.72体积:（体积·min），将搅拌转速控制在450rpm。通过酸度测定对黑曲霉的生长进行观察，当酸度≥1g/100mL时停止培养，得到种子液。记录种龄，见表1。在显微镜下观察种子形态，与实施例1类似，照片未示出。

（5）配制发酵培养基，将169千克的上述酶解液化清液和42.2千克的酶解得到的产物灭菌后加入到300L的发酵罐中，得到发酵培养基。

（6）将步骤（4）得到的种子液加入到步骤（5）的发酵罐中开始发酵，接种量为12%，发酵条件包括温度为35℃，起始pH值为5，通气量为0.6体积:（体积·min），罐压为0.05MPa，搅拌转速为450rpm。发酵至发酵液中还原糖含量达到0.3g/100mL以下停止发酵，记录发酵周期见表1，然后进行固液分离得到柠檬酸溶液。测定终点柠檬酸含量，并计算转化率见表1。

实施例4

本实施例用于说明本发明提供的柠檬酸发酵种子培养的方法及发酵制备柠檬酸的方法。

按照实施例1的方法进行种子培养和发酵制备柠檬酸，不同的是，在种子培养12h后，将罐压控制在0.1MPa，将通气量控制在0.5体积:（体积·min），将搅拌转速控制在450rpm。记录种龄、发酵周期见表1，测定终点柠檬酸含量，并计算转化率见表1。

实施例5

本实施例用于说明本发明提供的柠檬酸发酵种子培养的方法及发酵制备柠檬酸的方法。

按照实施例1的方法进行种子培养和发酵制备柠檬酸，不同的是，在种子培养12h后，将罐压控制在0.06MPa，将通气量控制在0.8体积:（体积·min），将搅拌转速控制在350rpm。记录种龄、发酵周期见表1，测定终点柠檬酸含量，并计算转化率见表1。

对比例1

按照实施例1的方法进行种子培养和发酵制备柠檬酸，不同的是，在种子培养12h后，将罐压控制在0.03MPa，将通气量控制在0.2体积:（体积·min），将搅拌转速控制在250rpm。记录种龄、发酵周期见表1，测定终点柠檬酸含量，并计算转化率见表1。

对比例2

按照实施例1的方法进行种子培养和发酵制备柠檬酸，不同的是，在种子培养过程中，将罐压控制在0.06MPa，将通气量控制在0.6体积:（体积·min），将搅拌转速控制在350rpm，并各自保持恒定不变。记录种龄、发酵周期见表1，测定终点柠檬酸含量，并计算转化率见表1。

表1

实施例或对比例编号	种龄(h)	发酵周期(h)	终点柠檬酸含量(g/100ml)	转化率(%)
					实施例1	24	54．5	15.0	97.5
实施例2	22	52	15.6	99
					实施例3	23	54	15.2	98
实施例4	26	56	14.5	95.5
					实施例5	27	57	14.2	94
对比例1	32	67	13.5	91.8
					对比例2	30	65	13.9	93.3

将实施例1-5分别与对比例1-2进行比较可以看出，采用本发明方法进行种子培养和发酵制备柠檬酸，可缩短种龄和发酵周期，并提高终点柠檬酸含量和转化率。从图1和图2可以看出，采用本发明方法培养出的种子质量高，菌球较密实，菌丝短而粗壮。

将实施例1分别与实施例4和实施例5进行比较可以看出，种子培养10-15h后，罐压提高60-100%，通气量提高80-120%，搅拌转速提高25-60%，更有利于缩短种龄、发酵周期，提高终点柠檬酸含量、转化率。

本发明提供的柠檬酸发酵种子培养的方法，可缩短种龄，且培养出的菌球较密实圆整，菌丝短而粗壮；本发明提供的发酵制备柠檬酸的方法，可缩短发酵周期，提高终点柠檬酸含量和转化率；本发明方法大大降低了种子培养时间和发酵周期，降低了水电等动力消耗，节约了成本。

Claims (10)

1.一种柠檬酸发酵种子培养的方法，所述方法包括，在种子培养条件下，将柠檬酸发酵菌种接入种子罐的种子培养基中进行种子培养，得到种子液，其特征在于，种子培养10-15h后的罐压、通气量和搅拌转速分别高于之前的罐压、通气量和搅拌转速。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，种子培养10-15h后，罐压提高40-150%，通气量提高50-180%，搅拌转速提高10-80%。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，种子培养10-15h后，罐压提高60-100%，通气量提高80-120%，搅拌转速提高25-60%。

4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，从种子培养开始至种子培养10-15h的时间段内，将罐压控制在0.04-0.06MPa，将通气量控制在0.3-0.6体积:（体积·min），将搅拌转速控制在250-350rpm；在种子培养10-15h后，将罐压控制在0.06-0.1MPa，将通气量控制在0.6-0.8体积:（体积·min），将搅拌转速控制在350-450rpm。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，种子培养条件包括：温度为30-38℃，起始pH值为5-6。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述柠檬酸发酵菌种为黑曲霉。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，以每升种子培养基为基准，黑曲霉的接种量为2×10⁸-3×10⁸个孢子。

8.一种发酵制备柠檬酸的方法，所述方法包括在种子培养条件下，将柠檬酸发酵菌种进行种子培养，然后在生成柠檬酸的条件下，将种子培养后得到的种子液接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液，其特征在于，柠檬酸发酵菌种按照权利要求1-7中任意一项所述的方法进行种子培养。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，以每升发酵培养基为基准，种子液的量使得在发酵培养基中的黑曲霉的接种量为1.8×10⁷-3.8×10⁷个孢子。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其中，发酵的条件包括：温度为30-40℃，起始pH值为4-5，通气量为0.1-1体积:（体积·min），罐压为0.05-0.06MPa，搅拌转速为350-450rpm。

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