CN102249895B - 一种含柠檬酸的溶液的处理方法 - Google Patents
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Abstract
一种含柠檬酸的溶液的处理方法，所述含柠檬酸的溶液含有柠檬酸、金属阳离子和其他杂质，该方法包括将含柠檬酸的溶液与阳离子交换树脂接触后得到溶液A，将溶液A经过改性阴离子交换树脂的色谱柱分离得到杂质溶液和柠檬酸溶液，所述改性阴离子交换树脂不与或基本不与柠檬酸根离子发生离子交换；将杂质溶液与淀粉质原料在淀粉酶下酶解得到含有淀粉质原料酶解清液和淀粉质原料酶解残渣的产物；在生成柠檬酸的条件下，将柠檬酸发酵菌接种至发酵培养基中进行发酵，得到柠檬酸发酵液，所述发酵培养基的碳源为酶解清液和酶解残渣以重量比2-19∶1的混合物。该方法所得柠檬酸溶液纯度高，产品收率高，且能有效利用柠檬酸提取过程中所产生的废水的处理方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种含柠檬酸的溶液的处理方法。
背景技术
柠檬酸是有机酸中第一大酸，由于物理、化学等方面的优异性能，广泛应用于医药、化学、电子、纺织、石油、皮革、建筑、摄影、塑料、铸造和陶瓷等工业领域。
现有技术中，柠檬酸普遍采用钙盐提取法从柠檬酸发酵液中获得，但是，钙盐提取法生产柠檬酸每生产一吨柠檬酸产品，就会产生约15％的不合格柠檬酸母液，这些母液含有残糖、蛋白、色素、金属阳离子等杂质，如不经过处理就无法再直接提取出合格产品。处理这种不合格母液，厂家常用的方法是将母液返回中和工序，和压滤清液一样重新提纯。该方法不仅收率低(小于65％)，而且重复消耗碳酸钙和硫酸等不可再生资源，并产生硫酸钙废渣和二氧化碳废气。同时，能源、相关化学品消耗等较高，经济效益低，也直接影响柠檬酸发酵液的处理。
为了解决上述问题，现有技术采用在柠檬酸母液中加入助凝剂或脱胶剂进行净化，并通过过滤除去母液中的杂质来进行柠檬酸的提纯。但该方法也消耗了一定的助凝剂或脱胶剂，且产品结晶率较低，只有35％左右。近年来，有报道提出采用离子交换树脂从柠檬酸发酵液中提取柠檬酸的方法，如CN1648257A所公开的“生产柠檬酸和(或)柠檬酸盐的方法”，提出了采用阴离子交换树脂构成的移动多级离子交换法从柠檬酸发酵液中提取柠檬酸，但是该分离过程由四个离子交换分离工作区间组成，生产工艺比较复杂，而且阴离子交换树脂需用碱进行再生。并且，采用离子交换提取柠檬酸的方法，在提取过程中会产生大量的废水，该废水中含有柠檬酸盐类、淀粉质、蛋白质、杂酸、生产菌体所分泌的酶、发酵残留物、葡萄糖、氨氮和脂肪等有机物及N，P，S等无机物。如果直接排放会造成水资源的浪费及COD的积累，无论从环境上、还是经济上考虑都是不理想的。
因此，迫切需要开发一种不仅能够以高收率、低成本处理柠檬酸溶液的方法，并且能够有效利用柠檬酸提取过程中所产生的废水的柠檬酸溶液的处理方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种高收率、低成本的含柠檬酸的溶液的处理方法。该方法不仅工艺简单，所得柠檬酸溶液纯度高，产品收率也高，并且，还能够有效利用柠檬酸提取过程中所产生的废水的处理方法。
本发明提供一种含柠檬酸的溶液的处理方法，所述含柠檬酸的溶液含有柠檬酸、金属阳离子和其他杂质，所述其他杂质包括残糖、蛋白、色素和无机酸中的一种或多种，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)将含柠檬酸的溶液与阳离子交换树脂接触，接触的条件使得接触后所得的溶液A中的金属阳离子浓度不超过5ppm；
(2)在色谱分离条件下，将所述溶液A从固定相为改性阴离子交换树脂的色谱分离柱的一端引入到色谱分离柱中，使溶液A中的柠檬酸和其他杂质吸附到所述树脂上，用洗脱剂进行淋洗，洗脱剂的用以及所述色谱分离条件使得所述溶液A中含有的其他杂质和柠檬酸先后从树脂上解吸，得到杂质溶液和柠檬酸溶液，所述改性阴离子交换树脂不与或基本不与柠檬酸根离子发生离子交换；
(3)将得到的杂质溶液与粉碎后的淀粉质原料在淀粉酶存在下接触，得到含有淀粉质原料酶解清液和淀粉质原料酶解残渣的酶解后的产物；
(4)在生成柠檬酸的条件下，将柠檬酸发酵菌接种至发酵培养基中进行发酵，得到柠檬酸发酵液，所述发酵培养基的碳源为淀粉质原料酶解清液和淀粉质原料酶解残渣以重量比2-19∶1的混合物，至少部分所述淀粉质原料酶解清液和淀粉质原料酶解残渣由上述酶解后的产物进行或不进行固液分离后得到。
本发明提供的含柠檬酸的溶液的处理方法的优点在于：该处理方法不消耗助凝剂和脱胶剂，不重复消耗碳酸钙等资源、阴离子树脂不需要再生、设备投资及运行费用低，具有明显的经济效益；脱除金属阳离子后的柠檬酸溶液(即所述溶液A)进入色谱柱后直接用洗脱剂进行淋洗，从而将柠檬酸与其它杂质分开，仅消耗少量的洗脱剂，且工艺简单；该方法得到的柠檬酸溶液纯度高，产品收率也高；另外，洗脱得到的含其它杂质的洗脱液(以下简称杂质溶液)能够得到重复利用，不仅降低了柠檬酸的生产成本、减少对环境的污染；并且在发酵的种子生长过程中，由于杂质溶液中存在一些在发酵过程中微生物所需要的蛋白质类等有机质，因此，有助于减少种子自身合成这些物质的量，同时也有助于节省氮碳源；另外，在发酵过程中，由于一部分有机酸物质存在，其代谢平衡能抑制乌头酸的产生、草酰乙酸的量的增加，这两种物质同时促进柠檬酸的积累。
具体实施方式
本发明提供一种含柠檬酸的溶液的处理方法，所述含柠檬酸的溶液含有柠檬酸、金属阳离子和其他杂质，所述其他杂质包括残糖、蛋白、色素和无机酸中的一种或多种，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)将含柠檬酸的溶液与阳离子交换树脂接触，接触的条件使得接触后所得的溶液A中的金属阳离子浓度不超过5ppm；
(2)在色谱分离条件下，将所述溶液A从固定相为改性阴离子交换树脂的色谱分离柱的一端引入到色谱分离柱中，使溶液A中的柠檬酸和其他杂质吸附到所述树脂上，用洗脱剂进行淋洗，洗脱剂的用量以及所述色谱分离条件使得所述溶液A中含有的其他杂质和柠檬酸先后从树脂上解吸，得到杂质溶液和柠檬酸溶液，所述改性阴离子交换树脂不与或基本不与柠檬酸根离子发生离子交换；
(3)将得到的杂质溶液与粉碎后的淀粉质原料在淀粉酶存在下接触，得到含有淀粉质原料酶解清液和淀粉质原料酶解残渣的酶解后的产物；
(4)在生成柠檬酸的条件下，将柠檬酸发酵菌接种至发酵培养基中进行发酵，得到柠檬酸发酵液，所述发酵培养基的碳源为淀粉质原料酶解清液和淀粉质原料酶解残渣以重量比2-19∶1的混合物，至少部分所述淀粉质原料酶解清液和淀粉质原料酶解残渣由上述酶解后的产物进行或不进行固液分离后得到。
根据本发明的处理方法，所述含柠檬酸的溶液可以为本领域所公知的各种含柠檬酸的溶液。具体地，可以为柠檬酸发酵液、柠檬酸发酵液经过滤后的柠檬酸发酵液清液、柠檬酸发酵液经浓缩过滤除去了沉淀物后所得的溶液和柠檬酸母液的一种或多种。所述柠檬酸母液可以为各种由柠檬酸发酵液提取柠檬酸后的柠檬酸母液，例如可以为由柠檬酸发酵液经钙盐法工艺提取柠檬酸后产生的母液。
所述柠檬酸发酵液可以为采用本领域所公知的各种发酵条件而得到的柠檬酸发酵液。具体地，可以为薯干粉、木薯粉、玉米粉、马铃薯粉、淀粉和葡萄糖母液等原料发酵而得到的发酵液。所述柠檬酸发酵液优选为由本发明处理方法所得到的柠檬酸发酵液。
根据本发明的处理方法，由于只要根据所述含柠檬酸的溶液中柠檬酸的量，使用适当量的阳离子交换树脂以及改性阴离子交换树脂就能够得到所需的柠檬酸溶液和杂质溶液，因此，所述含柠檬酸的溶液的柠檬酸浓度可以是宽范围的。具体地，所述含柠檬酸的溶液的柠檬酸浓度可以为大于10mg/mL。但是从成本以及操作性上来考虑，所述含柠檬酸的溶液的柠檬酸浓度优选为50-700mg/mL，更优选为100-600mg/mL。
在本发明中，根据需要，该处理方法还包括所述阳离子交换树脂与所述含柠檬酸的溶液接触前，将所述含柠檬酸的溶液进行加热，以使其粘度降低，提高流动性。所述的加热的方法为本领域所公知的各种方法。例如，将所述含柠檬酸的溶液加热升温到70-80℃，以使所述含柠檬酸的溶液的粘度降至7-9mPa·s。提高所述含柠檬酸的溶液的温度，能够降低所述含柠檬酸的溶液的粘度以提高后续操作的便利性。
根据本发明的处理方法，所述含柠檬酸的溶液中含有金属阳离子，由于金属阳离子的存在会导致得到的柠檬酸的产品外观差，以及影响本发明后续发酵过程中的发酵质量。例如Fe3+的存在会导致柠檬酸产品颜色变黄；K+阳离子的大量存在会导致细胞毒性，从而降低发酵的质量。因此，在本发明中，优先通过将含柠檬酸的溶液与阳离子交换树脂接触，使所得的溶液A中金属阳离子的含量降低。将含柠檬酸的溶液与阳离子交换树脂接触后得到的溶液A中金属阳离子的含量越低越好。但是由于为了达到使溶液A中金属阳离子的含量更低，其接触的条件，例如阳离子交换树脂的使用量、接触的时间等会增加，也就是说其成本、操作的复杂性等都会增加。因此，综合从阳离子的去除量、成本以及操作性上考虑，所述接触的条件使得接触后所得的溶液A中的金属阳离子浓度不超过5ppm；优选地，所述接触的条件使得接触后所得的溶液A中的金属阳离子浓度不超过1ppm。
由于在本发明中金属离子要通过上述方法去除，因此，其本身对金属阳离子的浓度没有特别的要求，只需根据所述含柠檬酸的溶液中含有金属阳离子的量来选择适当的分离条件都可以获得所述溶液A，但是，金属离子的浓度太高会导致使用的阳离子交换树脂的量增加，从而会造成柠檬酸的损失。因此，一般情况下，优选所述含柠檬酸的溶液中的金属阳离子的浓度可以为5-350ppm；更优选地，所述含柠檬酸的溶液中的金属阳离子的浓度为50-150ppm。所述金属阳离子为Fe3+、Ca2+、Mg2+、K+和Na+中的一种或多种。
上述接触的条件具体可包括接触的方式、阳离子交换树脂的使用量、阳离子交换树脂的种类、阳离子交换树脂的交换容量、接触的时间以及接触的温度。
所述含柠檬酸的溶液与阳离子交换树脂接触的方式可以从本领域常用的各种方式中来选择。具体地，例如让含柠檬酸的溶液以一定的速度通过阳离子交换树脂柱；将阳离子交换树脂与含柠檬酸的溶液进行均匀混合等方式。由于让含柠檬酸的溶液以一定的速度通过阳离子交换树脂柱的接触方式具有分离效果好、分离稳定等优点，因此，被本发明所优选。
所述阳离子交换树脂的用量可以根据含柠檬酸的溶液中金属阳离子的量来选择。一般情况下，只要使用的所述阳离子交换树脂的的总工作交换容量大于金属阳离子的量即可。从能够很好的去除金属阳离子的方面考虑，优选相对于金属阳离子的量，使用的所述阳离子交换树脂的的总工作交换容量大大过量。其具体选择的方法为本领域技术人员所公知。
另外，在规定了含柠檬酸的溶液中金属阳离子的浓度的情况下，可以直接根据含柠檬酸的溶液的体积来选择。例如，在本发明的优选方案中，所述含柠檬酸的溶液含有金属阳离子的浓度为5-350ppm的情况下，所述阳离子交换树脂的体积与含柠檬酸的溶液的体积的比为1∶2-9；在保证交换效果的前提下，为了减低成本，优选所述阳离子交换树脂的体积与含柠檬酸的溶液的体积的比为1∶3-7。
本发明对所述阳离子交换树脂的工作交换容量没有特殊的限制，只要能很好地除去含柠檬酸的溶液中的金属离子即可，但为了节省离子交换过程中的物耗、能耗和时间，优选使用具有较大交换容量的阳离子交换树脂，优选情况下，所述阳离子交换树脂的工作交换容量大于3mmol/g，更优选为4-10mmol/g。
在本发明中所述阳离子交换树脂与含柠檬酸的溶液的接触过程中，对所述阳离子交换树脂的种类没有特别的限制，只要满足能够很好的吸附溶液中的金属阳离子即可。因此，所述的阳离子交换树脂可以为本领域所公知的强酸性阳离子交换树脂和/或弱酸性阳离子交换树脂。所述强酸性阳离子交换树脂可以为强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂和/或强酸性丙烯酸阳离子交换树脂；所述弱酸性阳离子交换树脂可以为弱酸性苯乙烯系阳离子交换树脂和/或弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂。本发明优选所述阳离子交换树脂为强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂和/或弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂，进一步优选为强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，更优选为001×7强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂。所述强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂的交换基团为-SO3H。所述阳离子交换树脂可以为大孔型阳离子交换树脂，也可以凝胶型阳离子交换树脂，优选为大孔型阳离子交换树脂。
所述阳离子交换树脂与含柠檬酸的溶液接触的时间可以在很大范围内变动。为了保证含柠檬酸的溶液中的金属阳离子的全部或几乎全部被阳离子交换树脂所吸附，所述阳离子交换树脂与含柠檬酸的溶液接触的时间至少为30min；在保证吸附效果的同时，从效率上考虑，优选所述阳离子交换树脂与含柠檬酸的溶液接触的时间为30-60min。
在本发明中，对所述阳离子交换树脂与含柠檬酸的溶液的接触温度没有特别的限制，可以为本领域所公知的各种温度。具体地，接触温度为30-80℃；优选地，接触温度为40-70℃。
根据本发明的处理方法，所述溶液A与改性阴离子交换树脂的接触方式可以从本领域常用的各种方法中进行选择。例如让含柠檬酸的溶液通过改性阴离子交换树脂层；由于让含柠檬酸的溶液通过改性阴离子交换树脂层的分离效果好，因此被本发明优选。另外，让含柠檬酸的溶液通过改性阴离子交换树脂层可以在常压下进行，也可以在加压下进行。压力的大少可以根据实际情况来选择，选择的方法为本领域技术人员所公知。
根据本发明的处理方法，所述改性阴离子交换树脂不与或基本不与柠檬酸根离子发生离子交换，其是通过由于各组分在性质和结构上的差异，与树脂发生作用的大小、强弱也有差异，因此在同一推动力作用下(即洗脱剂的洗脱力)，不同组分在树脂柱中的滞留时间有长有短，从而按先后不同的次序从树脂柱中流出。从而把柠檬酸与残糖、蛋白、色素等杂质分开，得到柠檬酸溶液和杂质溶液。所述柠檬酸溶液为纯净或几乎纯净的柠檬酸溶液。所述杂质溶液为含有残糖、蛋白、色素等其它杂质的洗脱液。在本发明中，所述柠檬酸溶液为越纯净越好，但是由于为了得到绝对纯净的柠檬酸溶液会大大的加大实际操作的复杂性以及增加处理成本，因此，在不影响后续处理的情况下，允许所述柠檬酸溶液中含有少量的其它杂质。所述少量的其它杂质可以为残糖、蛋白、色素等。
另外，在本发明中，所述杂质溶液可以理解为所有洗脱液中除去所述柠檬酸溶液后的洗脱液。因此，在本发明的实际操作过程中，只需监测洗脱液中的柠檬酸即可。该监测方法只要能够检测流出的洗脱液中柠檬酸的纯度就没有特别的限制。所述柠檬酸溶液的纯度可以为色谱纯度或重量纯度等。所述色谱纯度为采用高压液相色谱的方法所测定的纯度；所述柠檬酸溶液的重量纯度为柠檬酸溶液中柠檬酸的含量/柠檬酸溶液干物重×100％。由于高压液相色谱的方法具有快速、灵敏和稳定的特点，因此，为本发明所优选。其具体监测方法为根据高压液相色谱测定的色谱纯度值来判断所述柠檬酸溶液的起始收集时间和结束收集时间。所述起始收集时间和结束收集时间可以根据所需得到的柠檬酸溶液的重量纯度来选择。
一般情况下，在使用高压液相色谱的方法来检测洗脱液中柠檬酸的色谱纯度时，若想得到柠檬酸溶液的重量纯度为90％以上的柠檬酸溶液时，其起始收集时间的色谱纯度可以为85％以上，其结束收集时间的色谱纯度只要在85％以上即可；为了进一步提高得到的柠檬酸溶液的重量纯度，可根据所需柠檬酸溶液的重量纯度来适当选择起始收集时间的色谱纯度以及结束收集时间的色谱纯度。收集满足上述条件的洗脱液得到所述柠檬酸溶液，将其它洗脱液例如包括在所述柠檬酸溶液以前和以后流出的洗脱液收集得所述杂质溶液。
根据本发明的处理方法，由于所述改性阴离子交换树脂不与或基本不与柠檬酸根离子发生离子交换，其是通过由于各组分在性质和结构上的差异，与树脂发生作用的大小、强弱也有差异，因此在同一推动力作用下(即洗脱剂的洗脱力)，不同组分在树脂柱中的滞留时间有长有短，从而按先后不同的次序从树脂柱中流出。从而把柠檬酸与残糖、蛋白、色素等杂质分开，得到所述柠檬酸溶液和所述杂质溶液。因此，只要满足上述条件的改性阴离子交换树脂都可使用。为了更好的保证所述改性阴离子交换树脂不与或基本不与柠檬酸根离子发生离子交换，优选所述改性阴离子交换树脂中OH-的浓度不超过0.18毫摩尔/克干树脂；更优选为所述改性阴离子交换树脂中OH-的浓度不超过0.1毫摩尔/克干树脂。所述改性阴离子交换树脂的功能基团可以为各种能吸附所述柠檬酸和所述其他杂质并且不与柠檬酸和所述其他杂质发生离子交换的基团，例如，可以为SO4 2-、NO3 2-、CO3 2-、Cl-和PO4 3-等中的一种或多种。本发明中，所述功能基团是指与阴离子交换树脂的骨架树脂相键连的官能团。
上述改性阴离子交换树脂可以通过各种方法获得，例如，可以通过将常规的各种阴离子交换树脂与硫酸、硝酸、碳酸和盐酸中的一种接触，以将阴离子交换树脂中的阴离子转换成SO4 2-、NO3 2-、CO3 2-、Cl-和PO4 3-根离子中的一种或多种，并且，所述接触的条件使得所述改性阴离子交换树脂中OH-的浓度不超过0.18毫摩尔/克干树脂，优选为不超过0.1毫摩尔/克干树脂。为保证树脂的交换功能，常规的阴离子交换树脂的OH-浓度一般不低于10毫摩尔/克干树脂，通常为10-20毫摩尔/克干树脂。根据本发明的上述实施方式，通过在阴离子交换树脂上引入交换能力很强的基团，并且控制所述改性阴离子交换树脂中OH-的浓度不超过0.18毫摩尔/克干树脂，使得该改性阴离子交换树脂在与含柠檬酸的溶液接触时，不发生或基本不发生交换作用，而只发生吸附作用。
所述阴离子交换树脂可以为本领域所公知的各种阴离子交换树脂。可以为大孔型阴离子交换树脂和/或凝胶型阴离子交换树脂中的一种或多种，优选为大孔型阴离子交换树脂；更优选为大孔弱碱性苯乙烯阴离子交换树脂和/或大孔弱碱性丙烯酸系阴离子交换树脂中的一种或多种；进一步优选为D301T大孔弱碱性苯乙烯阴离子交换树脂、D301R大孔弱碱性苯乙烯阴离子交换树脂、D382大孔弱碱性苯乙烯阴离子交换树脂、D311大孔弱碱性丙烯酸阴离子交换树脂、D318大孔弱碱性丙烯酸系阴离子交换树脂和D815大孔丙烯酸性阴离子交换树脂的一种或多种；更进一步优选为D318大孔弱碱性丙烯酸系阴离子交换树脂。
根据本发明的处理方法，所述改性阴离子交换树脂的用量可以根据溶液A中的柠檬酸浓度和体积来选择。例如根据溶液A中的柠檬酸浓度和体积可计算出柠檬酸的重量，通过柠檬酸的重量来选择改性阴离子交换树脂的用量，该用量只要能够达到柠檬酸根离子能够很好的被改性阴离子交换树脂吸附即可。具体地，溶液A中的柠檬酸的重量与改性阴离子交换树脂的体积的比可以为0.1-0.6g/mL，优选为0.15-0.45g/mL，特别优选为0.15-0.35g/mL。
根据本发明的处理方法，为了更好的使溶液A中的柠檬酸以及其它杂质能够很好的被改性的阴离子交换树脂所吸附，进而有效的使柠檬酸和其它杂质分离开。所述洗脱剂在改性的阴离子交换树脂中需要一定的停留时间。在本发明中，为了使溶液A中的柠檬酸以及其它杂质能够很好的分离开，一般所述洗脱剂在改性的阴离子交换树脂中的停留时间至少为5分钟；在保证分离效果的前提下，从提供效率上考虑，优选所述洗脱剂在改性的阴离子交换树脂中的停留时间为10-30分钟。
在本发明中，对所述改性阴离子交换树脂与溶液A的接触温度没有特别的限制，可以为本领域所公知的各种温度。具体地，接触温度为30-80℃；优选地，接触温度为40-70℃。
根据本发明的处理方法，所述洗脱剂的用量可以根据所述溶液A中柠檬酸的重量来选择。具体地，所述溶液A中柠檬酸的重量与所述洗脱剂的体积的比为0.02-0.5g/mL；在保证溶液A中的柠檬酸和其它杂质分离开，并且溶液A中的柠檬酸和其它杂质全部或其本全部被洗脱下来的前提下，从成本以及效率上考虑，优选所述溶液A中柠檬酸的重量与所述洗脱剂的体积的比0.05-0.3g/mL。
根据本发明的处理方法，所述洗脱剂的浓度可以在很大范围内改变。一般情况下，所述洗脱剂的浓度为100-10000ppm的硫酸水溶液，优选为浓度500-2000ppm的硫酸水溶液。本发明的发明人发现，在该过程中所述酸的浓度若高于2000ppm，则随着酸浓度的增高，柠檬酸的收率仅有微弱的提高，而且由于洗脱是一个放热过程，当酸的溶液的浓度高于8000ppm特别高于10000ppm时，柱温可能过高，从而可能会影响离子交换树脂的使用寿命；而且，洗脱液浓度提高时，一方面会增加酸的用量，增加洗脱产物的杂质成分，所以，优选为酸的溶液的浓度为500-2000ppm。
根据本发明的处理方法，将得到的杂质溶液与粉碎后的淀粉质原料在淀粉酶存在下接触，得到含有淀粉质原料酶解清液和淀粉质原料酶解残渣的酶解后的产物；在生成柠檬酸的条件下，将柠檬酸发酵菌接种至发酵培养基中进行发酵，得到柠檬酸发酵液，所述发酵培养基的碳源为淀粉质原料酶解清液和淀粉质原料酶解残渣以重量比2-19∶1的混合物，至少部分所述淀粉质原料酶解清液和淀粉质原料酶解残渣由上述酶解后的产物进行或不进行固液分离后得到。采用上述方法得到的柠檬酸发酵液具有酸度高、糖利用率高、液体浊度低等优点。
根据本发明的处理方法，上述杂质溶液、粉碎后的淀粉质原料以及淀粉酶的用量只要能够满足得到的酶解后的产物适合柠檬酸发酵的要求即可。具体地，以每克粉碎后的淀粉质原料的干重计，所述淀粉酶的用量为15-40个酶活力单位，所述杂质溶液的用量为1-5克；优选地，所述淀粉酶的用量为20-30个酶活力单位，所述杂质溶液的用量为2-4克。
本发明所述酶的酶活力单位的定义为：在pH值为6.0、温度为70℃的条件下，1分钟将1毫克淀粉转化为还原糖所需的酶量为一个酶活力单位。
所述酶解的温度可以在很大范围内改变，优选为70-115℃，更优选为90-95℃。所述酶解的时间理论上越长越好，考虑到设备利用率，优选所述酶解的时间为90-150分钟，更优选为100-120分钟。所述酶解的pH值可以在很大范围内改变，优选为5.0-7.0，更优选pH值为5.8-6.2。
淀粉酶是指能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，所述淀粉酶一般包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶。
α-淀粉酶又称淀粉1，4-糊精酶，它能够任意地、不规则地切开淀粉链内部的α-1，4-糖苷键，将淀粉水解为麦芽糖、含有6个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖。生产此酶的微生物主要有枯草杆菌、黑曲霉、米曲霉和根霉。
β-淀粉酶又称淀粉1，4-麦芽糖苷酶，能够从淀粉分子非还原性末端切开1，4-糖苷键，生成麦芽糖。此酶作用于淀粉的产物是麦芽糖与极限糊精。此酶主要由曲霉、根霉和内孢霉产生。
糖化酶又称淀粉α-1，4-葡萄糖苷酶，此酶作用于淀粉分子的非还原性末端，以葡萄糖为单位，依次作用于淀粉分子中的α-1，4-糖苷键，生成葡萄糖。糖化酶作用于支链淀粉后的产物有葡萄糖和带有α-1，6-糖苷键的寡糖；作用于直链淀粉后的产物几乎全部是葡萄糖。此酶产生菌主要是黑曲霉(左美曲霉、泡盛曲霉)、根霉(雪白根酶、德氏根霉)、拟内孢霉、红曲霉。
异淀粉酶又称淀粉α-1，6-葡萄糖苷酶、分枝酶，此酶作用于枝链淀粉分子分枝点处的α-1，6-糖苷键，将枝链淀粉的整个侧链切下变成直链淀粉。此酶产生菌主要是嫌气杆菌、芽孢杆菌及某些假单孢杆菌等细菌。
根据本发明，优选使用α-淀粉酶和/或异淀粉酶。
按照本发明，所述淀粉质原料可以为本领公知的各种可以用于酶解、发酵制备柠檬酸的含有淀粉的原料，例如，可以选自玉米、薯类(如木薯)和小麦中的一种或多种。优选地，所述含有淀粉的原料为玉米。
根据本发明的处理方法，所述发酵培养基的碳源为淀粉质原料酶解清液和淀粉质原料酶解残渣以重量比2-19∶1的混合物。优选地，以发酵培养基的总重量为基准，所述淀粉质原料酶解残渣的含量为5-30重量％，更优选地，所述淀粉质原料酶解残渣的含量为10-25重量％。所述淀粉质原料酶解残渣的含水量可以在很大范围内改变，优选情况下，所述淀粉质原料酶解残渣的固含量为5-60重量％，更优选为20-40重量％。
在本发明中，当所述含有淀粉质原料酶解清液和淀粉质原料酶解残渣的酶解后的产物中的淀粉质原料酶解残渣的含量在上述范围内时，可以直接将所述含有淀粉质原料酶解清液和淀粉质原料酶解残渣的酶解后的产物作为发酵培养基使用。也可以将上述所述含有淀粉质原料酶解清液和淀粉质原料酶解残渣的酶解后的产物经固液分离后得到淀粉质原料酶解清液和淀粉质原料酶解残渣，在按照上述比例配比得到发酵培养基。所述固液分离的方法与装置为本领域技术人员所公知，例如，压滤机或离心机。
根据本发明，所述发酵培养基中各组分的含量可以在很大范围内改变。优选地，所述发酵培养基中碳源(糖)含量为13-21重量％，氮源含量为0.06-0.14重量％，磷源含量为0.005-0.07重量％，无机盐含量0.1-2.6重量％，水含量为77-86重量％。
优选所述发酵培养基中总糖为13-18重量％，更优选发酵培养基中总糖为14-16重量％。术语总糖是指发酵培养基中所含糖的总含量。
优选情况下，还可以根据需要向所述发酵培养基中添加补充氮源，所述补充氮源(如尿素)的添加量可以为发酵培养基总重量的0.01-0.05重量％。根据本发明，所述补充氮源的种类为本领域技术人员所公知，例如，所述补充氮源可以为尿素、硫酸铵和硝酸铵等中的一种或多种。
根据本发明的处理方法，所述柠檬酸发酵菌可以为本领域所公知的柠檬酸发酵菌。具体地，可以为黑曲霉、酵母或细菌。优选地，所述柠檬酸发酵菌为黑曲霉。本发明发酵所使用的黑曲霉可以为商购的黑曲霉固体制剂或黑曲霉菌种，例如，黑曲霉Co827(上海工业微生物研究所)和黑曲霉T01(天津工业微生物所)。
本发明中，所述柠檬酸发酵菌的接种量可以在很大范围内改变，优选情况下，以每毫升发酵培养基为基准，发酵菌的接种量为5×104-2.5×105个菌落形成单位，优选1×105-1.5×105个菌落形成单位。
所述菌落形成单位的定义为将稀释后的一定量的菌液通过浇注或涂布的方法，让其内的微生物单细胞一一分散在培养基平板上，待培养后，每一活细胞就形成一个菌落。即每毫升菌液中含有的单细胞的数目。
所述菌落形成单位可以通过本领域公知的方法测定，例如，通过血球计数板计数。
根据本发明的处理方法，可以采用常规的方法接种，例如，在被接种至所述发酵培养基中之前，将所述发酵菌经过种子培养处理，之后将得到的种子液加入到所述发酵培养基中。发酵菌种子培养的程度可以通过取样显微镜镜检、酸度测定和pH测定对黑曲霉的生长进行观察，当pH在2.0-2.5、酸度0.5-2.0％、菌球大小均匀、菌丝粗壮伸出时停止培养。
上述种子培养的条件可以在很大范围内改变，例如所述培养的条件可以包括：培养的温度可以为30-45℃，pH值可以为2-6，通气量可以为0.1-0.5体积：体积·分钟，培养的时间可以为20-40小时；更优选的情况下，所述培养的条件可以包括：培养的温度可以为34-38℃，pH值可以为2.5-4.5，通气量可以为0.15-0.4体积：体积·分钟，所述培养的时间可以为22-30小时。
在本发明中，所述种子培养基可以为本领域所公知的各种柠檬酸种子培养基。优选的情况下，使用上述得到的淀粉质原料酶解液(即，酶解后的产物)，以该淀粉质原料酶解液的总量为基准，淀粉质原料酶解液中的总糖为8-14重量％、以氮元素计，氮源为0.1-0.5重量％；优选地，该淀粉质原料酶解液中的总糖为9-12重量％、氮源为0.1-0.25重量％。根据需要，可采用所述杂质溶液或所述淀粉质原料酶解清液对淀粉质原料酶解液进行稀释，使其总糖达到所需的范围。根据需要，也可以向种子培养基中添加补充氮源。所述补充氮源的添加量可以为培养基总重量的0.01-0.05重量％。所述补充氮源的种类为本领域技术人员所公知，例如，所述补充氮源可以为尿素、硫酸铵和硝酸铵等中的一种或多种。
根据本发明，所述将柠檬酸发酵菌接种至所述发酵培养基中进行发酵的条件可以在很大范围内改变，例如所发酵的条件可以包括：培养的温度可以为30-42℃，pH值可以为1-6，通气量可以为0.05-0.13体积：体积·分钟，培养的时间可以为45-65小时；更优选的情况下，所述培养的条件可以包括：培养的温度可以为34-39℃，pH值可以为1.5-3.0，通气量可以为0.06-0.09体积：体积·分钟，所述培养的时间可以为50-60小时。
术语“通气量”一般以通气比来表示，通常以每分钟内通过单位体积培养液的空气体积比来表示(V/V·min)，例如通气比为1∶0.1-1，简称通气量为0.01-1体积：体积·分钟。
所述培养的设备为本领域技术人员所公知，例如，可以使用发酵罐进行培养。
根据本发明的处理方法，该方法还包括步骤(1)中的含柠檬酸的溶液的部分或全部来自于步骤(4)得到的柠檬酸发酵液。
在本发明中，可以通过将步骤(4)得到的柠檬酸发酵液部分或全部直接作为步骤(1)中的含柠檬酸的溶液来使用，也可以将上述柠檬酸发酵液经钙盐法工艺提取柠檬酸后产生的母液的部分后全部作为步骤(1)中的含柠檬酸的溶液来使用；或者，将步骤(4)得到的柠檬酸发酵液经过滤后得到的柠檬酸发酵液清液的部分后全部作为步骤(1)中的含柠檬酸的溶液来使用；将步骤(4)得到的柠檬酸发酵液经浓缩过滤除去了颗粒杂质和沉淀物后所得的溶液的部分或全部作为步骤(1)中的含柠檬酸的溶液来使用。
实施例
下面通过具体实施例，对本发明进行详细的说明，但本发明并不仅仅限制于下述实施例。
以下实施例中柠檬酸的浓度和色谱纯度采用高效液相色谱法进行测定，高效液相色谱购自日本岛津公司。
以下实施例中含柠檬酸的溶液中柠檬酸含量＝柠檬酸的浓度×含柠檬酸的溶液的体积。
以下实施例中柠檬酸溶液中柠檬酸的含量＝柠檬酸的浓度×柠檬酸溶液的体积。
以下实施例中柠檬酸的收率为得到的柠檬酸溶液中柠檬酸的含量/含柠檬酸的溶液中柠檬酸含量×100％。
柠檬酸溶液的重量纯度＝柠檬酸溶液中的柠檬酸含量/柠檬酸溶液的干物重×100％。
以下实施例中所用柠檬酸母液可以通过以下方法制得：将0.872千克玉米用SFSP系列锤片式粉碎机进行粉碎，得到平均颗粒直径为2毫米(采用美国PPS公司的Accu Sizer TM 780光学粒径检测仪测定)的0.871千克粉碎产物；液化温度控制在94±1℃，将粉碎产物与淀粉酶混合进行喷射液化，维持时间为50分钟，所述酶解的pH值维持在5.7-6.2；加入活力≥20000u/ml的α-淀粉酶0.7g/kg玉米粉(购自诺维信公司)；温度降至38℃，接种生物量为18g/L(母液)的黑曲霉，所得混合物在37℃下于发酵罐中搅拌培养65小时，得到发酵混合产物，并过滤得到5升柠檬酸的压滤清液，该柠檬酸压滤清液可以经钙盐法工艺提取柠檬酸后产生的浓度为510mg/mL的柠檬酸母液，也可以为色谱法工艺提取出柠檬酸后产生的浓度为510mg/mL的柠檬酸母液。
根据GB 1987-2007标准检测以下实施例中所得柠檬酸发酵液的浓度(简称酸度)，计算柠檬酸的转化率，转化率(％)＝柠檬酸发酵液的浓度(简称酸度)×柠檬酸发酵液的体积/总糖的重量×100％。
实施例1
该实施例用于说明本发明提供的含柠檬酸的溶液的处理方法。
(1)改性阴离子交换树脂的制备
将500mL的D318大孔弱碱性丙烯酸系阴离子交换树脂(江苏苏青水处理工程集团有限公司，OH-含量为15毫摩尔/克干树脂)与2000mL浓度为10重量％的硫酸水溶液在30℃下接触2.0h，将接触后的阴离子交换树脂取出，用离心机甩干，得到改性阴离子交换树脂。该改性阴离子交换树脂的OH-含量为0.05毫摩尔/克干树脂。
(2)含柠檬酸的溶液的处理
将200mL柠檬酸浓度为510mg/mL的柠檬酸母液加热至75℃，使粘度降低至8-9mPa·S，其中，柠檬酸母液中金属阳离子的浓度为140ppm。将处理后的柠檬酸母液在60℃下通过50mL的001×7强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂层(江苏苏青水处理工程集团有限公司，工作交换容量为4mmol/g)，控制流速使得柠檬酸母液与阳离子交换树脂的接触时间为30min，使阳柱流出液金属氧离子为0.5ppm，得到溶液A。所得溶液A中柠檬酸的重量为100g，再将得到的溶液A通过固定相为500mL由(1)所制得的改性阴离子交换树脂的色谱分离柱中(直径为3.5cm，长度为100cm)，控制流速使得溶液A与改性阴离子交换树脂层的接触时间为20min，使溶液A中的柠檬酸和其他杂质吸附到改性阴离子交换树脂上，然后用2000mL浓度为500ppm的稀硫酸溶液在50℃下进行洗脱，控制流速使得洗脱剂在色谱分离柱中的停留时间10min，在洗脱过程中，当流出的洗脱液的柠檬酸色谱纯度高于90％时开始收集，当流出的洗脱液的柠檬酸色谱纯度低于90％时停止柠檬酸溶液的收集，得到柠檬酸溶液，纯度为94.9重量％，柠檬酸的收率为95.1重量％。继续洗脱直至其它杂质都被洗出后，合并柠檬酸溶液之前和之后流出的洗脱液，得到杂质溶液。
(3)发酵培养基的制备
将收获的100重量份玉米进行粉碎，得到平均粒子直径为400微米的粉碎产物。将粉碎后的产物与300重量份的步骤(2)中得到的杂质溶液和淀粉酶(相当于每克粉碎的玉米使用25个酶活力单位的淀粉酶，诺维信公司，a-淀粉酶)混合均匀后，进入喷射器，在95℃、pH为6.0的条件下酶解100分钟后得到酶解液，将部分的酶解液通过用液压式板框压滤机进行压滤，分离出酶解清液和淀粉质原料酶解残渣。将酶解清液和淀粉质原料酶解残渣(固含量为20重量％)按照90∶10的重量比进行混合均匀后灭菌，并加入到发酵罐中，得到发酵培养基。其中发酵培养基中的总糖为14.5重量％，氮源的含量为0.09重量％。
(4)柠檬酸发酵
使用步骤(2)中得到的杂质溶液将步骤(3)中得到的酶解液稀释至总糖的11重量％，并投入种子罐，加入尿素，尿素的加入量(以氮源计)为种子罐培养液总重量的0.01％，加热到121℃消毒，维持30分钟后快速降温至36℃，接入黑曲霉菌种(黑曲霉T01，天津工业微生物所，接种量为：每克酶解清液105个菌落形成单位)，在36℃、0.2体积：体积·分钟的通气条件下进行菌种培养；通过取样显微镜镜检、酸度测定和pH测定对黑曲霉的生长进行观察，当pH在2.0、酸度1％、菌球大小均匀、菌丝粗壮伸出时，停止培养。
将上述培养的黑曲霉菌种加入到步骤(3)中的发酵罐中进行发酵，加入尿素，尿素的加入量(以氮源计)为种子罐培养液总重量的0.05％，黑曲霉菌种的接种量为：每克发酵培养基1.5×105个菌落形成单位，发酵条件包括温度为35℃，pH值为3，通气量为0.06体积：体积·分钟，发酵进行到第60小时后，得到柠檬酸发酵液。
发酵酸度和柠檬酸的转化率的结果如表1所示。
实施例2
该实施例用于说明本发明提供的含柠檬酸的溶液的处理方法。
(1)改性阴离子交换树脂的制备
将300mL的SQD815大孔丙烯酸性阴离子交换树脂(江苏苏青水处理工程集团有限公司，OH-含量为18毫摩尔/克干树脂)与900mL浓度为8重量％的硫酸水溶液在40℃下接触2.0h，将接触后的阴离子交换树脂取出，在0.095MPa下真空干燥，得到改性阴离子交换树脂。该改性阴离子交换树脂的OH-含量为0.05毫摩尔/克干树脂。
(2)含柠檬酸的溶液的处理
将138mL柠檬酸浓度为510mg/mL的柠檬酸母液加热至80℃，使粘度降低至8-9mPa·S，其中，柠檬酸母液中金属阳离子的浓度为80ppm。将处理后的柠檬酸母液在50℃下通过28mL的001×7强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂层(江苏苏青水处理工程集团有限公司，工作交换容量为8mmol/g)，控制流速使得柠檬酸母液与阳离子交换树脂的接触时间为60min，使阳柱流出液金属氧离子为0.1ppm，得到溶液A。所得溶液A中柠檬酸的重量为70g，再将得到的溶液A通过固定相为300mL由(1)所制得的改性阴离子交换树脂的色谱分离柱中(直径为3.5cm，长度为100cm)，控制流速使得溶液A与改性阴离子交换树脂层的接触时间为50min，使溶液A中的柠檬酸和其他杂质吸附到改性阴离子交换树脂上，然后用700mL浓度为800ppm的稀硫酸溶液在50℃下进行洗脱，洗脱剂在色谱分离柱中的停留时间20min，当流出的洗脱液的柠檬酸色谱纯度高于90％时开始收集，当流出的洗脱液的柠檬酸色谱纯度低于于90％时停止柠檬酸溶液的收集，得到柠檬酸溶液，纯度为95.0重量％，柠檬酸的收率为93.6重量％。继续洗脱直至其它杂质都被洗出后，合并柠檬酸溶液之前和之后流出的洗脱液，得到杂质溶液。
(3)发酵培养基的制备
将收获的100重量份玉米进行粉碎，得到平均粒子直径为400微米的粉碎产物。将粉碎后的产物与200重量份的步骤(2)中得到的杂质溶液和淀粉酶(相当于每克粉碎的玉米使用20个酶活力单位的淀粉酶，诺维信公司，a-淀粉酶)混合均匀后，进入喷射器，在95℃、pH为5.9的条件下酶解90分钟后得到酶解液，将部分的酶解液通过用液压式板框压滤机进行压滤，分离出酶解清液和淀粉质原料酶解残渣。将酶解清液和淀粉质原料酶解残渣(固含量为30重量％)按照85∶15的重量比进行混合均匀后灭菌，并加入到发酵罐中，得到发酵培养基。其中，发酵培养基中的总糖为重量14.5％，氮源的含量为0.08重量％。
(4)柠檬酸发酵
使用步骤(2)中得到的杂质溶液将步骤(3)中得到的酶解液稀释至总糖的11重量％，并投入种子罐，加入尿素，尿素的加入量(以氮源计)为种子罐培养液总重量的0.05％，加热到121℃消毒，维持30分钟后快速降温至36℃，接入黑曲霉菌种(黑曲霉T01，天津工业微生物所，接种量为：每克酶解清液105个菌落形成单位)，在36℃、0.25体积：体积·分钟的通气条件下进行菌种培养；通过取样显微镜镜检、酸度测定和pH测定对黑曲霉的生长进行观察，当pH在2.0、酸度1％、菌球大小均匀、菌丝粗壮伸出时，停止培养。
将上述培养的黑曲霉菌种加入到步骤(3)中的发酵罐中进行发酵，加入尿素，尿素的加入量(以氮源计)为种子罐培养液总重量的0.12％，接种量为：每克发酵培养基1.5×105个菌落形成单位，发酵条件包括温度为35℃，pH值为3，通气量为0.08体积：体积·分钟，发酵进行到第55小时的时后，得到柠檬酸发酵液。
发酵酸度和柠檬酸的转化率的结果如表1所示。
实施例3
该实施例用于说明本发明提供的含柠檬酸的溶液的处理方法。
(1)改性阴离子交换树脂的制备
将400mL的D301T大孔弱碱性苯乙烯阴离子交换树脂(江苏苏青水处理工程集团有限公司，OH-含量为10毫摩尔/克干树脂)与1600mL浓度为8重量％的硫酸水溶液在50℃下接触3.0h，将接触后的阴离子交换树脂取出，用离心机甩干，得到改性阴离子交换树脂。该改性阴离子交换树脂的OH-含量为0.03毫摩尔/克干树脂。
(2)含柠檬酸的溶液的处理
将237mL柠檬酸浓度为510mg/mL的柠檬酸母液加热至70℃，使粘度降低至8-9mPa·S，其中，柠檬酸母液中金属氧离子的浓度为50ppm。将处理后的柠檬酸母液在70℃下通过77mL的001×7强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂层(江苏苏青水处理工程集团有限公司，工作交换容量为6mmol/g)，控制流速使得柠檬酸母液与阳离子交换树脂的接触时间为45min，使阳柱流出液金属氧离子为0.2ppm，得到溶液A。所得溶液A中柠檬酸的重量为120g，再将得到的溶液A通过固定相为400mL由(1)所制得的改性阴离子交换树脂的色谱分离柱中(直径为3.5cm，长度为100cm)，控制流速使得溶液A与改性阴离子交换树脂层的接触时间为25min，使溶液A中的柠檬酸和其他杂质吸附到改性阴离子交换树脂上，然后用600mL浓度为2000ppm的稀硫酸溶液在60℃下进行洗脱，洗脱剂在色谱分离柱中的停留时间30min，当流出的洗脱液的柠檬酸色谱纯度高于90％时开始收集，当流出的洗脱液的柠檬酸色谱纯度低于于90％时停止柠檬酸溶液的收集，得到柠檬酸溶液，纯度为93.8重量％，柠檬酸的收率为94.6重量％。继续洗脱直至其它杂质都被洗出后，合并柠檬酸溶液之前和之后流出的洗脱液，得到杂质溶液。
(3)发酵培养基的制备
将收获的100重量份玉米进行粉碎，得到平均粒子直径为400微米的粉碎产物。将粉碎后的产物与400重量份的步骤(2)中得到的杂质溶液和淀粉酶(相当于每克粉碎的玉米使用30个酶活力单位的淀粉酶，诺维信公司，a-淀粉酶)混合均匀后，进入喷射器，在95℃、pH为5.8的条件下酶解90分钟后得到酶解液，将部分的酶解液通过用液压式板框压滤机进行压滤，分离出酶解清液和淀粉质原料酶解残渣。将酶解清液和淀粉质原料酶解残渣(固含量为40重量％)按照80∶20的重量比进行混合均匀后灭菌，并加入到发酵罐中，得到发酵培养基。其中发酵培养基中的总糖为15.5重量％，氮源的含量为0.11重量％。
(4)柠檬酸发酵
使用步骤(2)中得到的杂质溶液将步骤(3)中得到的酶解液稀释至总糖的12重量％，并投入种子罐，加热到121℃消毒，维持30分钟后快速降温至36℃，接入黑曲霉菌种(黑曲霉T01，天津工业微生物所，接种量为：每克酶解清液105个菌落形成单位)，在36℃、0.3体积：体积·分钟的通气条件下进行菌种培养；通过取样显微镜镜检、酸度测定和pH测定对黑曲霉的生长进行观察，当pH在2.0、酸度1％、菌球大小均匀、菌丝粗壮伸出时，停止培养。
将上述培养的黑曲霉菌种加入到步骤(3)中的发酵罐中进行发酵，接种量为：每克发酵培养基1.5×105个菌落形成单位，发酵条件包括温度为35℃，pH值为3，通气量为0.09体积：体积·分钟，发酵进行到第60小时后，得到柠檬酸发酵液。
发酵酸度和柠檬酸的转化率的结果如表1所示。
实施例4
该实施例用于说明本发明提供的含柠檬酸的溶液的处理方法。
按照与实施例1中步骤(1)和(2)的相同的方法进行处理，不同的是，柠檬酸母液与阳离子交换树脂接触前，未将柠檬酸母液加热加热至75℃，柠檬酸母液的粘度为18mPa·S，得到柠檬酸溶液和杂质溶液。柠檬酸溶液的纯度为90.8重量％，柠檬酸的收率为91.5重量％。
(3)发酵培养基的制备
按照实施例1中步骤(3)中的方法进行，不同的是使用实施例4的步骤(2)得到的杂质溶液，得到发酵培养基。其中发酵培养基中的总糖为14.7重量％，氮源的含量为0.08重量％。
(4)柠檬酸发酵
使用步骤(2)中得到的杂质溶液将步骤(3)中得到的酶解液稀释至总糖的10重量％，并投入种子罐，加热到121℃消毒，维持30分钟后快速降温至36℃，接入黑曲霉菌种(黑曲霉T01，天津工业微生物所，接种量为：每克酶解清液105个菌落形成单位)，在36℃、0.2体积：体积·分钟的通气条件下进行菌种培养；通过取样显微镜镜检、酸度测定和pH测定对黑曲霉的生长进行观察，当pH在2.0、酸度1％、菌球大小均匀、菌丝粗壮伸出时，停止培养。
将上述培养的黑曲霉菌种加入到步骤(3)中的发酵罐中进行发酵，接种量为：每克发酵培养基1.0×105个菌落形成单位，发酵条件包括温度为35℃，pH值为3，通气量为0.06体积：体积·分钟，发酵进行到第60小时后，得到柠檬酸发酵液。
发酵酸度和柠檬酸的转化率的结果如表1所示。
实施例5
该实施例用于说明本发明提供的含柠檬酸的溶液的处理方法。
按照与实施例1中步骤(1)和(2)的相同的方法进行处理，不同的是，柠檬酸母液与阳离子交换树脂的接触时间为5min，得到柠檬酸溶液和杂质溶液。柠檬酸溶液的纯度为90.1重量％，柠檬酸的收率为95.8重量％。
(3)发酵培养基的制备
按照实施例1中步骤(3)中的方法进行，不同的是使用实施例5的步骤(2)得到的杂质溶液，得到发酵培养基。其中发酵培养基中的总糖为14.6重量％，氮源的含量为0.09重量％。
(4)柠檬酸发酵
使用步骤(2)中得到的杂质溶液将步骤(3)中得到的酶解液稀释至总糖的8重量％，并投入种子罐，加热到121℃消毒，维持30分钟后快速降温至36℃，接入黑曲霉菌种(黑曲霉T01，天津工业微生物所，接种量为：每克酶解清液105个菌落形成单位)，在36℃、0.32体积：体积·分钟的通气条件下进行菌种培养；通过取样显微镜镜检、酸度测定和pH测定对黑曲霉的生长进行观察，当pH在2.0、酸度1％、菌球大小均匀、菌丝粗壮伸出时，停止培养。
将上述培养的黑曲霉菌种加入到步骤(2)中的发酵罐中进行发酵，黑接种量为：每克发酵培养基8×104个菌落形成单位，发酵条件包括温度为35℃，pH值为3，通气量为0.05体积：体积·分钟，发酵进行到第60小时后，得到柠檬酸发酵液。
发酵酸度和柠檬酸的转化率的结果如表1所示。
实施例6
该实施例用于说明本发明提供的含柠檬酸的溶液的处理方法。
按照与实施例1中步骤(1)和(2)的相同的方法进行处理，不同的是，洗脱剂为浓度为100ppm的硫酸水溶液，得到柠檬酸溶液，得到柠檬酸溶液和杂质溶液。柠檬酸溶液的纯度为92.1重量％，柠檬酸的收率为90.1重量％。
(3)发酵培养基的制备
按照实施例1中步骤(3)中的方法进行，不同的是使用实施例6的步骤(2)得到的杂质溶液，得到发酵培养基。其中发酵培养基中的总糖为14.6重量％，氮源的含量为0.07重量％。
(4)柠檬酸发酵
使用步骤(2)中得到的杂质溶液将步骤(3)中得到的酶解液稀释至总糖的13重量％，并投入种子罐，加热到121℃消毒，维持30分钟后快速降温至36℃，接入黑曲霉菌种(黑曲霉T01，天津工业微生物所，接种量为：每克酶解清液105个菌落形成单位)，在36℃、0.25体积：体积·分钟的通气条件下进行菌种培养；通过取样显微镜镜检、酸度测定和pH测定对黑曲霉的生长进行观察，当pH在2.0、酸度1％、菌球大小均匀、菌丝粗壮伸出时，停止培养。
将上述培养的黑曲霉菌种加入到步骤(2)中的发酵罐中进行发酵，接种量为：每克发酵培养基2.5×105个菌落形成单位，发酵条件包括温度为35℃，pH值为3，通气量为0.05体积：体积·分钟，发酵进行到第60小时后，得到柠檬酸发酵液。
发酵酸度和柠檬酸的转化率的结果如表1所示。
实施例7
该实施例用于说明本发明提供的含柠檬酸的溶液的处理方法。
按照与实施例1中步骤(1)和(2)的相同的方法进行处理，不同的是，替代200mL的柠檬酸母液，使用710mL的实施例1中得到的柠檬酸发酵液，相同地得到柠檬酸溶液和杂质溶液。柠檬酸溶液的纯度为95.0重量％，柠檬酸的收率为95.4重量％。
按照与实施例1中步骤(3)和(4)的相同的方法进行处理，得到柠檬酸发酵液。
发酵酸度和柠檬酸的转化率的结果如表1所示。
实施例8
该实施例用于说明本发明提供的含柠檬酸的溶液的处理方法。
按照与实施例1中步骤(1)和(2)的相同的方法进行处理，不同的是，替代200mL的柠檬酸母液，使用将实施例1中得到的柠檬酸发酵液经浓缩过滤后除去菌体和沉淀物的溶液(浓度为180mg/mL，体积为570mL)，相同地得到柠檬酸溶液和杂质溶液。柠檬酸溶液的纯度为95.1重量％，柠檬酸的收率为95.3重量％。
按照与实施例1中步骤(3)和(4)的相同的方法进行处理，得到柠檬酸发酵液。
发酵酸度和柠檬酸的转化率的结果如表1所示。
对比例1
按照与实施例1中步骤(1)和(2)的相同的方法进行处理，不同的是，改性阴离子交换树脂由相同体积的D318大孔弱碱性丙烯酸系阴离子交换树脂代替，得到柠檬酸溶液。纯度达85重量％，柠檬酸的收率为75重量％。
按照与实施例1中步骤(3)、(4)的相同的方法进行处理，不同的是使用的杂质溶液为对比例1的步骤(2)中得到的杂质溶液，得到浓度为125.8mg/mL的柠檬酸发酵液清液。
发酵酸度和柠檬酸的转化率的结果如表1所示。
对比例2
采用实施例1中步骤(3)、(4)的方法进行，不同的是将杂质溶液替换为水。得到柠檬酸发酵液。
发酵酸度和柠檬酸的转化率的结果如表1所示。
表1
| 编号 | 发酵酸度％ | 发酵转化率(％) |
| 实施例1 | 14.38 | 99.17 |
| 对比例1 | 13.52 | 93.24 |
| 对比例2 | 13.96 | 96.28 |
| 实施例2 | 14.36 | 98.98 |
| 实施例3 | 14.28 | 98.48 |
| 实施例4 | 14.30 | 98.62 |
| 实施例5 | 14.26 | 98.34 |
| 实施例6 | 14.23 | 98.14 |
| 实施例7 | 14.29 | 98.54 |
| 实施例8 | 14.34 | 98.91 |
从以上结果可以看出，实施例1-8由于采用了本发明的处理方法，所得的柠檬酸的纯度和收率均大于对比例1。从实施例1-3和实施例5-8的对比可以看出，采用本发明的优选条件对含柠檬酸的溶液进行处理，所得的柠檬酸的纯度和收率都得到了提高。从实施例1和实施例4的对比可以看出，采用本发明优选的接触时间，所得的柠檬酸的纯度得到了提高。
通过表1可以看出，实施例1-8由于采用了本发明的处理方法，所得柠檬酸发酵液清液的浓度(简称酸度)、柠檬酸的转化率均优于对比例1和2。另外，通过实施例7可知，本发明的方法可以直接对柠檬酸发酵液进行处理，并且得到的柠檬酸溶液的纯度以及收率都很高。
本发明的处理方法，不仅能够有效的利用上述色谱废水，在减少对环境污染的同时，降低了成本，还能够进一步提高柠檬酸的转化率，具有显著的经济利用价值。
Claims (21)
1.一种含柠檬酸的溶液的处理方法，所述含柠檬酸的溶液含有柠檬酸、金属阳离子和其他杂质，所述其他杂质包括残糖、蛋白、色素、有机酸和无机酸中的一种或多种，其特征在于，该方法包括以下步骤：
（1）将含柠檬酸的溶液与阳离子交换树脂接触，接触的条件使得接触后所得的溶液A中的金属阳离子浓度不超过5ppm；
（2）在色谱分离条件下，将所述溶液A从固定相为改性阴离子交换树脂的色谱分离柱的一端引入到色谱分离柱中，使溶液A中的柠檬酸和其他杂质吸附到所述树脂上，用洗脱剂进行淋洗，洗脱剂的用量以及所述色谱分离条件使得所述溶液A中含有的其他杂质和柠檬酸先后从树脂上解吸，得到杂质溶液和柠檬酸溶液，所述改性阴离子交换树脂不与或基本不与柠檬酸根离子发生离子交换；
（3）将得到的杂质溶液与粉碎后的淀粉质原料在淀粉酶存在下接触，得到含有淀粉质原料酶解清液和淀粉质原料酶解残渣的酶解后的产物；
（4）在生成柠檬酸的条件下，将柠檬酸发酵菌接种至发酵培养基中进行发酵，得到柠檬酸发酵液，所述发酵培养基的碳源为淀粉质原料酶解清液和淀粉质原料酶解残渣以重量比2-19:1的混合物，至少部分所述淀粉质原料酶解清液和淀粉质原料酶解残渣由上述酶解后的产物进行或不进行固液分离后得到。
2.根据权利要求1所述的处理方法，其中，所述柠檬酸溶液的纯度为90重量%以上，所述柠檬酸溶液的纯度为柠檬酸溶液中柠檬酸的含量/柠檬酸溶液干物重×100%。
3.根据权利要求1所述的处理方法，其中，所述含柠檬酸的溶液中金属阳离子的浓度为5-350ppm，所述含柠檬酸的溶液与阳离子交换树脂接触的方式为使含柠檬酸的溶液通过阳离子交换树脂柱，接触的条件包括所述阳离子交换树脂的交换容量大于3mmol/g，所述阳离子交换树脂的体积与柠檬酸发酵液的体积的比为1:2-9，所述阳离子交换树脂与含柠檬酸的溶液接触的时间至少为10min。
4.根据权利要求3所述的处理方法，其中，所述含柠檬酸的溶液中金属阳离子的浓度为50-150ppm，所述含柠檬酸的溶液与阳离子交换树脂接触的方式为使柠檬酸发酵液通过阳离子交换树脂柱，接触的条件包括所述阳离子交换树脂的交换容量为4-10mmol/g，所述阳离子交换树脂的体积与含柠檬酸的溶液的体积的比为1:3-7，所述阳离子交换树脂与含柠檬酸的溶液接触的时间为30-60min。
5.根据权利要求1、3或4所述的处理方法，其中，所述金属阳离子为Fe3+、Ca2+、Mg2+、K+和Na+中的一种或多种。
6.根据权利要求1、3或4所述的处理方法，其中，所述阳离子交换树脂为强酸性阳离子交换树脂和/或弱酸性阳离子交换树脂。
7.根据权利要求1所述的处理方法，其中，所述色谱分离的条件包括色谱分离的温度为30-80℃，所述溶液A中的柠檬酸的重量与改性阴离子交换树脂的体积的比为0.1-0.6g/mL，所述洗脱剂在色谱分离柱中的停留时间至少为10min。
8.根据权利要求7所述的处理方法，其中，所述色谱分离的条件包括色谱分离的温度为40-70℃，所述溶液A中的柠檬酸的重量与改性阴离子交换树脂的体积的比为0.15-0.45g/mL，所述洗脱剂在色谱分离柱中的停留时间为10-30min。
9.根据权利要求1、7或8所述的处理方法，其中，所述改性阴离子交换树脂中OH-的浓度不超过0.18毫摩尔/克干树脂。
10.根据权利要求9所述的处理方法，其中，所述改性阴离子交换树脂的功能基团为SO4 2-、NO3 2-、CO3 2-、Cl-、和PO4 3-中的一种或多种。
11.根据权利要求1或10所述的处理方法，其中，所述改性阴离子交换树脂为大孔型阴离子交换树脂和/或凝胶型阴离子交换树脂。
12.根据权利要求1所述的处理方法，其中，所述洗脱剂为浓度100-10000ppm的硫酸水溶液，所述溶液A的柠檬酸的重量与所述洗脱剂的体积的比为0.02-0.5g/mL。
13.根据权利要求12所述的处理方法，其中，所述洗脱剂为浓度500-1000ppm的硫酸水溶液，所述溶液A中含有的柠檬酸的重量与所述洗脱剂的体积的比为0.05-0.3g/mL。
14.根据权利要求1所述的处理方法，其中，所述含柠檬酸的溶液的柠檬酸浓度为50-700mg/mL；该方法还包括阳离子交换树脂与所述含柠檬酸的溶液接触前，将所述含柠檬酸的溶液加热升温到70-80℃，以使所述含柠檬酸的溶液的粘度降至7-9mPa·s。
15.根据权利要求1所述的处理方法，其中，以每克粉碎后的淀粉质原料的干重计，所述淀粉酶的用量为15-40个酶活力单位，所述杂质溶液的用量为1-5克。
16.根据权利要求15所述的处理方法，其中，以每克粉碎后的淀粉质原料的干重计，所述淀粉酶的用量为20-30个酶活力单位，所述杂质溶液的用量为2-4克。
17.根据权利要求1所述的处理方法，其中，步骤（3）中所述接触的条件为温度：70-105℃；接触的时间：90-150分钟；加氢氧化钙调pH值：5.6-6.4。
18.根据权利要求1所述的处理方法，其中，所述发酵培养基中淀粉质原料酶解残渣的含量为10-25%重量。
19.根据权利要求18所述的处理方法，其中，所述发酵培养基中总糖为13-20重量%。
20.根据权利要求1所述的处理方法，其中，以每毫升发酵培养基为基准，发酵菌的接种量为5×104-2.5×105个菌落形成单位，所述发酵的条件包括：培养的温度为30-42℃，pH值为1-6，通气量为0.05-0.13体积：（体积·分钟），培养的时间为45-65小时。
21.根据权利要求1所述的处理方法，其中，步骤（1）中的含柠檬酸的溶液的部分或全部来自于步骤（4）得到的柠檬酸发酵液。
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