CN103290070B

CN103290070B - 一种连续流加补料发酵生产柠檬酸的方法

Info

Publication number: CN103290070B
Application number: CN201310246378.5A
Authority: CN
Inventors: 刘辰; 刘飞
Original assignee: NANTONG KAISAI BIOCHEMICAL ENGINEERING EQUIPMENT Co Ltd
Current assignee: NANTONG KAISAI BIOCHEMICAL ENGINEERING EQUIPMENT Co Ltd
Priority date: 2013-06-20
Filing date: 2013-06-20
Publication date: 2015-03-11
Anticipated expiration: 2033-06-20
Also published as: CN103290070A

Abstract

一种连续流加补料发酵生产柠檬酸的方法，其特征在于它包括以下工艺步骤：步骤1、将含淀粉的原料粉碎后加水调成淀粉(原)浆，向其中加入高温α-淀粉酶(形成混合原浆)，采用连续喷射液化工艺进行液化，得到液化液，对液化液进行固液分离得液化清液；步骤2、将(步)液化清液投入发酵罐中，加入氮源配成基础培养基；将基础培养基加热灭菌后冷却至38℃～40℃(室温)，接入黑曲霉菌种，对黑曲霉菌种进行通风培养20～36个小时后，再流加补料培养基16～22个小时后，(对黑曲霉菌种)继续发酵至残糖为1.0％以下，制得发酵液；步骤3、将发酵液加热至75～85℃，终止发酵，过滤后得到柠檬酸发酵清液，提取制得柠檬酸。本发明方法主要解决了柠檬酸发酵生产中发酵周期较长、产酸率和转化率较低，导致发酵能耗较大、成本较高、产品质量差的突出问题。

Description

一种连续流加补料发酵生产柠檬酸的方法

技术领域

本发明属于生物过程工程领域，涉及柠檬酸生产领域，具体涉及一种连续流加补料发酵生产柠檬酸的方法。

背景技术

柠檬酸又名枸橼酸，英文名citric acid，学名2-羟基丙烷-1，2，3-三羧酸或2-羟基丙烷三羧酸。柠檬酸被FDA认为是GRAS(Generally Recognized asSafe，通常被认为是安全的)产品，在欧洲产品编号为E330，它被FAO/WHO食品添加剂专家委员会批准为食品添加剂。由于柠檬酸的安全性，以及容易同化、口味好、高溶解性、螯合性和缓冲性，广泛地应用于食品、饮料、医药、化妆品、化学等工业。

柠檬酸的生产方法主要有微生物发酵法和化学合成法，如今世界上90％以上的柠檬酸是通过发酵法生产的。发酵法生产主要有表面(浅盘)发酵法、深层液体发酵法和固体发酵法，采用黑曲霉柠檬酸产生菌进行深层液体发酵是柠檬酸生产的主流技术。

柠檬酸发酵生产的主要原料有三类，一是葡萄糖、蔗糖等精制糖；二是富含淀粉的原料如玉米、木薯、山芋等；三是蔗糖蜜或甜菜糖蜜。国外的柠檬酸培养基主要以蔗糖、淀粉水解糖为主，适量添加无机氮源及无机盐成分，产酸高，发酵周期长，单产低，成分相对简单，方便提取，废弃物少，有利于环境保护。我国柠檬酸发酵具有中国特色，培养基主要为天然培养基，碳源为淀粉质原料，主要原料是木薯或玉米，适量添加有机氮源，少量或不加无机盐成分，产酸较高，发酵周期短，单产高，但成分相对复杂，对提取有一定影响，且废弃物量大，环境污染也较严重。

我国相继研究成功了木薯原料深层柠檬酸发酵工艺，和以玉米粉为原料的半精料柠檬酸发酵工艺。木薯粉发酵培养基成分复杂，玉米粉发酵也只是半精料发酵，会将一定的玉米粉液化全液加到培养基中，用来调节氮的含量，两种原料都有大量杂质不参加代谢，给柠檬酸的后提取增加了难度，而且空耗能源，降低了设备的利用率。目前均采取分批发酵方式，发酵周期较长，产酸率较低，导致发酵能耗较大，生产成本较高。采用连续流加补料发酵生产柠檬酸的新工艺，可以提高发酵水平，降低能源消耗，降低生产成本，提高产品质量，减少废物排放。

国内外在选育高产柠檬酸菌株的同时，对现行的发酵工艺进行优化。日本有研究人员将连续发酵工艺应用到酵母发酵柠檬酸的工艺中，利用该工艺提高了柠檬酸的产量，但异柠檬酸含量有所提高，对后期柠檬酸提取影响较大。美国研究了固定化菌体发酵生产柠檬酸，但是由于真菌在固定菌体方面有较大的难度，所以很难进行工业化生产。补料发酵工艺在抗生素、氨基酸，维生素等生物发酵产品中已成功应用。本世纪初，我国柠檬酸科研人员开始研究补料工艺在柠檬酸发酵中的应用，但由于丝状真菌生长发育特性，难度较大，尚未发现连续流加补料发酵工艺在柠檬酸生产中成功应用的报道。

发明内容

本发明提供一种连续流加补料发酵生产柠檬酸的方法，其目的主要是解决柠檬酸发酵生产中发酵周期较长、产酸率和转化率较低，导致发酵能耗较大、成本较高、产品质量差的突出问题。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种连续流加补料发酵生产柠檬酸的方法，其特征在于它包括以下工艺步骤：

步骤1、将含淀粉的原料粉碎后加水调成淀粉浆，向所述淀粉浆中加入高温α-淀粉酶，然后采用连续喷射液化工艺进行液化，得到液化液，对液化液进行固液分离即制得液化清液；

其中，所述含淀粉的原料选自玉米、木薯和山芋；

所述淀粉浆的pH值为5.0～7.0；

所述高温α-淀粉酶添加量按所述含淀粉的原料计算为每克含淀粉的原料添加5～15个酶活单位的高温α-淀粉酶；

步骤2、将步骤1制得的所述液化清液投入发酵罐中，加入氮源配成基础培养基；将所述基础培养基加热灭菌后冷却至38℃～40℃，接入黑曲霉菌种，开启所述发酵罐中的搅拌装置，对所述黑曲霉菌种进行通风培养20～36个小时后，再流加补料培养基16～22个小时后，对黑曲霉菌种继续发酵至残糖为1.0％以下，制得发酵液；

步骤3、将步骤2制得发酵液加热至75～85℃，终止发酵，过滤后得到柠檬酸发酵清液，提取制得柠檬酸。

上述技术方案中的有关内容解释如下：

1、上述方案中，步骤1中所述含淀粉的原料粉碎后的粒度为40～80目。

2、上述方案中，步骤1中所述淀粉浆中含淀粉的原料的浓度为150～200g/L。

3、上述方案中，步骤2中所述基础培养基的总糖浓度为8～12％。

4、上述方案中，步骤2中加入的氮源为玉米浆、酵母浸出物；所述氮源占基础培养基总体积的0.3～3.0％。

5、上述方案中，步骤2中接入所述黑曲霉菌种的接种方式为黑曲霉孢子直接接种；所述黑曲霉孢子浓度为2～5×10⁶个/ml。

6、上述方案中，步骤2中所述黑曲霉菌种进行通风培养时所述培养温度为38℃～40℃，所述流加补料培养基后所述发酵温度为35℃～37℃。

7、上述方案中，步骤2中所述基础培养基的体积为发酵罐容积的50～75％。

8、上述方案中，步骤2中所述补料培养基的流加速度为0.1～4.0m³/小时。

9、上述方案中，步骤2中所述补料培养基的开始流加的条件为pH值小于2.5。

10、上述方案中，步骤1中所述混合浆的液化指的是淀粉的液化；并采用带式过滤机或板框过滤机进行固液分离。

11、上述方案中，步骤2中所述基础培养基加热至90～121℃灭菌，并维持20～30分钟快速降至38℃～40℃。

12、上述方案中，步骤2中所述的发酵罐的通风装置为3D射流空气分布器，第一级开启时间为接种后，直至发酵结束；第二级开启时间为流加开始至流加结束。

13、上述方案中，步骤2中所述发酵罐的搅拌转速为50～300转/分钟，通风培养的通风比为1∶0.2～1∶1。

14、上述方案中，步骤2中所述补料培养基是葡萄糖含量为30～55％的淀粉糖、0.01～0.08％(NH₄)₂SO₄。

15、上述方案中，步骤2中流加补料培养基的流加装置为计量罐式补料系统。

16、上述方案中，步骤3中所述柠檬酸的提取采用钙盐法提取。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

本发明与现有柠檬酸分批发酵技术相比，采用黑曲霉孢子直接接种、一罐式发酵的工艺，避免因二次接种给黑曲霉菌种生长环境造成剧变，使黑曲霉始终处于适宜生长的环境条件，可以获得高密度的菌体；柠檬酸的合成速度和菌体的密度是紧密相关的，高密度菌体是获得高转化率的首要条件。基础培养基糖分较低，前期产酸稍慢，培养基pH大于3.0的时间延长，有利于淀粉的充分糖化，使得残糖较低。减少一次接种操作也就减少了一次染菌机会。同时节约了相应的设备投资及能耗。菌种生长期和柠檬酸合成期采用不同的温度，有利于菌体的生长和柠檬酸的形成。柠檬酸发酵属于II类发酵，通过流加高浓度葡萄糖液，维持发酵液中较低的基质浓度，可以避免快速利用碳源引起的分解代谢阻遏效应；还可调整发酵液粘度、氧传递系数等物性参数，缓解对数生长期供氧不足的矛盾，有利于产物合成，缩短发酵周期，提高糖酸转化率。使得发酵过程泡沫得以控制，节省消泡剂，提高了装罐系数。可以改善发酵液的质量，为提取高品质柠檬酸创造前提条件。

本发明通过连续流加补料的新工艺，实现了高效、节能、优质生产柠檬酸的目标。

附图说明

附图1是本发明工艺流程框图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

实施例一：

一种连续流加补料发酵生产柠檬酸的方法，其特征在于它包括以下工艺步骤：

其中，所述含淀粉的原料选自玉米、木薯和山芋；

所述淀粉浆的pH值为5.0～7.0；

步骤2、将步骤1制得的所述液化清液投入发酵罐中，加入氮源配成基础培养基；将所述基础培养基加热灭菌后冷却至38℃～40℃，接入黑曲霉菌种，开启所述发酵罐中的搅拌装置，对所述黑曲霉菌种进行通风培养20～36个小时后，再流加补料培养基16～22个小时后，继续发酵至残糖为1.0％以下，制得发酵液；

其中：步骤1中所述的液化指的是淀粉的液化；并采用带式过滤机或板框过滤机进行固液分离。

步骤1中所述含淀粉的原料粉碎后的粒度为40～80目。

步骤1中所述淀粉原浆中含淀粉的原料的浓度为150～200g/L。

步骤2中所述基础培养基的总糖浓度为8～12％。

步骤2中加入的氮源为玉米浆、酵母浸出物；所述氮源占基础培养基总体积的0.3～3.0％。

步骤2中接入所述黑曲霉菌种的接种方式为黑曲霉孢子直接接种；所述黑曲霉孢子浓度为2～5×10⁶个/ml。

步骤2中所述黑曲霉菌种进行通风培养时所述培养温度为38℃～40℃，所述流加补料培养基后所述发酵温度为35℃～37℃。

步骤2中所述基础培养基的体积为发酵罐容积的50～75％。

步骤2中所述补料培养基的流加速度为0.1～4.0m³/小时。

步骤2中所述补料培养基的开始条件为pH值小于2.5。

步骤2中所述基础培养基加热至90～121℃灭菌，并维持20～30分钟快速降至38℃～40℃。

步骤2中所述的发酵罐的通风装置为3D射流空气分布器，第一级开启时间为接种后，直至发酵结束；第二级开启时间为流加开始至流加结束。

步骤2中所述发酵罐搅拌转速为50～300转/分钟，通风培养的通风比为1∶0.2～1∶1。

步骤2中所述补料培养基是葡萄糖含量为30～55％的淀粉糖、0.01～0.08％(NH₄)₂SO₄。

步骤2中流加补料培养基的流加装置为计量罐式补料系统。

实施例二：

(1)称取玉米原料，将其粉碎成细度为40目的玉米粉，加水调浆，调浆后的浓度为182.4g/L；调整浆液的pH值为5.5；按每克玉米粉添加8个酶活单位的量加入高温α-淀粉酶，采用连续喷射液化工艺进行液化，得到液化液；采用板框过滤机进行固液分离，制成液化清液。

(2)将液化清液投入50m3发酵罐中，总糖浓度为9.6％。加入1.0％的玉米浆，配成基础培养基，体积为发酵罐容积的69.3％。将培养基加热至110℃灭菌，维持25分钟后快速降温至39℃±1，用黑曲霉孢子直接接种，孢子浓度为2×10⁶个/ml。开启搅拌和3D射流空气分布器第一级通入压缩空气，进行通风培养。种子培养阶段温度控制在39℃±1，发酵罐搅拌转速为200转/分钟，通风比为1∶0.20。

(3)当菌种培养至32小时，还原糖为4.8％，pH降至2.5，开始流加补料培养基。流加装置为计量罐式补料系统，流加速度为0.3～0.36m³/hr。补料培养基由葡萄糖含量50.1％的淀粉糖、0.03％(NH₄)₂SO₄组成。流加后发酵温度控制在36℃±1。开启3D射流空气分布器第二级增加通气量，通风比为1∶0.22，至流加结束时关闭。发酵53小时停止流加补料培养基，继续发酵直至残糖为1.0％以下。发酵周期为67小时(含种子培养阶段)，产酸为18.1％，发酵液总体积为46.0m³，糖酸转化率为98.5％。

(4)将发酵液加热至85℃，终止发酵，过滤后得到柠檬酸发酵清液，用钙盐法提取制得高品质柠檬酸，总收得率为93.3％。

实施例三：

(1)称取玉米原料，将其粉碎成细度为40目的玉米粉，加水调浆，调浆后的浓度为162.8g/L；调整浆液的pH值为5.5；按每克玉米粉添加5个酶活单位的量加入高温α-淀粉酶，采用连续喷射液化工艺进行液化，得到液化液；采用板框过滤机进行固液分离，制成液化清液。

(2)将液化清液投入300m³发酵罐中，总糖浓度为8.6％。加入0.8％的玉米浆，配成基础培养基，体积为发酵罐容积的62.7％。将培养基加热至105℃灭菌，维持25分钟后快速降温至38℃±1，用黑曲霉孢子直接接种，孢子浓度为2×10⁶个/ml。开启搅拌和3D射流空气分布器第一级通入压缩空气，进行通风培养。种子培养阶段温度控制在39℃±1，发酵罐搅拌转速为100转/分钟，通风比为1∶0.15。

(3)当菌种培养至30小时，还原糖为4.5％，pH降至2.5，开始流加补料培养基。流加装置为计量罐式补料系统，流加速度为1.8～2.4m³/hr。补料培养基由葡萄糖含量49.6％的淀粉糖、0.03％(NH4)2SO4组成。流加后发酵温度控制在36℃±1。开启3D射流空气分布器第二级增加通气量，通风比为1∶0.18，至流加结束时关闭。发酵56小时停止流加补料培养基，继续发酵直至残糖为1.0％以下。发酵周期为69小时(含种子培养阶段)，产酸为17.5％，发酵液总体积为283m³，糖酸转化率为98.9％。

(4)将发酵液加热至80℃，终止发酵，过滤后得到柠檬酸发酵清液，用钙盐法提取制得高品质柠檬酸，总收得率为93.7％。

实施例四：

(1)称取木薯原料，将其粉碎成细度为60目的木薯粉，加水调浆，调浆后的浓度为188.6g/L；调整浆液的pH值为5.5；按每克木薯粉添加8个酶活单位的量加入高温α-淀粉酶，采用连续喷射液化工艺进行液化，得到液化液；采用板框过滤机进行固液分离，制成液化清液。

(2)将液化清液投入300m³发酵罐中，总糖浓度为9.9％。加入1.2％的玉米浆，配成基础培养基，体积为发酵罐容积的72.3％。将培养基加热至105℃灭菌，维持25分钟后快速降温至39℃±1，用黑曲霉孢子直接接种，孢子浓度为2×10⁶个/ml。开启搅拌和3D射流空气分布器第一级通入压缩空气，进行通风培养。种子培养阶段温度控制在39℃±1，发酵罐搅拌转速为100转/分钟，通风比为1∶0.15。

(3)当菌种培养至31小时，还原糖为5.1％，pH降至2.5，开始流加补料培养基。流加装置为计量罐式补料系统，流加速度为1.8～2.2(0)m³/hr。补料培养基由葡萄糖含量55.2％的淀粉糖、0.03％(NH₄)₂SO₄组成。流加后发酵温度控制在36℃±1。开启3D射流空气分布器第二级增加通气量，通风比为1∶0.18，至流加结束时关闭。发酵58小时停止流加补料培养基，继续发酵直至残糖为1.0％以下。发酵周期为72小时(含种子培养阶段)，产酸为18.5％，发酵液总体积为272m³，糖酸转化率为98.6％。

(4)将发酵液加热至80℃，终止发酵，过滤后得到柠檬酸发酵清液，用钙盐法提取制得高品质柠檬酸，总收得率为92.8％。

新旧工艺生产指标比较表

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种连续流加补料发酵生产柠檬酸的方法，其特征在于它包括以下工艺步骤：

其中，所述含淀粉的原料选自玉米、木薯和山芋；

所述淀粉浆的pH值为5.0～7.0；

步骤2、将步骤1制得的所述液化清液投入发酵罐中，加入氮源配成基础培养基；将所述基础培养基加热灭菌后冷却至38℃～40℃，直接接入浓度为2～5×10⁶个/ml的黑曲霉孢子，开启所述发酵罐中的搅拌装置，对所述黑曲霉孢子在培养温度为38℃～40℃的条件下进行通风培养20～36个小时后，再在流加速度为0.1～4.0m³/小时的条件下流加补料培养基16～22个小时后，发酵温度为35℃～37℃的条件下继续发酵至残糖为1.0％以下，制得发酵液；

2.根据权利要求1所述的连续流加补料发酵生产柠檬酸的方法，其特征在于：步骤1中所述含淀粉的原料粉碎后的粒度为40～80目。

3.根据权利要求1所述的连续流加补料发酵生产柠檬酸的方法，其特征在于：步骤1中所述淀粉浆中含淀粉原料的浓度为150～200g/L。

4.根据权利要求1所述的连续流加补料发酵生产柠檬酸的方法，其特征在于：步骤2中所述基础培养基的总糖浓度为8～12％。

5.根据权利要求1所述的连续流加补料发酵生产柠檬酸的方法，其特征在于：步骤2中加入的氮源为玉米浆、酵母浸出物；所述氮源占基础培养基总体积的0.3～3.0％。

6.根据权利要求1所述的连续流加补料发酵生产柠檬酸的方法，其特征在于：步骤2中所述基础培养基的体积为发酵罐容积的50～75％。

7.根据权利要求1所述的连续流加补料发酵生产柠檬酸的方法，其特征是：所述步骤2中所述补料培养基的开始流加的条件为pH值小于2.5。