CN109321617B - 一种利用工农业副产物固态发酵合成那他霉素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用工农业副产物固态发酵合成那他霉素的方法，具体涉及一种利用廉价的农业及轻工业副产物作为底物，通过固态发酵的方法合成那他霉素的方法，属于工业生物技术领域。本发明的固态发酵培养基包括碳源、氮源、辅助碳源和蓬松载体，其中，所述碳源和氮源质量比为(1‑3)：(1‑3)，所述辅助碳源的添加量为2‑5wt％，所述蓬松载体的添加量为2‑5wt％；所述培养基中含水量为50‑100％(v/w)，利用本发明的固态发酵培养基，培养褐黄孢链霉菌进行发酵生产那他霉素，使得发酵过程中的能耗和成本大幅降低，同时使得工农业副产物得到有效利用。

Description

一种利用工农业副产物固态发酵合成那他霉素的方法
技术领域
本发明涉及一种利用工农业副产物固态发酵合成那他霉素的方法，具体涉及一种利用廉价的农业及轻工业副产物作为底物，通过固态发酵的方法合成那他霉素的方法，属于工业生物技术领域。
背景技术
那他霉素是一种由链霉菌属经过发酵合成的次级代谢产物，其生产菌主要有恰塔努加链霉菌(Du et al.,J.Microbiol.,2009)、褐黄孢链霉菌(Chen et al.,J.Agr.FoodChem.,2008)、利迪链霉菌(Lu et al.,Braz.J.Microbiol.,2008)和纳塔尔链霉菌(Aparicio et al.,J.Biol.Chem.,1999；El-Enshasy et al.,J.Basic.Microb.,2000)。那他霉素是一种具有多烯大环内酯结构的广谱抗真菌剂，其对霉菌和酵母具有强烈的抑制效果。此外，其已被美国食品药品管理局(FDA)定为“总体安全的”(GRAS)化合物，这使得其应用范围得到大幅拓展。目前，那他霉素在国内的售价约为800-900元/公斤，是一种具有高附加值的生物产品。至今为止，那他霉素在抗真菌治疗、食品绿色防腐以及农业病害真菌治理上的应用已经超过30年，具有巨大的社会需求和经济价值。
目前，液态深层发酵是工业化生产那他霉素的主要途径。为提升那他霉素的生物合成水平，近年来学术界和产业界进行了大量的研究，其包括高产菌的选育(Jiang etal.,Appl.Environ.Microb.,2013)、发酵营养条件的筛选(Chen et al.,J.Agr.FoodChem.,2008；Elsayed et al.,Process Biochem.,2013)、发酵过程工艺优化(El-Enshasyet al.,J.Basic.Microb.,2000；Liang et al.,Enzyme Microb.Tech.,2008)以及产物合成前体的添加等。尽管以上研究使得那他霉素的生物合成水平大幅提高，然而，液态深层发酵的固有缺陷一直得不到有效的解决。其一，液态发酵需要连续5-7天进行通气并高速搅拌，该过程能耗极大；其二，那他霉素液态发酵所用底物主要有葡萄糖、淀粉、大豆蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏，原料成本较高；其三，液态发酵中那他霉素产物浓度低(2-14g/L)，发酵结束后将产生大量的有机废水，进而增加企业的环保压力。因此，若以廉价的轻工业和农业副产物为底物进行那他霉素的固态发酵合成，则可以有效解决以上的问题。
固态发酵是一种将微生物置于自由水含量极低的固态基质上进行发酵的生产方式，其固态基质同时充当载体和底物，具有原料成本低、工艺能耗少、产物浓度高、发酵接近自然环境、无废水排放等优势。近年来，固态发酵在酶制剂、抗生素、有机酸及其他高附加值产品生产中得以应用，前景极为广阔。固态发酵常以粮食作为底物，而我国人口众多、耕地面积有限，以粮食为底物进行大规模的固态发酵并不适合我国现阶段国情。因此，开发非粮底物进行固态发酵成为了重要的方向。
我国农业和轻工业庞大的体量致使每年产出大量的有机副产物，若能将这些有机副产物作为底物进行固态发酵以合成那他霉素，不仅能够降低发酵中的原料成本，同时还能够减少有机副产物的污染，具有良好的经济和社会效益。本专利旨在于开发出一种以农业和轻工业副产物为底物进行固态发酵合成那他霉素的工艺，以实现废弃物的高值转化，“变废为宝”，降低生产成本、减少环境污染。
发明内容
为降低那他霉素生产能耗及原料成本，实现发酵废水的零排放和工农业废弃物的再利用，本发明采用农业和轻工业副产物作为发酵底物和载体，对那他霉素固态发酵中的营养配比和培养条件进行了优化，并在此基础上进行了分批发酵和重复分批发酵，由此提出了一种基于廉价工农业副产物的那他霉素固态发酵工艺。
首先，本发明提供了一种用于褐黄孢链霉菌生产那他霉素的固态发酵培养基，所述培养基包括碳源、氮源、辅助碳源、蓬松载体和水，其中，所述碳源和氮源质量比为(1-3)：(1-3)，所述辅助碳源的质量占碳源、氮源、辅助碳源和蓬松载体的总质量的2-5％，所述蓬松载体的质量占碳源、氮源、辅助碳源和蓬松载体的总质量的2-5％；所述培养基中水的体积mL为碳源、氮源、辅助碳源和蓬松载体的总质量g的50-100％。
在本发明的一种实施方式中，所述碳源包括麸皮、米糠、甘蔗渣、麦秸秆中的一种或几种，优选麸皮。
在本发明的一种实施方式中，所述氮源包括大豆饼、油菜籽饼、黄酒糟、平菇菌渣中的一种或几种，优选油菜籽饼。
在本发明的一种实施方式中，所述辅助碳源包括糖蜜、工业甘油、食用废油中的一种或几种，优选工业甘油。
在本发明的一种实施方式中，所述蓬松载体包括稻谷壳、煤炉渣、麦秸杆、玉米芯中的一种或几种，优选稻谷壳。
在本发明的一种实施方式中，所述碳源和氮源质量比优选2：1。
在本发明的一种实施方式中，所述辅助碳源的质量优选3wt％。
在本发明的一种实施方式中，所述蓬松载体的质量优选3wt％。
在本发明的一种实施方式中，所述培养基中水的体积mL优选为碳源、氮源、辅助碳源和蓬松载体的总质量g的70％。
其次，本发明提供了一种配制上述固态发酵培养基的方法，所述方法为：称取碳源和氮源置于培养容器中，加入干燥的蓬松载体，搅拌均匀，再加入辅助氮源，之后加入水使培养基中水的体积为碳源、氮源、辅助碳源和蓬松载体的总质量g的50-100％，搅拌均匀后，封口，高温灭菌。
在本发明的一种实施方式中，所述碳源和氮源在使用前需经过烘干和粉碎，其中，麸皮、米糠、大豆饼、油菜籽饼、黄酒糟、平菇菌渣粉碎后过40目筛，甘蔗渣、麦秸秆粉碎后过10目筛。
在本发明的一种实施方式中，所述高温灭菌的温度为126-136℃，灭菌时间为20-30min。
本发明还提供了一种利用褐黄孢链霉菌发酵生产那他霉素的方法，所述方法利用上述培养基进行发酵培养，得到发酵产物。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵过程中，发酵温度为24-34℃，接种量mL为培养基中碳源、氮源、辅助碳源和蓬松载体的总质量g的5-30％，发酵时间为4-10天。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵温度优选为28℃；所述接种量优选为15％；所述发酵时间优选为7天。
在本发明的一种实施方式中，所述方法具体包括以下步骤：
(1)发酵种子培养：将褐黄孢链霉菌接种于固体贝塔纳培养基上，在26-30℃恒温培养箱中培养直至长出褐黄色孢子；挑取孢子置于液体种子培养基摇瓶中，于26-30℃恒温振荡培养箱中培养1-3天；
(2)接种与发酵：按照接种量5-30％，将培养好的液体发酵种子接入已经配制完成的固态培养基中，搅拌均匀后，置于恒温培养箱中发酵培养4-10天，其中，上述质量w为干重；
(3)产物的提取：固态发酵结束后，利用甲醇提取方法提取产物。
在本发明的一种实施方式中，所述方法具体包括以下步骤：
(1)发酵种子培养：将褐黄孢链霉菌接种于固体贝塔纳培养基上，在28℃恒温培养箱中培养直至长出褐黄色孢子；用接种环挑取2环孢子置于装液量60mL的500mL液体种子培养基摇瓶中，于28℃恒温振荡培养箱中220rpm培养2天；
(2)接种与发酵：按照接种量5-30％，将培养好的液体发酵种子接入已经配制完成的固态培养基中，搅拌均匀后，置于恒温培养箱中发酵培养4-10天，其中，上述质量w为干重；
(3)产物的提取与检测：固态发酵结束后，利用甲醇提取方法提取检测那他霉素含量。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中所述固体贝塔纳培养基(g·L-1)：葡萄糖9-11,酵母粉0.5-2，蛋白胨1-3，琼脂18-21，pH 7.0-8.0；所述液体种子培养基(g·L-1)：葡萄糖18-22，酵母粉5-7，大豆蛋白胨5-7，NaCl 4-6，pH 7.0-8.0。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中所述固体贝塔纳培养基(g·L-1)：葡萄糖10，酵母粉1，蛋白胨2，琼脂20，pH 7.5；所述液体种子培养基(g·L-1)：葡萄糖20，酵母粉6，大豆蛋白胨6，NaCl 5，pH 7.5。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)，当发酵规模为250mL或5L时，发酵期间每天将发酵培养基翻转两次以改善传氧。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)，当发酵规模30L时，发酵时，调搅拌桨转速为12-20rpm进行搅拌，通风量调节为1-3vvm，并以冷却水系统对固态生物反应器进行控温，使其尾气温度达到27-30℃，期间每隔1天向发酵罐中补水一次，以维持50-80％基质含水量。
在本发明的一种实施方式中，所述甲醇提取方法具体为：固态发酵结束后，发酵渣先置于35℃电热鼓风干燥箱中8h烘干，再于粉碎机中粉碎，过40目筛备用；以10mL 70％甲醇对以上0.3g发酵渣粉进行提取，提取过程于超声波清洗器中进行30min，此后于离心机中5000g离心10min，上清液用于检测那他霉素含量。
在本发明的一种实施方式中，所述的褐黄孢链霉菌优选为褐黄孢链霉菌Z28(Streptomyces gilvosporeus Z28)。
本发明的培养容器包括250mL三角瓶、5L三角瓶、30L固态生物反应器三种。
本发明取得的有益技术效果：
与液态深层发酵生产那他霉素方法相比，本发明所示的廉价工农业副产物为底物固态发酵生产那他霉素的方法具有以下优点：
1.发酵过程中的能耗大幅降低，固态发酵搅拌转速低，功率消耗少；
2.工农业副产物得到有效利用，不造成污染，且仅仅原料成本相较液态发酵生产相比降低了大约50％，单位产物的原料成本更低；
3.避开了微生物发酵工业的共性问题——大量发酵废水产生，发酵废水“零排放”大大缩减下游水处理成本；
4.发酵渣可进行二次利用，用于农业有机肥或动物饲料生产，额外增加效益。
5.本发明利用廉价工农业副产物来固态发酵生产那他霉素的方法相较其他固态发酵方法的生产得到的那他霉素的浓度更高。
具体实施方式
下面结合具体实施例，可以更好地理解本发明。实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件以及结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
以上那他霉素固态发酵的营养条件和培养条件优化实验均在250mL三角瓶中完成，具体操作步骤如下：
产物的检测：采用生物法，以酿酒酵母为指示菌，将酿酒酵母于YPD液体培养基中培养1天后，以5％(v/v)加量添加于50℃未凝固的YPD固体琼脂培养基中，待凝固后，加入无菌牛津杯，在牛津杯中加入50-100μL的甲醇提取液，于30℃培养22h，量取抑菌圈的半径并根据那他霉素与抑菌圈大小的标准曲线来确定样品中的那他霉素浓度。标准曲线为Log10C＝3.058·r2-2.582，其中r代表抑菌圈平均半径(cm)，C代表那他霉素浓度(g/L)。
固体贝塔纳培养基(g·L-1)：葡萄糖10,酵母粉1,蛋白胨2,琼脂20,pH 7.5。
液体种子培养基(g·L-1)：葡萄糖20,酵母粉6,大豆蛋白胨6,NaCl 5,pH 7.5。
发酵种子培养：将褐黄孢链霉菌Z28接种于固体贝塔纳培养基上，于28℃恒温培养箱中培养10天，直至长出褐黄色孢子；用接种环挑取2环孢子置于装液量60mL的500mL液体种子培养基摇瓶中，于28℃恒温振荡培养箱中220rpm培养2天。
实施例1
以250mL三角瓶为发酵容器，并以10g麸皮、米糠、甘蔗渣或麦秸秆为碳源，5g油菜籽饼为氮源，0.45g稻谷壳为蓬松载体，0.45g工业甘油为辅助碳源，配置16g干重固态发酵培养基。在固态发酵培养基中加入70％(v/w，g/L，其中w为碳源、氮源、辅助碳源和蓬松载体的总质量，下同)的水，并于126℃高压灭菌锅中灭菌30min。向以上培养基中接种接种量为15％(v/w)的褐黄孢链霉菌Z28的42-52h种子培养液，并置于28℃恒温培养箱中发酵培养7天，每天对其中培养基翻转两次以保障供氧，最终那他霉素产量浓度达到9.53、3.04、6.10、2.06mg·g-1干重(所述“干重“为碳源、氮源、辅助碳源和蓬松载体的总质量，下同)。
实施例2
以250mL三角瓶为发酵容器，并以10g麸皮为碳源，5g油菜籽饼、大豆饼、黄酒糟或平菇菌渣为氮源，0.45g稻谷壳为蓬松载体，0.45g工业甘油为辅助碳源，配置16g干重固态发酵培养基。在固态发酵培养基中加入70％(v/w)的水，并于126℃高压灭菌锅中灭菌30min。向以上培养基中接种接种量为15％(v/w)的褐黄孢链霉菌Z28的42-52h种子培养液，并置于28℃恒温培养箱中发酵培养7天，每天对其中培养基翻转两次以保障供氧，最终那他霉素产量浓度达到9.53、6.96、1.56、3.34mg·g-1干重。
实施例3
以250mL三角瓶为发酵容器，碳源和氮源质量比3：1、2：1、1：1、1：2、1：3，且碳源和氮源总质量为15g、0.45g稻谷壳为蓬松载体，0.45g工业甘油为辅助碳源，配置16g干重固态发酵培养基。在固态发酵培养基中加入70％(v/w)的水，并于126℃高压灭菌锅中灭菌30min。向以上培养基中接种接种量为15％(v/w)的褐黄孢链霉菌Z28的42-52h种子培养液，并置于28℃恒温培养箱中发酵培养7天，每天对其中培养基翻转两次以保障供氧，最终那他霉素产量浓度达到2.32、9.53、4.51、1.80、1.13mg·g-1干重。
实施例4
以250mL三角瓶为发酵容器，并以10g麸皮为碳源，5g油菜籽饼为氮源，0.45g稻谷壳、煤炉渣、麦秸杆或玉米芯为蓬松载体，0.45g工业甘油为辅助碳源，配置16g干重固态发酵培养基。在固态发酵培养基中加入70％(v/w)的水，并于126℃高压灭菌锅中灭菌30min。向以上培养基中接种接种量为15％(v/w)的褐黄孢链霉菌Z28的42-52h种子培养液，并置于28℃恒温培养箱中发酵培养7天，每天对其中培养基翻转两次以保障供氧，最终那他霉素产量浓度达到9.53、6.54、7.62、4.70mg·g-1干重。
实施例5
以250mL三角瓶为发酵容器，并以10g麸皮为碳源，5g油菜籽饼为氮源，0.45g稻谷壳为蓬松载体，0.45g糖蜜、工业甘油或食用废油为辅助碳源，配置16g干重固态发酵培养基。在固态发酵培养基中加入70％(v/w)的水，并于126℃高压灭菌锅中灭菌30min。向以上培养基中接种接种量为15％(v/w)的褐黄孢链霉菌Z28的42-52h种子培养液，并置于28℃恒温培养箱中发酵培养7天，每天对其中培养基翻转两次以保障供氧，最终那他霉素产量浓度达到6.63、9.53、2.27mg·g-1干重。
实施例6
以250mL三角瓶为发酵容器，并以10g麸皮为碳源，5g油菜籽饼为氮源，0.45g稻谷壳为蓬松载体，0.45g工业甘油为辅助碳源，配置16g干重固态发酵培养基。在固态发酵培养基中加入50％、60％、70％、80％、90％、100％(v/w)的水，并于126℃高压灭菌锅中灭菌30min。向以上培养基中接种接种量为15％(v/w)的褐黄孢链霉菌Z28的42-52h种子培养液，并置于28℃恒温培养箱中发酵培养7天，每天对其中培养基翻转两次以保障供氧，最终那他霉素产量浓度达到6.27、8.31、9.53、8.51、7.25、5.82mg·g-1干重。
实施例7
以250mL三角瓶为发酵容器，并以10g麸皮为碳源，5g油菜籽饼为氮源，0.45g稻谷壳为蓬松载体，0.45g工业甘油为辅助碳源，配置16g干重固态发酵培养基。在固态发酵培养基中加入70％(v/w)的水，并于126℃高压灭菌锅中灭菌30min。向以上培养基中接种接种量为5％、10％、15％、20％、30％(v/w)的褐黄孢链霉菌Z28的42-52h种子培养液，并置于28℃恒温培养箱中发酵培养7天，每天对其中培养基翻转两次以保障供氧，最终那他霉素产量浓度达到5.01、7.74、9.53、8.71、6.54mg·g-1干重。
实施例8
以250mL三角瓶为发酵容器，并以10g麸皮为碳源，5g油菜籽饼为氮源，0.45g稻谷壳为蓬松载体，0.45g工业甘油为辅助碳源，配置16g干重固态发酵培养基。在固态发酵培养基中加入70％(v/w)的水，并于126℃高压灭菌锅中灭菌30min。向以上培养基中接种接种量为15％(v/w)的褐黄孢链霉菌Z28的42-52h种子培养液，并分别置于24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃下恒温培养箱中发酵培养7天，每天对其中培养基翻转两次以保障供氧，最终那他霉素产量浓度达到5.62、7.16、9.53、8.53、7.14、5.68mg·g-1干重。
实施例9
以250mL三角瓶为发酵容器，并以10g麸皮为碳源，5g油菜籽饼为氮源，0.45g稻谷壳为蓬松载体，0.45g工业甘油为辅助碳源，配置16g干重固态发酵培养基。在固态发酵培养基中加入70％(v/w)的水，并于126℃高压灭菌锅中灭菌30min。向以上培养基中接种接种量为15％(v/w)的褐黄孢链霉菌Z28的42-52h种子培养液，并置于28℃下恒温培养箱中发酵培养1-10天，每天对其中培养基翻转两次以保障供氧，最终那他霉素产量浓度达到0、0.12、0.94、2.67、4.78、7.45、9.53、9.51、9.01、8.72mg·g-1干重。
实施例10
以250mL三角瓶为发酵容器，并以10g麸皮为碳源，5g油菜籽饼为氮源，添加1.5％或5％(w/w)的稻谷壳为蓬松载体，0.45g工业甘油为辅助碳源，配置干重固态发酵培养基。在固态发酵培养基中加入70％(v/w)的水，并于126℃高压灭菌锅中灭菌30min。向以上培养基中接种接种量为15％(v/w)的褐黄孢链霉菌Z28的42-52h种子培养液，并置于28℃下恒温培养箱中发酵培养7天，每天对其中培养基翻转两次以保障供氧，最终那他霉素产量浓度达到7.76、9.05mg·g-1干重。
实施例11
以250mL三角瓶为发酵容器，并以10g麸皮为碳源，5g油菜籽饼为氮源，0.45g稻谷壳为蓬松载体，添加2％或4％(w/w)的工业甘油为辅助碳源，配置干重固态发酵培养基。在固态发酵培养基中加入70％(v/w)的水，并于126℃高压灭菌锅中灭菌30min。向以上培养基中接种接种量为15％(v/w)的褐黄孢链霉菌Z28的42-52h种子培养液，并置于28℃下恒温培养箱中发酵培养7天，每天对其中培养基翻转两次以保障供氧，最终那他霉素产量浓度达到8.12、9.01mg·g-1干重。
实施例12以廉价工农业副产物为底物在5L三角瓶中固态发酵合成那他霉素
以5L三角瓶为发酵容器，并以200g麸皮为碳源，100g油菜籽饼为氮源，9g稻谷壳为蓬松载体，9g工业甘油为辅助碳源，配置318g干重固态发酵培养基。加入70％(v/w)的水，并于126℃高压灭菌锅中灭菌30min。向以上培养基中接种接种量为15％(v/w)的褐黄孢链霉菌Z28的42-52h种子培养液，并置于28℃恒温培养箱中发酵培养7天，每天对其中培养基翻转两次以保障供氧，最终那他霉素产量浓度达到9.12mg·g-1干重。
实施例13以廉价工农业副产物为底物在30L固态反应器中发酵合成那他霉素
以30L固态反应器为发酵容器，并以1kg麸皮为碳源，0.5kg油菜籽饼为氮源，50g稻谷壳为蓬松载体，50g工业甘油为辅助碳源，配置1.6kg干重固态发酵培养基。加入70％(v/w)的水，并于134℃高压灭菌锅中灭菌30min。向以上培养基中接种接种量为15％(v/w)的褐黄孢链霉菌Z28的42-52h种子培养液，调搅拌桨转速为10-15rpm进行搅拌，通风量调节为1-3vvm，并以冷却水系统对固态生物反应器进行控温，使其尾气温度达到27-30℃，期间每隔1天向发酵罐中补水一次，以维持50-80％基质含水量，分批发酵培养7天，最终那他霉素产量浓度达到8.32mg·g-1干重。
实施例14以廉价工农业副产物为底物在5L三角瓶中重复分批固态发酵合成那他霉素
以5L三角瓶为发酵容器，并以200g麸皮为碳源，100g油菜籽饼为氮源，9g稻谷壳为蓬松载体，9g工业甘油为辅助碳源，配置318g干重固态发酵培养基。加入70％(v/w)的水，并于126℃高压灭菌锅中灭菌30min。向以上培养基中接种接种量为15％(v/w)的褐黄孢链霉菌Z28的42-52h种子培养液，并置于28℃恒温培养箱中发酵培养7天；7天后，保留其中约10％的发酵渣作为种子，在同样培养条件和营养条件下，进行第二批次的固态发酵，以此类推，共进行7批次重复分批发酵；每天对其中培养基翻转两次以保障供氧，最终那他霉素产量浓度达到9.12mg·g-1干重(第一批)、9.82mg·g-1干重(第二批)、9.76mg·g-1干重(第三批)、9.36mg·g-1干重(第四批)、8.76mg·g-1干重(第五批)、8.01mg·g-1干重(第六批)、7.05mg·g-1干重(第七批)。
对比例1
以250mL三角瓶为发酵容器，并以10g麸皮为碳源，5g油菜籽饼为氮源，配置15g干重固态发酵培养基。在固态发酵培养基中加入70％(v/w)的水，并于126℃高压灭菌锅中灭菌30min。向以上培养基中接种接种量为15％(v/w)的褐黄孢链霉菌Z28的42-52h种子培养液，并置于28℃恒温培养箱中发酵培养7天，每天对其中培养基翻转两次以保障供氧，最终那他霉素产量浓度达到4.14mg·g-1干重。
对比例2
以250mL三角瓶为发酵容器，并以10g麸皮为碳源，5g油菜籽饼为氮源，0.45g稻谷壳为蓬松载体，配置15.45g干重固态发酵培养基。在固态发酵培养基中加入70％(v/w)的水，并于126℃高压灭菌锅中灭菌30min。向以上培养基中接种接种量为15％(v/w)的褐黄孢链霉菌Z28的42-52h种子培养液，并置于28℃恒温培养箱中发酵培养7天，每天对其中培养基翻转两次以保障供氧，最终那他霉素产量浓度达到6.53mg·g-1干重。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (8)

1.一种用于褐黄孢链霉菌生产那他霉素的固态发酵培养基，其特征在于，所述培养基包括碳源、氮源、辅助碳源、蓬松载体和水，以麸皮为碳源，以油菜籽饼为氮源，以稻谷壳为蓬松载体，以工业甘油为辅助碳源，其中，所述碳源和氮源质量比为2：1，所述辅助碳源的质量占碳源、氮源、辅助碳源和蓬松载体的总质量的2-5％，所述蓬松载体的质量占碳源、氮源、辅助碳源和蓬松载体的总质量的2-5％；所述培养基中水的体积mL为碳源、氮源、辅助碳源和蓬松载体的总质量g的70％。
2.权利要求1所述固态发酵培养基的配制方法，其特征在于，所述方法包括：称取碳源和氮源置于培养容器中，加入干燥的蓬松载体，搅拌均匀，再加入辅助氮源，之后加入水使培养基中水的体积mL为碳源、氮源、辅助碳源和蓬松载体的总质量g的70％，搅拌均匀后，封口，高温灭菌。
3.根据权利要求2所述的配制方法，其特征在于，所述碳源和氮源在使用前需经过烘干和粉碎。
4.根据权利要求2所述的配制方法，其特征在于，所述高温灭菌的温度为126-136℃，灭菌时间为20-30min。
5.一种利用褐黄孢链霉菌发酵生产那他霉素的方法，所述方法利用权利要求1所述的固态发酵培养基或权利要求2-4任一项所述配制方法配制得到的固态发酵培养基对褐黄孢链霉菌进行发酵培养，即可得到发酵产物那他霉素。
6.根据权利要求5所述的一种利用褐黄孢链霉菌发酵生产那他霉素的方法，其特征在于，所述发酵过程中，发酵温度为28℃，接种量mL为培养基中碳源、氮源、辅助碳源和蓬松载体的总质量g的15％，发酵时间为7天。
7.根据权利要求6所述的一种利用褐黄孢链霉菌发酵生产那他霉素的方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：
(1)发酵种子培养：将褐黄孢链霉菌接种于固体贝塔纳培养基上，在26-30℃恒温培养箱中培养直至长出褐黄色孢子；挑取孢子置于液体种子培养基摇瓶中，于26-30℃恒温振荡培养箱中培养1-3天；
(2)接种与发酵：按照接种量mL为培养基中碳源、氮源、辅助碳源和蓬松载体的总质量g的15％接种，将培养好的液体发酵种子接入已经配制完成的固态培养基中，搅拌均匀后，置于恒温培养箱中发酵培养7天；
(3)产物的提取与检测：固态发酵结束后，利用甲醇提取方法提取检测那他霉素含量。
8.根据权利要求7所述的一种利用褐黄孢链霉菌发酵生产那他霉素的方法，其特征在于，步骤(1)中所述固体贝塔纳培养基(g·L-1)为：葡萄糖9-11，酵母粉0.5-2，蛋白胨1-3，琼脂18-21，pH 7.0-8.0；所述液体种子培养基(g·L-1)为：葡萄糖18-22，酵母粉5-7，大豆蛋白胨5-7，NaCl 4-6，pH 7.0-8.0；
所述甲醇提取方法具体为：固态发酵结束后，发酵渣先置于35℃电热鼓风干燥箱中8h烘干，再于粉碎机中粉碎，过40目筛备用；以10mL 70％甲醇对以上0.3g发酵渣粉进行提取，提取过程于超声波清洗器中进行30min，此后于离心机中5000g离心10min，上清液用于检测那他霉素含量。
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