CN110016489B - 一种基于细胞固定化技术的纳他霉素发酵工艺 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于细胞固定化技术的纳他霉素发酵工艺，是利用固定化载体对纳他霉素产生菌进行细胞固定，并将固定获得的细胞用于下一批次发酵中，以实现纳他霉素的连续重复分批发酵。经过系统优化，被载体固定的细胞在5批次连续重复分批发酵中均可保持较高的产物合成活力。相比未进行细胞固定化的发酵组，本方法可有效提升生产强度，在工业微生物发酵领域具有较强的应用价值。

Description

一种基于细胞固定化技术的纳他霉素发酵工艺

技术领域

本发明涉及一种纳他霉素的生物合成方法，具体地说是一种基于细胞固定化技术的纳他霉素发酵工艺，属于工业生物技术领域。

背景技术

纳他霉素是一种多烯大环内酯类广谱抗真菌剂，目前主要通过链霉菌发酵合成，其生产菌主要包括恰塔努加链霉菌、褐黄孢链霉菌、利迪链霉菌和纳塔尔链霉菌。鉴于其对霉菌、酵母生长的强烈抑制效果及较高的安全性(GRAS，美国食品药品管理局认定)，纳他霉素目前已被广泛应用于抗真菌治疗、食品绿色防腐以及农业病害真菌治理等领域，具有巨大的社会需求和经济价值。

目前，液态深层发酵是工业化生产纳他霉素的主要途径。为提升纳他霉素的生物合成水平，近年来学术界和产业界进行了大量的研究，其包括高产菌的选育、发酵营养条件的筛选、发酵过程工艺优化以及产物合成前体的添加等。尽管以上研究使得纳他霉素的生物合成水平大幅提高，但是产物发酵时间过长这个行业共性问题一直对纳他霉素合成效率形成制约。“如何缩短发酵时间，提升生产强度”是本领域的一个重要课题。

细胞固定化是一项对细胞活动空间进行一定程度约束的轻工领域技术，指的是采用某种方法将细胞固定在水不溶的惰性载体上，使其在一定空间范围进行生长代谢，进而合成某类代谢产物。细胞固定化通常具有以下优点：1、细胞可多次利用，省去细胞生长所需的发酵底物和发酵时间，减少批次中底物消耗和能量消耗；2、对细胞进行了保护，减弱搅拌剪切力对丝状菌的影响，提高细胞存活率；3、获得更高的细胞浓度，大幅增强生产强度。

发明内容

为缩短纳他霉素发酵时间，提高生产强度，本发明提供了一种基于细胞固定化技术的纳他霉素发酵工艺。本发明针对丝状菌菌丝容易发生缠绕并相互粘连这一特点，开发出一种以褐黄孢链霉菌Z28(Streptomyces gilvosporeus Z28)为生产菌，利用疏松、表面粗糙的人造载体或天然载体进行细胞固定化，进而高效合成纳他霉素的生产方法。本发明方法不仅可大幅缩短发酵时间、提高生产效率，其中固定化细胞还可被多次使用进行重复分批(或补料分批)发酵，节约了细胞生长所需的底物和能量消耗，大幅降低成本，在纳他霉素生物合成中具有重要的工业应用价值。

本发明基于细胞固定化技术的纳他霉素发酵工艺，是利用固定化载体对纳他霉素产生菌进行细胞固定，并将固定获得的细胞用于下一批次发酵中，以实现纳他霉素的连续重复分批发酵。经过系统优化，被载体固定的细胞在5批次连续重复分批发酵中均可保持较高的产物合成活力。相比未进行细胞固定化的发酵组，本方法可有效提升生产强度，在工业微生物发酵领域具有较强的应用价值。

本发明基于细胞固定化技术的纳他霉素发酵工艺，采用补料分批发酵的方式，具体包括如下步骤：

步骤1：发酵种子培养

将褐黄孢链霉菌接种于固体贝塔纳培养基上，于29℃恒温培养箱中培养10天，直至长出褐黄色孢子；用接种环挑取3环孢子置于装有60mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，于29℃、220rpm条件下恒温振荡培养2天；

步骤2：细胞固定化载体的预处理

将不同来源的固定化载体先置于100℃水浴1h，再于鼓风干燥箱中50℃烘干至恒重；将干燥后的载体切割成圆片或绕成圆圈状(直径3cm，厚度4mm)，预称重，记录重量；

步骤3：补料分批发酵

向步骤2预处理后的固定化载体中加入纳他霉素发酵培养基，固液比为6.7～10％(v/v)，于高温灭菌锅中115-121℃灭菌20-30min，随后以8％的接种量接种步骤1获得的发酵种子，于初始pH值7.2、温度29℃、溶氧保持在30％以上的培养条件下发酵，直至纳他霉素合成停止；发酵pH值采用自动流加NaOH溶液的方式控制pH值为7.0直至补料分批发酵结束；当发酵液中葡萄糖浓度低于10g/L时，外源补充60％的无菌葡萄糖溶液以维持发酵液中的糖浓度在10-20g/L之间。

本发明基于细胞固定化技术的纳他霉素发酵工艺，采用重复分批发酵的方式，具体包括如下步骤：

步骤1：发酵种子培养

将褐黄孢链霉菌接种于固体贝塔纳培养基上，于29℃恒温培养箱中培养10天，直至长出褐黄色孢子；用接种环挑取3环孢子置于装有60mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，于29℃、220rpm条件下恒温振荡培养2天；

步骤2：细胞固定化载体的预处理

将不同来源的固定化载体先置于100℃水浴1h，再于鼓风干燥箱中50℃烘干至恒重；将干燥后的载体切割成圆片或绕成圆圈状(直径3cm，厚度4mm)，预称重，记录重量；

步骤3：重复分批发酵

向步骤2预处理后的固定化载体中加入纳他霉素发酵培养基，固液比为6.7-10％(v/v)，用8层纱布封口，于高温灭菌锅中115-121℃灭菌20-30min，随后以8％的接种量接种步骤1获得的发酵种子，于初始pH值7.2、温度29℃、溶氧保持在30％以上的培养条件下发酵；第一批次发酵进行至碳源消耗殆尽，将所有发酵液取出，仅留下固定化载体及其固定的细胞，随后加入已灭菌的新鲜纳他霉素发酵培养基，于初始pH值7.2、温度29℃、溶氧保持在30％以上的培养条件下进行第二批次发酵；以同样的方式进行第三批次发酵、第四批次发酵、第五批次发酵，每批次均发酵至葡萄糖耗尽。

所述固定化载体为人造载体或天然载体。所述人造载体包括人造海绵、不锈钢丝球、尼龙线圈、大孔硅胶等，所述天然载体包括丝瓜络、玉米芯、棉线圈、麦秸秆卷等。

所述固定化载体优选玉米芯或丝瓜络。

所述固体贝塔纳培养基的配方以1L计，包括如下：葡萄糖10g，酵母粉1g，蛋白胨2g，琼脂20g，pH 7.5。

所述液体种子培养基的配方以1L计，包括如下：葡萄糖20g，酵母粉6g，大豆蛋白胨6g，NaCl 5g，pH 7.5。

所述纳他霉素发酵培养基的配方以1L计，包括如下：葡萄糖80g，酵母粉10g，大豆蛋白胨20g，NaCl 5g，pH 7.5。

所述褐黄孢链霉菌优选为褐黄孢链霉菌Z28(Streptomyces gilvosporeus Z28)。

与传统纳他霉素发酵生产方法相比，本发明采用细胞固定化手段重复多批次发酵生产纳他霉素的方法具有以下优点：

1、能够在多批次发酵中大幅提升纳他霉素的生产强度，缩短各批次的发酵时间；

2、固定化细胞在首次分批发酵过程中自然生成，不额外占用发酵时间，且此部分细胞发酵活力强，可在后期多批次分批发酵中重复使用；

3、在多批次发酵模式中，只需在第一批次进行发酵罐的清洗和灭菌，后期多批次发酵期间只需进行简单的培养基更换，从而进一步提升发酵生产的效率，节约洗涤水和用于灭菌的高温蒸汽消耗。

下面结合具体实施例，可以更好地理解本发明。实施例所描述的具体的载体筛选、工艺条件以及结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权力要求书中所详细描述的本发明。

具体实施方式

本发明的生物反应器包括250mL三角瓶和5L液态发酵罐两种。

本发明细胞固定化载体筛选实验均在250mL三角瓶中完成，细胞固定化补料分批发酵、重复分批发酵在5L发酵罐中进行。具体操作步骤如下：

一、菌种：褐黄孢链霉菌Z28(Streptomycesgilvosporeus Z28)。

二、培养基配方：

1、固体贝塔纳培养基(g·L^-1)：葡萄糖10，酵母粉1，蛋白胨2，琼脂20，pH 7.5。

2、液体种子培养基(g·L^-1)：葡萄糖20，酵母粉6，大豆蛋白胨6，NaCl 5，pH 7.5。

3、纳他霉素发酵培养基(g·L^-1)：葡萄糖80，酵母粉10，大豆蛋白胨20，NaCl 5，pH7.5。

三、实验步骤：

1、发酵种子培养

将褐黄孢链霉菌Z8接种于固体贝塔纳培养基上，于29℃恒温培养箱中培养10天，直至长出褐黄色孢子；用接种环挑取3环孢子置于装液量60mL的500mL液体种子培养基三角瓶中，于29℃恒温振荡培养箱中220rpm培养2天；

2、细胞固定化载体的预处理

不同来源的固定化载体先置于100℃水浴1h，再于鼓风干燥箱中50℃烘干至恒重。将干燥后的载体切割成圆片或绕成圆圈状(直径3cm，厚度4mm)，预称重，记录重量。

3、细胞固定化载体的初筛

在250mL三角瓶中，按纳他霉素发酵培养基配方配置液态培养基，加入预处理过的固定化载体，用8层纱布封口，于高温灭菌锅中115℃灭菌20min；将成熟的发酵种子以8％接种量接于以上发酵培养基，于29℃恒温振荡培养箱中培养3天，结束后测定发酵液中纳他霉素浓度、固定化菌体干重及游离菌体干重，以高固定化菌体量和高那他霉素产量为主要指标，筛选最优细胞固定化载体。

4、基于重复分批发酵策略的细胞固定化载体复筛

初筛获得两种最优的固定化载体(玉米芯和丝瓜络)，为进一步确定两者的实际效用，本发明采用以上重复分批发酵的手段，在多批次发酵实验中考察两种最优固定化载体的效能。每批次结束后，除留下被固定化载体吸附的菌体外，其余全部培养基均取出，用于纳他霉素浓度和游离菌体干重的测定，最终得出丝瓜络在重复分批发酵种的效能更好。具体如下：在三角瓶培养中，当上一批发酵结束后，在超净工作台中用无菌移液管将发酵液全部吸出，留下由固定化载体吸附的细胞，将新鲜的发酵培养基加入进行新一轮的发酵，由此进行多批次重复分批发酵。其中，第1批次发酵持续3天，此后4个批次的发酵均持续2天，连续进行5批次三角瓶发酵。在对照(不添加固定化载体)组的重复分批发酵试验种，每批次间预留8％发酵液作为下一批次的种子，在加入新鲜培养基后进行下一轮培养。同样，对照组第一批次发酵持续3天，此后每批次持续2天，共进行5批次重复分批发酵试验。

5、5L液态发酵罐中的补料分批发酵试验

在5L液态发酵罐中，将预处理过后的丝瓜络用棉绳固定在发酵罐挡板上，以不阻碍搅拌和液体流型为宜，进行纳他霉素的细胞固定化补料分批发酵，在此过程中每隔12h测定纳他霉素浓度、游离菌体干重和残糖浓度，并与发酵对照组(不进行细胞固定化的纳他霉素补料分批发酵)进行比较，考察细胞固定化对于单一批次纳他霉素发酵的影响。本实验中，5L发酵罐采用2组6平直叶涡轮搅拌桨，发酵罐中装液量设定为3L，选用那他霉素发酵培养基，通气量为1vvm，转速设定为200-800rpm，通过增加转速的方式将整个发酵过程的溶解氧控制在30％以上，发酵液pH采用硫酸或氢氧化钠调控至pH7.0。发酵罐灭菌采用离位灭菌形式，于121℃高温灭菌20min，待培养基冷却到29℃后，接种8％的成熟种子液进行发酵。本试验结果证实，在第一批次发酵72h后，纳他霉素合成速率大幅降低，不具有进一步发酵的潜力，故后续补料流程可省略。

6、5L发酵罐中的多次重复分批发酵

采用重复分批发酵的形式进行纳他霉素的发酵合成，其发酵参数与5中所述一致。当第一批次分批发酵结束后(80g/L葡萄糖耗尽)，将所有发酵液经取样管取出，只留下内部的固定化细胞，此后将灭菌后的新鲜培养基从补料管泵入，装液量同样为3L，进行第二批次的纳他霉素补料分批发酵。其后第三、第四、第五批次均采用该方式进行发酵液的取出和新鲜培养基的接入。每12h取样，进行纳他霉素浓度和菌体量的测定。

7、检测方法

发酵液中纳他霉素浓度检测：将1mL发酵液与9mL甲醇混合，于超声波清洗器中振荡提取20min，4500g离心10min，上清液过0.45μm的有机滤膜后，采用HPLC进行浓度检测。使用C18色谱柱，流动相设定为甲醇-水混合液(甲醇60％，水40％)，柱温控制为25℃，进样量10μL。

实施例

实施例1：纳他霉素发酵合成中细胞固定化载体的初步筛选

以250mL三角瓶为发酵容器，并以多种合成材料(人造海绵、不锈钢丝球、尼龙线圈、大孔硅胶)和天然材料(丝瓜络、玉米芯、棉线圈、麦秸秆卷)为载体进行纳他霉素三角瓶发酵。用于发酵种子培养的500mL三角瓶中含有60mL种子培养基，用于纳他霉素发酵的250mL三角瓶中装有30mL发酵培养基，培养基在高压灭菌锅中115℃处理20min。发酵种子于29℃恒温振荡培养箱中220rpm培养2天，此后以8％的接种量(v/v)转接于发酵培养基中，并于29℃恒温振荡培养箱中220rpm培养3天。最终的发酵液中纳他霉素浓度分别为对照1.2g/L、丝瓜络3g/L、玉米芯4.4g/L、麦秆1.4g/L、脱脂棉1.6g/L、不锈钢丝网1.2g/L、尼龙线圈1.0g/L、人造海绵1.8g/L、大孔硅胶0.4g/L，游离细胞浓度分别为对照16.3g/L、丝瓜络9.8g/L、玉米芯13.8g/L、麦秆10.5g/L、脱脂棉10.2g/L、不锈钢丝网9.9g/L、尼龙线圈11.2g/L、人造海绵9.4g/L、大孔硅胶12.2g/L，固定化细胞浓度分别为对照0g/L、丝瓜络12.4g/L、玉米芯16.3g/L、麦秆7.4g/L、脱脂棉5.0g/L、不锈钢丝网2.8g/L、尼龙线圈2.6g/L、人造海绵6.9g/L、大孔硅胶2.3g/L。以上数据显示，玉米芯和丝瓜络具有较强的细胞固定能力，且能够提升三角瓶发酵中的纳他霉素产量，故作为下一步的试验对象。

实施例2：基于玉米芯或丝瓜络的纳他霉素重复分批发酵

以250mL三角瓶为发酵容器，并两种天然材料(丝瓜络、玉米芯)为载体进行纳他霉素的重复分批发酵。用于发酵种子培养的500mL三角瓶中含有60mL种子培养基，用于纳他霉素发酵的250mL三角瓶中装有30mL发酵培养基，培养基在高压灭菌锅中115℃处理15min。发酵种子于29℃恒温振荡培养箱中220rpm培养2天，此后以8％的接种量(v/v)转接于发酵培养基中，并置于220rpm恒温振荡培养箱中29℃进行培养。第一批次发酵结束后，在超净工作台中用无菌移液管吸出所有液态发酵液，只留下被载体固定的细胞，并将预灭菌过的新鲜发酵培养基加入，此后置于同样的培养环境中进行第二批次发酵。后续多批次发酵均采用以上方法实现培养基的更换，且除第一批次发酵持续3天，后续4个批次的发酵均持续2天，共完成5个批次的发酵。对照试验在前一批次和后一批次发酵之间，除吸取上批次发酵液外，留下8％的前批次发酵液作为后批次发酵的种子，除此之外的其他操作均与细胞固定化载体添加发酵一致。第一批次发酵结束各实验组中的纳他霉素浓度分别为对照1.2g/L、玉米芯4.8g/L、丝瓜络3.2g/L；第二批次发酵结束各实验组中的纳他霉素浓度分别为对照1.4g/L、玉米芯1.2g/L、丝瓜络3.6g/L；第三批次发酵结束各实验组中的纳他霉素浓度分别为对照0.8g/L、玉米芯0.6g/L、丝瓜络3.2g/L；第四批次发酵结束各实验组中的纳他霉素浓度分别为对照0g/L、玉米芯1.0g/L、丝瓜络3.2g/L；第五批次发酵结束各实验组中的纳他霉素浓度分别为对照0g/L、玉米芯0.4g/L、丝瓜络3.4g/L。以上试验结果显示，在三角瓶发酵中，丝瓜络的添加能够在5批次重复分批发酵中持续促进纳他霉素的合成，故被选用为后续5L发酵罐纳他霉素发酵中的优良细胞固定化载体材料。

实施例3：纳他霉素5L发酵罐补料分批发酵

以5L液体发酵罐为容器，在加入2.76L液体发酵培养基后，于高温高压灭菌锅中121℃灭菌30min。其中，葡萄糖单独灭菌，以避免发生梅拉德反应。将0.24L预先培养的种子接入发酵罐中，于初始pH7.2、温度29℃、溶氧保持在30％以上的培养条件下发酵。发酵pH值采用自动流加NaOH溶液的方式控制在pH7.0直至补料分批发酵结束。当发酵液中葡萄糖浓度低于10g/L时，外源补充60％的无菌葡萄糖溶液以维持发酵液中的糖浓度在10-20g/L之间。当发酵进行到120h时，纳他霉素合成几乎停止，故终止发酵。最终，纳他霉素终浓度为3.0g/L。

实施例4：基于载体丝瓜络的纳他霉素5L发酵罐补料分批发酵

以5L液体发酵罐为容器，将经水煮烘干后的丝瓜络绑定在发酵罐挡板及溶氧电极上，在加入2.76L液体发酵培养基后，于高温高压灭菌锅中121℃灭菌30min。其中，葡萄糖单独灭菌，以避免发生梅拉德反应。将0.24L预先培养的种子接入发酵罐中，于初始pH7.2、温度29℃、溶氧保持在30％以上的培养条件下发酵。发酵pH值采用自动流加NaOH溶液的方式控制在pH7.0直至补料分批发酵结束。当发酵液中葡萄糖浓度低于10g/L时，外源补充60％的无菌葡萄糖溶液以维持发酵液中的糖浓度在10-20g/L之间。当发酵进行到132h时，纳他霉素合成几乎停止，故终止发酵。最终，采用丝瓜络进行细胞固定化发酵的纳他霉素终浓度为5.2g/L，相比对照(不进行细胞固定化，3.0g/L)发酵提升了75.1％。

实施例5：基于游离细胞的纳他霉素5L发酵罐重复分批发酵

以5L液体发酵罐为容器，在加入2.76L液体发酵培养基后，于高温高压灭菌锅中121℃灭菌30min。其中，葡萄糖单独灭菌，以避免发生梅拉德反应。将0.24L预先培养的种子接入发酵罐中，于初始pH7.2、温度29℃、溶氧保持在30％以上的培养条件下发酵。发酵pH值采用自动流加NaOH溶液的方式控制在pH7.0直至分批发酵结束。当第一批次发酵进行至64h，此时碳源几乎消耗殆尽，故结束本批次发酵，并立即进行下批次发酵。期间将发酵液取出，只留下8％的发酵液作为下批次发酵种子，此后将已灭菌的新鲜培养基加入发酵罐中，进行第二批次分批发酵。以同样的方式进行此后的第三批次、第四批次、第五批次发酵，每批次发酵时间分别为64h、60h、65h、77h、89h。其各批次发酵的纳他霉素最终浓度分别为3g/L(第一批次发酵)、3.8g/L(第二批次发酵)、2g/L(第三批次发酵)、0.6g/L(第四批次发酵)、0g/L(第五批次发酵)。此实验数据表明，采用游离细胞进行重复分批发酵，细胞将逐渐衰老，发酵时间延长，纳他霉素生产能力大幅下降。

实施例6：基于丝瓜络载体的纳他霉素5L发酵罐重复分批发酵

以5L液体发酵罐为容器，将经水煮烘干后的丝瓜络绑定在发酵罐挡板及溶氧电极上，在加入2.76L液体发酵培养基后，于高温高压灭菌锅中121℃灭菌30min。其中，葡萄糖单独灭菌，以避免发生梅拉德反应。将0.24L预先培养的种子接入发酵罐中，于初始pH7.2、温度29℃、溶氧保持在30％以上的培养条件下发酵。发酵pH值采用自动流加NaOH溶液的方式控制在pH7.0直至分批发酵结束。当第一批次发酵进行至50h，此时碳源几乎消耗殆尽，故结束本批次发酵，并立即进行下批次发酵。期间将所有发酵液取出，只留下被丝瓜络固定得到的细胞，此后将已灭菌的新鲜培养基加入发酵罐中，进行第二批次分批发酵。以同样的方式进行此后的第三批次、第四批次、第五批次发酵，每批次发酵时间分别为50h、52h、51h、52h、59h。其各批次发酵的纳他霉素最终浓度分别为5.2g/L(第一批次发酵)、5.4g/L(第二批次发酵)、5.6g/L(第三批次发酵)、4.8g/L(第四批次发酵)、4.2g/L(第五批次发酵)，纳他霉素发酵产量分别较对照批次(不采用细胞固定化技术的重复分批发酵)提升74.5％(第一批次发酵)、42.1％(第二批次发酵)、180％(第三批次发酵)、700％(第四批次发酵)。其发酵时间较对照批次(不采用细胞固定化技术的重复分批发酵)缩短21.9％(第一批次发酵)、13.3％(第二批次发酵)、21.5％(第三批次发酵)、32.5％(第四批次发酵)、33.7％(第五批次发酵)。其生产强度分别较对照批次(不采用细胞固定化技术的重复分批发酵)提升121％(第一批次发酵)、67.7％(第二批次发酵)、254.8％(第三批次发酵)、1050.0％(第四批次发酵)。此实验数据表明，采用细胞固定化技术能够在重复分批发酵中有效缩短发酵时间，提升纳他霉素产量，从而提升生产强度，减少资源和能源消耗，在纳他霉素发酵合成方面具有重要的应用价值。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。

Claims (2)

1.一种基于细胞固定化技术的纳他霉素发酵工艺，采用补料分批发酵的方式，其特征在于包括如下步骤：

步骤1：发酵种子培养

将褐黄孢链霉菌接种于固体贝塔纳培养基上，于29℃恒温培养箱中培养10天，直至长出褐黄色孢子；用接种环挑取3环孢子置于装有60mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，于29℃、220rpm条件下恒温振荡培养2天；

步骤2：细胞固定化载体的预处理

将不同来源的固定化载体先置于100℃水浴1h，再于鼓风干燥箱中50℃烘干至恒重；将干燥后的载体切割成圆片或绕成圆圈状，预称重，记录重量；

步骤3：补料分批发酵

向步骤2预处理后的固定化载体中加入纳他霉素发酵培养基，于高温灭菌锅中115-121℃灭菌20-30min，随后接种步骤1获得的发酵种子，培养发酵直至纳他霉素合成停止；发酵pH值采用自动流加NaOH溶液的方式控制pH值为7.0直至补料分批发酵结束；当发酵液中葡萄糖浓度低于10g/L时，外源补充60％的无菌葡萄糖溶液以维持发酵液中的糖浓度在10-20g/L之间；

所述固定化载体为人造载体或天然载体；所述人造载体包括人造海绵、不锈钢丝球、尼龙线圈、大孔硅胶，所述天然载体包括丝瓜络、玉米芯、棉线圈、麦秸秆卷；

所述固体贝塔纳培养基的配方以1L计，包括如下：葡萄糖10g，酵母粉1g，蛋白胨2g，琼脂20g，pH 7.5；

所述液体种子培养基的配方以1L计，包括如下：葡萄糖20g，酵母粉6g，大豆蛋白胨6g，NaCl 5g，pH 7.5；

所述纳他霉素发酵培养基的配方以1L计，包括如下：葡萄糖80g，酵母粉10g，大豆蛋白胨20g，NaCl 5g，pH 7.5；

步骤3中，向步骤2预处理后的固定化载体中加入纳他霉素发酵培养基的固液比为6.7～10％；

步骤3中，以8％的接种量接种步骤1获得的发酵种子，于初始pH值7.2、温度29℃、溶氧保持在30％以上的培养条件下发酵，直至纳他霉素合成停止。

2.一种基于细胞固定化技术的纳他霉素发酵工艺，采用重复分批发酵的方式，其特征在于包括如下步骤：

步骤1：发酵种子培养

将褐黄孢链霉菌接种于固体贝塔纳培养基上，于29℃恒温培养箱中培养10天，直至长出褐黄色孢子；用接种环挑取3环孢子置于装有60mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，于29℃、220rpm条件下恒温振荡培养2天；

步骤2：细胞固定化载体的预处理

将不同来源的固定化载体先置于100℃水浴1h，再于鼓风干燥箱中50℃烘干至恒重；将干燥后的载体切割成圆片或绕成圆圈状，预称重，记录重量；

步骤3：重复分批发酵

向步骤2预处理后的固定化载体中加入纳他霉素发酵培养基，于高温灭菌锅中115-121℃灭菌20-30min，随后接种步骤1获得的发酵种子，培养发酵；第一批次发酵进行至碳源消耗殆尽，将所有发酵液取出，仅留下固定化载体及其固定的细胞，随后加入已灭菌的新鲜纳他霉素发酵培养基，于初始pH值7.2、温度29℃、溶氧保持在30％以上的培养条件下进行第二批次发酵；以同样的方式进行第三批次发酵、第四批次发酵、第五批次发酵，每批次发酵至葡萄糖全部耗尽为止；

所述固定化载体为人造载体或天然载体；所述人造载体包括人造海绵、不锈钢丝球、尼龙线圈、大孔硅胶，所述天然载体包括丝瓜络、玉米芯、棉线圈、麦秸秆卷；

所述固体贝塔纳培养基的配方以1L计，包括如下：葡萄糖10g，酵母粉1g，蛋白胨2g，琼脂20g，pH 7.5；

所述液体种子培养基的配方以1L计，包括如下：葡萄糖20g，酵母粉6g，大豆蛋白胨6g，NaCl 5g，pH 7.5；

所述纳他霉素发酵培养基的配方以1L计，包括如下：葡萄糖80g，酵母粉10g，大豆蛋白胨20g，NaCl 5g，pH 7.5；

步骤3中，向步骤2预处理后的固定化载体中加入纳他霉素发酵培养基的固液比为6.7～10％；

步骤3中，以8％的接种量接种步骤1获得的发酵种子。