CN103571818A - 一种桔青霉的固定化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种桔青霉的固定化方法，以经过预处理的纤维材料作为固定化介质，将核酸酶P1的生产菌株桔青霉活化后接入发酵容器中培养24～60h，使菌株在培养过程中吸附于纤维材料上。本发明中，固定化细胞所用的纤维材料经过了相应的预处理过程，其作为固定化材料成本低、无毒、易得、制备过程简单，适合大规模生产。经过预处理的纤维材料具有较高的孔隙率和比表面积，因此单位体积固定的细胞数目多，保证了高密度发酵的优势，而且具有良好的传质性能，并缩短了发酵周期。
Description
技术领域
本发明属于工业生物技术领域，涉及桔青霉的固定化方法。
背景技术
核酸酶P1是具有重要应用价值的酶制剂，主要催化特性为裂解RNA和DNA中的3’,5’-磷酸二酯键，生成5’-核苷酸以及在低温环境下分解单核苷酸和寡核苷酸中的3’-磷酸单酯键，是核苷酸工业生产中必不可少的原料。核酸酶P1的生产通常采用固体或液体发酵。固体发酵简便、成本低，但占地面积大、生产效率低，而且产生的分生孢子易污染环境。深层发酵避免了上述缺点，但成本较高。
随着固定化技术的快速发展，现该技术已广泛应用于生物发酵领域。将桔青霉菌丝体固定在谷梗或其他一些惰性材料上，重复使用，既降低了发酵液粘度，利于氧气及营养物质的传递，提高了细胞利用率和生物反应速率，同时也便于产物的分离提取等后处理加工。近年来，核酸酶P1的固定化发酵生产得到了越来越多的关注。
目前应用于桔青霉的固定方法常见的有吸附法和包埋法。夏黎明等利用吸附固定在多孔聚酯载体上的桔青霉菌丝生产核酸酶，酶活可高达513U/mL，其产酶效率是游离菌丝的3.6倍，连续生产28批，产酶水平没有下降，平均酶活达到507U/mL。王克明等先使用玉米芯颗粒吸附桔青霉孢子，再用质量分数为1.5%的海藻酸钠包埋吸附固定化细胞玉米芯颗粒，于摇瓶中培养50h后，发酵液中核酸酶P1的活力高达503U/mL，并经过了30批次连续重复发酵产酶稳定在较高水平。宋威等采用聚乙烯醇与海藻酸钠比例为2︰1的复合载体固定桔青霉的孢子，连续发酵20个周期后，生产的核酸酶酶P1活力损失不大，始终保持在468～501U/mL。但是，为了更进一步提高核酸酶P1的生产效率，简化生产工艺，降低生产成本，仍需要寻找更加天然、高效的固定化材料。
近年来，以纤维材料作为固定化介质的纤维床生物反应器作为一种新型固定化方法受到了广泛关注。用纤维材料做固定材料，不仅工艺稳定，无毒，廉价易得，吸附效果好，重复使用率高，而且对细胞活性具有较好的保护作用，但目前为止纤维材料作为固定材料而应用于核酸酶P1的发酵却鲜有报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种稳定高效的桔青霉的固定化方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种桔青霉的固定化方法，以经过预处理的纤维材料作为固定化介质，将核酸酶P1的生产菌株桔青霉活化后接入发酵容器中培养24～60h，使菌株在培养过程中吸附于纤维材料上。
其中，所述的纤维材料为棉纤维织物、活性炭纤维、纳米纤维、竹纤维、聚乙烯醇纤维、聚氨酯泡沫、丝绸、细菌纤维素膜、丝瓜瓤和甘蔗渣中的任意一种或几种。
其中，所述的预处理，具体步骤如下：
（1）将纤维材料在沸水中煮沸后烘干；
（2）将经过步骤（1）处理后的纤维材料置于浓度为1～100g/L的表面改性剂水溶液中浸泡1～20小时，并用盐酸调节溶液的pH值至7.0，再将纤维材料置于去离子水中充分漂洗后烘干；
（3）将经过步骤（2）处理后的纤维材料置于浓度为1～100g/L的交联剂水溶液中浸泡1～20小时，再将纤维材料置于去离子水中充分漂洗后烘干，保存备用。
所述的表面改性剂为聚乙烯亚胺、聚醚酰亚胺、丁二酰亚胺、二乙三胺和二甲胺基丙胺中的任意一种或几种；所述的交联剂为戊二醛、乙二醛、琥珀醛、2-甲基-1,3-丙二醛和(2S,3R)-2,3-二羟基丁二醛中的任意一种或几种。
其中，当发酵容器为摇瓶时，纤维材料以50g/L的添加量平铺固定于摇瓶底部的不锈钢丝圈上。
其中，当发酵容器为气升式发酵罐时，将纤维材料裁剪成长条状，沿垂直方向螺旋缠绕在多条不锈钢丝条上，如图1所示。
其中，当发酵容器为自吸式发酵罐时，将纤维材料平铺在与之大小形状均相同的钢丝网上，纤维材料与钢丝网一起卷成筒状，如图2所示。
有益效果：相对于现有技术，本发明优势如下：
1、本发明所采用的纤维材料为化学惰性，对细胞没有毒害作用，机械强度高，也不会被细胞代谢分解，不影响微生物的生长代谢，死细胞自行脱落，而活细胞能够实现自增殖过程，始终维持很高的催化效率。
2、选用的纤维材料具有较高的孔隙率和比表面积，因此单位体积固定的细胞数目多，不仅固定化的细胞密度大，保证了高密度发酵的优势，而且具有良好的传质性能，传质效率高，并缩短了发酵周期，摇瓶发酵的时间由游离发酵的48-65小时下降至36-50h，气升式纤维床反应器的发酵时间也由游离发酵的72-96小时下降至60-82小时，自吸式纤维床反应器的发酵时间也由游离发酵的65-84小时下降至48-76小时。
附图说明
图1为气升式发酵罐中纤维材料的固定方式示意图；其中，1表示不锈钢丝条；2表示纤维材料。
图2为自吸式发酵罐中纤维材料的固定方式示意图；其中，1表示不锈钢丝网；2表示纤维材料。
图3为采用本发明的核酸酶P1固定化发酵方法的示意图；其中，1表示补料瓶；2表示蠕动泵；3表示接种口；4表示排气口；5表示空压机；6表示转子流量计；7表示空气过滤器；8表示空气分布器。
图4为吸附于棉纤维材料上的桔青霉生物膜样品的SEM照片。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域的技术人员容易理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
以下实施例所使用的生产核酸酶P1的菌株为桔青霉YL104，该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC NO.2014，记载在中国专利CN101067116A中。
实施例1：纤维材料固定化介质的制备。
天然纤维材料由于和微生物细胞的表面特性相近，因此在一定程度上阻碍了菌体细胞吸附到纤维材料表面，所以要对纤维材料进行相关预处理，以促进细胞吸附到纤维载体表面。就上述纤维材料的预处理方法所确定的一个具体实施方案：
（1）将纤维材料在沸水中煮沸0.1-5小时后20-100℃下烘干；
（2）将纤维材料置于浓度为1～100g/L的表面改性剂水溶液中浸泡1-20小时，并用盐酸调节溶液的pH至7.0，再将纤维材料置于去离子水中充分漂洗后60-80℃烘干；
（3）将纤维材料置于浓度为1～100g/L的交联剂水溶液中浸泡1-20小时，再将纤维材料置于去离子水中充分漂洗后60-80℃烘干，4℃保存备用；
所述的表面改性剂为聚乙烯亚胺、聚醚酰亚胺、丁二酰亚胺、二乙三胺和二甲胺基丙胺中的任意一种或几种；所述的交联剂为戊二醛、乙二醛、琥珀醛、2-甲基-1,3-丙二醛和(2S,3R)-2,3-二羟基丁二醛中的任意一种或几种。
例如可以采用如下具体的预处理过程；
方式一：
（1）将活性炭纤维在沸水中煮沸1小时后60℃下烘干；
（2）将活性炭纤维置于浓度为10g/L的二甲胺基丙胺水溶液中浸泡4小时，并用盐酸调节溶液的pH至7.0，再将活性炭纤维置于去离子水中充分漂洗后60℃烘干；
（3）将活性炭纤维置于浓度为10g/L的乙二醛水溶液中浸泡4小时，再将活性炭纤维置于去离子水中充分漂洗后60℃烘干，4℃保存备用；
方式二：
（1）将棉纤维在沸水中煮沸2小时后80℃下烘干；
（2）将棉纤维置于浓度20g/L的聚乙烯亚胺水溶液中浸泡2小时，并用盐酸调节溶液的pH至7.0，再将棉纤维置于去离子水中充分漂洗后60℃烘干；
（3）将棉纤维置于浓度为15g/L的戊二醛水溶液中浸泡2小时，再将棉纤维置于去离子水中充分漂洗后60℃烘干，4℃保存备用；
方式三：
（1）将竹纤维在沸水中煮沸1小时后60℃下烘干；
（2）将竹纤维置于浓度为5g/L的丁二酰亚胺水溶液中浸泡3小时，并用盐酸调节溶液的pH至7.0，再将竹纤维置于去离子水中充分漂洗后60℃烘干；
（3）将竹纤维置于浓度为10g/L的2-甲基-1,3-丙二醛水溶液中浸泡3小时，再将竹纤维置于去离子水中充分漂洗后80℃烘干，4℃保存备用；
预处理后的纤维材料的孔隙率＞90%，比表面积＞30m2/m3，不仅固定化的细胞密度大，而且具有良好的传质性能。
实施例2：采用活性炭纤维固定化介质于摇瓶中生产核酸酶P1。
按照实施例1中方式一所述的方法将活性炭纤维进行预处理，将处理过的活性炭纤维以50g/L的添加量平铺在直径略小于三角瓶直径的钢丝圈上进行固定，作为摇瓶中固定化发酵生产核酸酶P1的固定化介质。
将桔青霉菌株于麦芽汁斜面上28～30℃培养5～7天进行活化，用无菌水充分洗涤桔青霉斜面得到孢子悬液，转接于装100mL液体发酵培养基（组分：葡萄糖50g/L，蛋白胨5g/L，磷酸二氢钾0.04g/L，磷酸氢二钾0.04g/L，硫酸镁0.05g/L，氯化钙0.05g/L，硫酸锌0.05g/L，pH5-7）的500mL的摇瓶中，于28～30℃，250rpm摇床中培养24-60h，待发酵结束，将发酵液全部移出，测定发酵液中核酸酶P1的酶活，并补入相同体积的新鲜发酵培养基进行下一批发酵。摇瓶中活性炭纤维固定化发酵的时间由游离发酵的48-65小时下降至36-50h，连续生产22批，产酶水平基本没有下降，酶活始终保持在450-500U/mL。
实施例3：以棉纤维为固定化介质的气升式纤维床反应器生产核酸酶P1。
按实施例1中方式二所述的方法将棉纤维进行预处理，如图1所示，将棉纤维材料裁剪成长条状，呈螺旋状缠绕在不锈钢丝柱的侧柱上，作为气升式发酵罐中发酵生产核酸酶P1的固定化介质。
将桔青霉菌进行斜面培养，斜面孢子用无菌水洗下接入三角瓶，在无菌状态下接入15升内循环气升式发酵罐中进行游离培养，培养基为葡萄糖50g/L，蛋白胨5g/L，磷酸二氢钾0.04g/L，磷酸氢二钾0.04g/L，硫酸镁0.05g/L，氯化钙0.05g/L，硫酸锌0.05g/L，pH5-7，培养温度28～30℃，罐压0.8～1.5MPa，通气量1.2～1.8m3/h，待发酵液中核酸酶P1的酶活达到100U/mL以上，用无菌压缩空气将发酵液全部移至一气升式纤维床反应器中，培养基成分和发酵参数同上，使菌株边发酵边固定于纤维床上，测定发酵液中的酶活，当发酵液中的酶活达到400U/mL时，将发酵液全部移出，并补入新鲜培养基进行下一批发酵。气升式纤维床反应器的发酵时间由游离发酵的72-96小时下降至62-80小时，连续生产了15批，发酵周期稳定在同一水平。
实施例4：以竹纤维为固定化介质的自吸式纤维床反应器生产核酸酶P1。
以实施例1中方式三所述的方法对竹纤维进行预处理，如图2，将处理过的竹纤维材料2以15g/L的添加量平铺在与之大小形状均相同的钢丝网1上，与其卷成筒状，纤维材料层与层之间保持疏松均匀，填充在自吸式发酵罐中作为生产核酸酶P1的固定化介质。
将桔青霉菌株在斜面上活化后，接入气升罐中进行游离培养，待发酵液中开始有酶活后，用无菌压缩空气将发酵液全部移至自吸式纤维床反应器中进行固定化发酵，培养基成分为葡萄糖50g/L，蛋白胨5g/L，磷酸二氢钾0.04g/L，磷酸氢二钾0.04g/L，硫酸镁0.05g/L，氯化钙0.05g/L，硫酸锌0.05g/L，pH5-7，培养温度28～30℃，罐压0.5～1.2MPa，通气量0.4～1.0m3/h，待发酵液中核酸酶P1的酶活达到400U/mL时，换入新鲜的发酵液进行下一批发酵。从第二批发酵开始，培养基成分调整为葡萄糖40g/L，蛋白胨5g/L，磷酸二氢钾0.032g/L，磷酸氢二钾0.032g/L，硫酸镁0.05g/L，氯化钙0.05g/L，硫酸锌0.05g/L，pH5-7，以节约发酵成本，并按第一批的发酵工艺参数进行后续发酵。自吸式纤维床反应器的发酵时间由游离发酵的65-84小时下降至48-76小时，连续进行了12批的反复批次发酵，产酶水平没有下降，发酵工艺稳定。
Claims (7)
1.一种桔青霉的固定化方法，其特征在于，以经过预处理的纤维材料作为固定化介质，将核酸酶P1的生产菌株桔青霉活化后接入发酵容器中培养24～60h，使菌株在培养过程中吸附于纤维材料上。
2.根据权利要求1所述的桔青霉的固定化方法，其特征在于，所述的纤维材料为棉纤维织物、活性炭纤维、纳米纤维、竹纤维、聚乙烯醇纤维、聚氨酯泡沫、丝绸、细菌纤维素膜、丝瓜瓤和甘蔗渣中的任意一种或几种。
3.根据权利要求1所述的桔青霉的固定化方法，其特征在于，所述的预处理，具体步骤如下：
（1）将纤维材料在沸水中煮沸后烘干；
（2）将经过步骤（1）处理后的纤维材料置于浓度为1～100g/L的表面改性剂水溶液中浸泡1～20小时，并用盐酸调节溶液的pH值至7.0，再将纤维材料置于去离子水中充分漂洗后烘干；
（3）将经过步骤（2）处理后的纤维材料置于浓度为1～100g/L的交联剂水溶液中浸泡1～20小时，再将纤维材料置于去离子水中充分漂洗后烘干，保存备用。
4.根据权利要求3所述的桔青霉的固定化方法，其特征在于，所述的表面改性剂为聚乙烯亚胺、聚醚酰亚胺、丁二酰亚胺、二乙三胺和二甲胺基丙胺中的任意一种或几种；所述的交联剂为戊二醛、乙二醛、琥珀醛、2-甲基-1,3-丙二醛和(2S,3R)-2,3-二羟基丁二醛中的任意一种或几种。
5.根据权利要求1所述的桔青霉的固定化方法，其特征在于，当发酵容器为摇瓶时，纤维材料以50g/L的添加量平铺固定于摇瓶底部的不锈钢丝圈上。
6.根据权利要求1所述的桔青霉的固定化方法，其特征在于，当发酵容器为气升式发酵罐时，将纤维材料裁剪成长条状，沿垂直方向螺旋缠绕在多条不锈钢丝条上。
7.根据权利要求1所述的桔青霉的固定化方法，其特征在于，当发酵容器为自吸式发酵罐时，将纤维材料平铺在与之大小形状均相同的钢丝网上，纤维材料与钢丝网一起卷成筒状。
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