CN109852596A - 一种利用固定化桔青霉发酵制备核酸酶p1的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用固定化桔青霉发酵制备核酸酶P1的方法，以经过化学修饰的多孔网状材料作为固定化介质，提供了适用于不同发酵容器的固定化方法，应用于核酸酶P1的固定化发酵生产。本发明中，固定化细胞所用的载体材料经过了相应的化学修饰过程，其作为固定化载体具有稳定、生物相容性好、传质效率高、可重复利用的特点，不仅实现了桔青霉在各种发酵容器中的反复批次发酵的生产应用，大大缩短了发酵周期，同时降低了糖耗和生产成本，大幅提高了核酸酶P1的生产速率和设备利用率。

Description

一种利用固定化桔青霉发酵制备核酸酶P1的方法

技术领域

本发明属于工业生物技术领域，具体涉及一种利用固定化桔青霉发酵制备核酸酶P1的方法。

背景技术

核酸酶P1是具有重要应用价值的酶制剂，主要催化特性为裂解RNA和DNA中的3’,5’-磷酸二酯键，生成5’-核苷酸以及在低温环境下分解单核苷酸和寡核苷酸中的3’-磷酸单酯键，是核苷酸工业生产中必不可少的原料。核酸酶P1的生产通常采用固体或液体发酵。固体发酵简便、成本低，但占地面积大、生产效率低，而且产生的分生孢子易污染环境。深层发酵避免了上述缺点，但成本较高。

随着固定化技术的快速发展，现该技术已广泛应用于生物发酵领域。近年来，针对桔青霉发酵周期长、酶活低、菌丝体多等问题，核酸酶P1的固定化发酵生产得到了越来越多的关注。将桔青霉菌丝体固定在一些惰性材料上，重复使用，既降低了发酵液粘度，利于氧气及营养物质的传递，提高了细胞利用率和生物反应速率，同时也便于产物的分离提取等后处理加工，从而使生产成本大幅降低。目前应用于桔青霉的固定方法常见的有吸附法和包埋法。王克明等先使用玉米芯颗粒吸附桔青霉孢子，再用质量分数为1.5％的海藻酸钠包埋吸附固定化细胞玉米芯颗粒，于摇瓶中培养50h后，发酵液中核酸酶P1的活力高达503U/mL，并经过了30批次连续重复发酵产酶稳定在较高水平。夏黎明等利用吸附固定在多孔聚酯载体上的桔青霉菌丝于摇瓶中生产核酸酶，酶活可高达513U/mL，其产酶效率是游离菌丝的3.6倍。宋威等采用聚乙烯醇与海藻酸钠比例为2︰1的复合载体固定桔青霉的孢子，连续发酵20个周期后，生产的核酸酶P1活力保持在468～501U/mL。然而，上述的桔青霉的固定化工艺较复杂，载体回收损失较大，使得颗粒重复使用的次数受到很大限制，且不利于发酵后期产物的分离纯化，因而难以在工业规模上生产扩大。因此，为了更进一步提高核酸酶P1的生产效率，简化生产工艺，降低生产成本，实现核酸酶P1的固定化工业生产，仍需要寻找更加廉价、高效、稳定的固定化材料。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种新型的桔青霉固定化载体，并将其应用于固定化桔青霉发酵制备制备核酸酶P1，以解决现有技术中桔青霉的固定化工艺较复杂，载体回收损失较大，使得颗粒重复使用的次数受到限制、分离纯化难的问题。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种利用固定化桔青霉发酵制备核酸酶P1的方法，以经过化学修饰的多孔网状材料作为固定化介质，桔青霉为发酵菌剂，在发酵容器中固定化发酵制备核酸酶P1。

其中，所述的多孔网状材料为聚氨酯泡沫海绵、活性炭过滤棉、生物活性填料、软性纤维填料中任意一种或几种的组合。

作为优选，所述多孔网状材料为聚氨酯泡沫海绵，并且根据聚氨酯的结构特点，本发明对聚氨酯进行羟基化修饰，然后在用聚乙烯亚胺进行氨化，将聚氨酯材料表面的仲胺改性为伯胺，同时增加了聚氨酯材料与菌体间的固定化臂长，有效提高菌体的吸附能力和固定化细胞的自由度。

其中，所述聚氨酯泡沫海绵的化学修饰方法如下：：

(A1)将所述聚氨酯泡沫海绵投入到环氧氯丙烷的氢氧化钠水溶液中，室温下搅拌处理，然后用去离子水洗涤至中性，得羟基化聚氨酯泡沫海绵；

(A2)将步骤(A1)中的羟基化聚氨酯泡沫海绵用聚乙烯亚胺水溶液浸泡处理，然后用去离子水洗涤至无表面聚乙烯亚胺残留，得具有伯胺嫁接臂的聚氨酯泡沫海绵固定化材料。

优选地，步骤(A1)中，所述氢氧化钠水溶液中，环氧氯丙烷的质量分数为5％～30％，氢氧化钠的质量分数为1％～40％，所述聚氨酯泡沫海绵与环氧氯丙烷的氢氧化钠水溶液的质量体积比为1g:20ml～1g:200ml，搅拌时间为1～20h。

优选地，步骤(A2)中，所述聚乙烯亚胺水溶液中，聚乙烯亚胺的质量分数为5％～20％，所述聚氨酯泡沫海绵与聚乙烯亚胺水溶液的质量体积比为1g:10ml～1g:100ml，浸泡时间为2～10h。

更优选地，步骤(A1)中，所述氢氧化钠水溶液中，环氧氯丙烷的质量分数为10％，氢氧化钠的质量分数为5％，所述聚氨酯泡沫海绵与环氧氯丙烷的氢氧化钠水溶液的质量体积比为1g:100ml，搅拌时间为12h。

更优选地，步骤(A2)中，所述聚乙烯亚胺水溶液中，聚乙烯亚胺的质量分数为12％，并且所述聚氨酯泡沫海绵与聚乙烯亚胺水溶液的质量体积比为1g:75ml，浸泡时间为8h。

作为优选所述多孔网状材料为活性炭过滤棉，并且根据活性炭过滤棉孔径的结构特点，对活性炭过滤棉预处理后进行了氧化修饰，提高活性炭过滤棉的表面粗糙程度，为菌体固定化提供更为稳定的固定化位点。

所述活性炭过滤棉的化学修饰方法如下：

(B1)将活性炭过滤棉投入硝酸水溶液中进行氧化处理，洗涤至中性，得到氧化的活性炭过滤棉固定化材料；

优选地，所述硝酸水溶液中硝酸的质量分数为5％～50％，所述活性炭过滤棉与硝酸水溶液的质量体积比为1g:20ml～1g:200ml，氧化温度为10～25℃，氧化时间为2～20h。

更优选地，硝酸水溶液的质量分数为10％，并且所述活性炭过滤棉与硝酸水溶液的质量体积比为1g:100ml，氧化温度为室温(15～30℃)，氧化时间为12～20h。

所述多孔网状材料为生物活性填料，并且根据生物活性填料(例如聚乙烯材质)的结构特点，用溴代酰溴对其进行表面改性，然后用多元胺进行嫁接，制备出带有端氨基嫁接臂的生物基活性填料固定化载体，有效提高菌体的吸附能力。

所述多孔网状材料为生物活性填料，并进行了化学修饰，所述化学修饰包括以下步骤：

所述生物活性填料的化学修饰方法如下：

(C1)将生物活性填料投入正己烷中，加入吡啶，室温下滴加溴代酰溴，滴加结束后继续反应2～20h，然后依次用乙醇、水洗涤至无溶剂残留，得到改性生物活性填料；

(C2)将步骤(C1)中得到的改性生物活性填料投入到多元胺水溶液中，搅拌交联反应1～12h，然后用水洗涤至无表面多元胺残留，得到带有端氨基嫁接臂的生物活性填料；

其中，所述生物活性填料为聚乙烯；

步骤(C1)中，所述生物活性填料与正己烷的质量体积比为1g:5ml～1g:50ml，溴代酰溴与生物活性填料的质量比为1～20g：100g，吡啶与溴代酰溴的体积比为2:1；

步骤(C2)中，所述多元胺水溶液中多元胺的质量分数为5％～20％，所述改性生物活性填料与多元胺水溶液的质量体积比为1g:10ml～1g:100ml；

所述多元胺为乙二胺、丙二胺、戊二胺、己二胺、三聚氰胺中的一种或几种。

更优选地，步骤c1中生物活性填料与正己烷的质量体积比为1g:16ml，溴代酰溴的用量为生物活性填料10％(重量比)，吡啶的用量为溴代酰溴的2倍量。

更优选地，步骤c2中，多元胺水溶液的质量分数为15％，并且所述改性生物活性填料与多元胺水溶液的质量体积比为1g:36ml。

另，根据本申请的优选技术方案，所述多孔网状材料为软性纤维填料，并且根据纤维材料多羟基的结构特点，用溴代酰溴对其进行表面改性，然后引发烯丙基缩水甘油醚聚合，制备出带有环氧基侧链的纤维材料，可有效提高菌体的吸附性能。

因此，优选地，所述多孔网状材料为软性纤维填料，并进行了化学修饰，所述化学修饰包括以下步骤：

所述软性纤维填料的化学修饰方法如下：

(D1)将所述软性纤维填料投入到正己烷中，加入吡啶，室温下滴加适量的溴代酰溴，滴加结束后继续反应1～12h，然后依次用乙醇、水洗涤至无溶剂残留，得到改性软性纤维填料；

(D2)将步骤(D1得到的改性软性纤维填料投入甲醇/水混合溶液中，所述甲醇/水混合溶液中甲醇、水的体积比为1:1～5:1，然后加入溴化亚铜、2,2-二联吡啶和烯丙基缩水甘油醚，反应，洗涤，干燥，得到具有环氧基侧链的纤维材料；

步骤(D1)中，所述软性纤维填料与正己烷的质量体积比为1g:10ml～1g:100ml，所述溴代酰溴的用量与软性纤维填料的质量比为2g～20g：100g，吡啶与溴代酰溴的体积比为2：1；

步骤(D2)中，软性纤维填料与甲醇/水混合溶液的质量体积比为1g:10ml～1g:100ml，所述软性纤维填料、烯丙基缩水甘油醚、溴化亚铜、2,2-二联吡啶质量比为1：10～100：0.001～0.02：0.002～0.04，室温下聚合。

更优选地，步骤d1中软性纤维填料与正己烷的质量体积比为1g:40ml，溴代酰溴的用量为软性纤维填料的10％，吡啶的用量为溴代酰溴的2倍量。

更优选地，步骤d2中软性纤维填料与甲醇/水混合溶液的质量体积比为1g:40ml，软性纤维填料/烯丙基缩水甘油醚/溴化亚铜/2,2-二联吡啶质量比为1g：10g：0.02g：0.04g，室温下聚合。

作为优选，所述发酵容器为高通量摇床、机械搅拌罐或升式发酵罐。

当所述酵容器为高通量摇床时，将多孔网状材料作为固定化载体填充于高通量摇床的反应器中，进行固定化发酵；

当发酵容器为机械搅拌罐时，将多孔网状材料填充于发酵罐中，用不锈钢丝网将搅拌轴和搅拌桨罩起来，使之与多孔网状载体材料隔离开来；

当发酵容器为气升式发酵罐时，将多孔网状材料填充于发酵罐中，将多孔网状材料用不锈钢丝网限定在导流筒内部。

所述多孔网状材料的形状为边长边0.5～2cm的正方形。

所述桔青霉为桔青霉YL104

有益效果：

相对于现有技术，本发明取得了如下的有益效果：

1、本发明所采用的多孔网状材料为化学惰性，不会被细胞代谢分解，对细胞也没有毒害作用，在反复批次发酵过程中性能稳定；且载体材料填充量较少，并可重复使用，廉价高效。

2、选用的多孔网状材料具有较强的生物亲和性，与菌体细胞吸附能力更强，生物膜的成膜效果更好，不仅提高了发酵过程中基质和氧气向生物膜的传输能力，还促进了酶蛋白从生物膜到发酵液的分泌，提高了酶蛋白的表达水平；

3、采用本发明所述的固定化技术，不仅大幅缩短了发酵周期，降低了糖耗和生产成本，提高了生产强度和设备利用率，而且有效提高了菌体细胞的抗性，延长了菌体细胞的高活性状态，保证了反复批次发酵生产核酸酶P1的稳定性。

附图说明

图1为采用本发明的机械搅拌罐中多孔网状材料的固定方式示意图；

其中，1表示不锈钢丝网；2表示多孔网状载体

图2为采用本发明的气升式发酵罐中多孔网状材料的固定方式示意图；

其中，1表示不锈钢丝网；2表示导流筒；3表示多孔网状载体

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域的技术人员容易理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

以下实施例所使用的生产核酸酶P1的菌株为桔青霉YL104，该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC NO.2014，该菌株的详细信息记载在中国专利CN101067116A中。

实施例1多孔网状载体材料的制备

将所选取的多孔网状材料进行相应的化学修饰，所述化学修饰包括以下步骤：

1、聚氨酯泡沫海绵固定化材料的化学修饰：取聚氨酯泡沫海绵20g，投放到2L环氧氯丙烷的氢氧化钠水溶液中(环氧氯丙烷与氢氧化钠的质量分数分别为10％，5％)，室温下搅拌处理12h，然后用去离子水洗涤至中性，得羟基化聚氨酯泡沫海绵；将得到的羟基化聚氨酯泡沫海绵投入到1.5L质量分数为12％的聚乙烯亚胺水溶液中，搅拌浸泡8h后用去离子水洗至无表面吸附聚乙烯亚胺，得具有伯胺嫁接臂的聚氨酯泡沫海绵固定化材料。

2、活性炭过滤棉的化学修饰：取活性炭过滤棉10g，投入到1L质量分数为10％的硝酸水溶液中，室温搅拌氧化过夜，然后用去离子水洗涤至中性，得到氧化的活性炭过滤棉固定化材料。

3、生物活性填料的化学修饰：取聚乙烯材质的生物活性填料50g，投入到800ml正己烷溶液中，加入10g无水吡啶，室温下滴加5g溴代酰溴，滴加结束后继续反应12h，然后依次用乙醇、去离子水洗涤至无溶剂残留；然后将溴化的生物活性填料投入到1.8L质量分数为15％的乙二胺水溶液中，搅拌交联反应8h后用去离子水洗涤至无表面吸附多元胺残留，得带有端氨基嫁接臂的生物活性填料。

4、软性纤维填料的化学修饰：取软性纤维填料50g，投入到2L正己烷中，加入10g无水吡啶，然后室温下滴加5g溴代酰溴，滴加结束后继续反应12h，然后依次用乙醇、去离子水洗涤至无溶剂残留；然后将经溴化改性的活性纤维填料投入到2L甲醇/水(体积比5：1)混合溶液中，加入1g溴化亚铜与2g 2,2-二联吡啶，然后加入500g烯丙基缩水甘油醚，室温下搅拌反应24h，反应结束后用甲醇冲洗干净，真空干燥后备用。

将经过上述化学修饰的多孔网状材料作为固定化介质，裁剪成边长为1cm的正方体后保存备用。

实施例2高通量摇床中核酸酶P1的固定化发酵生产

按照实施例1中所述的方法对软性纤维填料进行化学修饰，将修饰前后的载体分别以4～6g/L的填充量于高通量摇床中进行桔青霉的固定化发酵。

将桔青霉菌株在28～30℃下于麦芽汁斜面上培养5～7天进行活化，用无菌水充分洗涤桔青霉斜面，得到孢子悬液，转接于装有液体发酵培养基(组分：葡萄糖50g/L，蛋白胨5g/L，磷酸二氢钾0.04g/L，磷酸氢二钾0.04g/L，硫酸镁0.05g/L，氯化钙0.05g/L，硫酸锌0.05g/L，pH5-7)和固定化载体的高通量摇床的反应器中，于28～30℃、200rpm、0.05～0.5m³/h通气量下进行桔青霉的反复批次发酵培养，每批发酵结束后，将发酵液全部移出，测定发酵液中核酸酶P1的酶活，并补入相同体积的新鲜培养基进行下一批发酵。在高通量摇床中分别进行桔青霉的游离发酵和载体修饰前后的固定化发酵的产酶水平对比试验，发酵周期为48h，发酵30批次，载体修饰后的固定化发酵的核酸酶P1平均酶活533～565U/mL，分别比载体修饰前的固定化发酵和游离发酵提高13.6％和39％。

实施例3机械搅拌罐中核酸酶P1的固定化发酵生产

按照实施例1中所述的方法对生物活性填料进行化学修饰，以6～10g/L的填充量填充于NBS罐中，进行桔青霉的固定化发酵试验，固定方式如图1所示。

桔青霉种子制备过程及发酵培养基与高通量摇床发酵试验相同。在NBS罐发酵过程中的转速为200rpm，通气量0.2～1.0m³/h，pH5-7，培养温度28～32℃，装液量为50％。监测发酵液的残糖和酶活，当发酵液中核酸酶P1酶活不再增长或下降时，将发酵液全部移出，并补入相同体积的新鲜培养基进行下一批发酵；连续发酵28周期后，核酸酶P1产量稳定在586～595U/mL，平均反应时间相比游离发酵缩短22h，酶活提高31％。

实施例4气升式发酵罐中核酸酶P1的固定化发酵生产

按照实施例1中所述的方法将活性炭过滤棉载体进行化学修饰，以2～5g/L的填充量填充于气升式发酵罐中进行核酸酶P1的间歇式分批发酵生产，载体固定方式如图2。

将桔青霉菌进行斜面培养，斜面孢子用无菌水洗下，在无菌状态下接入内循环气升式发酵罐中进行培养，培养基为葡萄糖50g/L，蛋白胨5g/L，磷酸二氢钾0.04g/L，磷酸氢二钾0.04g/L，硫酸镁0.05g/L，氯化钙0.05g/L，硫酸锌0.05g/L，pH5-7，培养温度28～30℃，罐压0.05～0.15MPa，通气量1.0～2.0m³/h，装液量70％～80％；监测发酵液的酶活，当发酵液中核酸酶P1酶活不再增长或下降时，将发酵液全部移出，补入新鲜培养基进行下一批发酵，发酵进行42天，平均产率为12U·ml^-1h^-1，比游离发酵提高了73％；并用此法节约了能耗，提高了设备利用率。

Claims (10)

1.利用固定化桔青霉发酵制备核酸酶P1的方法，其特征在于，以经过化学修饰的多孔网状材料为固定化介质，桔青霉为发酵菌剂，在发酵容器中固定化发酵制备核酸酶P1。

2.根据权利要求1所述的利用固定化桔青霉发酵制备核酸酶P1的方法，其特征在于，所述的多孔网状材料为聚氨酯泡沫海绵、活性炭过滤棉、生物活性填料和软性纤维填料中的任意一种或几种的组合。

3.根据权利要求2所述的利用固定化桔青霉发酵制备核酸酶P1的方法，其特征在于，所述聚氨酯泡沫海绵的化学修饰方法如下：

(A1)将聚氨酯泡沫海绵投入环氧氯丙烷的氢氧化钠水溶液中，搅拌，反应，洗涤至中性，得到羟基化聚氨酯泡沫海绵；

(A2)将步骤(A1)得到的羟基化聚氨酯泡沫海绵用聚乙烯亚胺水溶液浸泡处理，洗涤至无聚乙烯亚胺残留，得到具有伯胺嫁接臂的聚氨酯泡沫海绵固定化材料；

步骤(A1)中，所述氢氧化钠水溶液中，环氧氯丙烷的质量分数为5％～30％，氢氧化钠的质量分数为1％～40％，所述聚氨酯泡沫海绵与环氧氯丙烷的氢氧化钠水溶液的质量体积比为1g:20ml～1g:200ml，搅拌时间为1～20h；

步骤(A2)中，所述聚乙烯亚胺水溶液中，聚乙烯亚胺的质量分数为5％～20％，所述聚氨酯泡沫海绵与聚乙烯亚胺水溶液的质量体积比为1g:10ml～1g:100ml，浸泡时间为2～10h。

4.根据权利要求2所述的利用固定化桔青霉发酵制备核酸酶P1的方法，其特征在于，所述活性炭过滤棉的化学修饰方法如下：

(B1)将活性炭过滤棉投入硝酸水溶液中进行氧化处理，洗涤至中性，得到氧化的活性炭过滤棉固定化材料；

其中，所述硝酸水溶液中硝酸的质量分数为5％～50％，所述活性炭过滤棉与硝酸水溶液的质量体积比为1g:20ml～1g:200ml，氧化温度为10～25℃，氧化时间为2～20h。

5.根据权利要求2所述的用固定化桔青霉发酵制备核酸酶P1的方法，其特征在于，所述生物活性填料的化学修饰方法如下：

(C1)将生物活性填料投入正己烷中，加入吡啶，室温下滴加溴代酰溴，滴加结束后继续反应2～20h，然后依次用乙醇、水洗涤至无溶剂残留，得到改性生物活性填料；

(C2)将步骤(C1)中得到的改性生物活性填料投入到多元胺水溶液中，搅拌交联反应1～12h，然后用水洗涤至无表面多元胺残留，得到带有端氨基嫁接臂的生物活性填料；

其中，所述生物活性填料为聚乙烯；

步骤(C1)中，所述生物活性填料与正己烷的质量体积比为1g:5ml～1g:50ml，溴代酰溴与生物活性填料的质量比为1～20g：100g，吡啶与溴代酰溴的体积比为2:1；

步骤(C2)中，所述多元胺水溶液中多元胺的质量分数为5％～20％，所述改性生物活性填料与多元胺水溶液的质量体积比为1g:10ml～1g:100ml；

所述多元胺为乙二胺、丙二胺、戊二胺、己二胺、三聚氰胺中的一种或几种的混合物。

6.根据权利要求2所述的用固定化桔青霉发酵制备核酸酶P1的方法，其特征在于，所述软性纤维填料的化学修饰方法如下：

(D1)将所述软性纤维填料投入到正己烷中，加入吡啶，室温下滴加适量的溴代酰溴，滴加结束后继续反应1～12h，然后依次用乙醇、水洗涤至无溶剂残留，得到改性软性纤维填料；

(D2)将步骤(D1得到的改性软性纤维填料投入甲醇/水混合溶液中，所述甲醇/水混合溶液中甲醇、水的体积比为1:1～5:1，然后加入溴化亚铜、2,2-二联吡啶和烯丙基缩水甘油醚，反应，洗涤，干燥，得到具有环氧基侧链的纤维材料；

步骤(D1)中，所述软性纤维填料与正己烷的质量体积比为1g:10ml～1g:100ml，所述溴代酰溴的用量与软性纤维填料的质量比为2g～20g：100g；吡啶与溴代酰溴的体积比为2：1；

步骤(D2)中，软性纤维填料与甲醇/水混合溶液的质量体积比为1g:10ml～1g:100ml，所述软性纤维填料、烯丙基缩水甘油醚、溴化亚铜、2,2-二联吡啶质量比为1：10～100：0.001～0.02：0.002～0.04，室温下聚合。

7.根据权利要求1所述的利用固定化桔青霉发酵制备核酸酶P1的方法，其特征在于，所述发酵容器为高通量摇床、机械搅拌罐或升式发酵罐。

8.根据权利要求7所述的利用固定化桔青霉发酵制备核酸酶P1的方法，其特征在于，当所述酵容器为高通量摇床时，将多孔网状材料作为固定化载体填充于高通量摇床的反应器中，进行固定化发酵；

当发酵容器为机械搅拌罐时，将多孔网状材料填充于发酵罐中，用不锈钢丝网将搅拌轴和搅拌桨罩起来，使之与多孔网状载体材料隔离开来；

当发酵容器为气升式发酵罐时，将多孔网状材料填充于发酵罐中，将多孔网状材料用不锈钢丝网限定在导流筒内部。

9.根据权利要求8所述的利用固定化桔青霉发酵制备核酸酶P1的方法，其特征在于，所述多孔网状材料的形状为边长边0.5～2cm的正方形。

10.根据权利要求1所述的利用固定化桔青霉发酵制备核酸酶P1的方法，其特征在于，所述桔青霉为桔青霉YL104。