CN104531506B - 适用于需氧发酵的纤维床反应器及其生产l‑鸟氨酸方法 - Google Patents

适用于需氧发酵的纤维床反应器及其生产l‑鸟氨酸方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种适用于需氧发酵的纤维床反应器及其生产L‑鸟氨酸方法，属于发酵工程与过程工程技术领域。该方法首先将谷氨酸棒杆菌1006放入装有种子培养基的第一搅拌反应器中，通过与固定化装置进行物料循环交换，从而使得菌体固定于固定化装置中，之后将装有发酵培养基的第一搅拌反应器与固定化装置进行物料循环交换，通过固定化装置中的菌体进行发酵，完毕后将装有发酵培养基的第二搅拌反应器与固定化装置进行物料循环交换，通过固定化装置中的菌体进行发酵，即为生成L‑鸟氨酸的方法。该方法减少了等待期间保藏固定化装置的成本，减少了生产过程水、电、气的使用量，减少了单位时间的生产成本。

Description

适用于需氧发酵的纤维床反应器及其生产L-鸟氨酸方法
技术领域
本发明属于发酵工程与过程工程技术领域，具体涉及一种发酵生产L-鸟氨酸的纤维床反应器及其方法。
背景技术
纤维床生物反应器(FBB)是由美国俄亥俄州立大学的杨尚天教授等人在改进传统的填充床反应器(packed bed reactor，PBR)性能的基础上设计出的一种简单、高效的生物反应器。主要实施方式是将一种改性后的纤维绕成轴状固定于固定化细胞装置中作为固定细胞的载体，通过恒流泵实现固定化细胞装置与罐中的物质交换，同时利用固定化细胞装置中的细胞能多次使用的特性，可以进行多批次半连续发酵，该反应器成功用于丙酸的多批次生产。
与传统固定化细胞相比，FBB细胞固定化过程温和，制备方法简单，而且FBB固定化细胞可以不断更新，死细胞会随着培养基的流动而自动脱落，附着空间被新生细胞替代，固定化载体上可以一直保持较高的活细胞比例；同时，由于采用了高孔隙率和高比表面积的纤维材料作为固定化载体，FBB具有更高的传质效率。
徐虹等利用这种纤维床反应器实现了多种有机酸的生产；同时对此装置进行改进，使用萃取分离装置进行耦合，实现了丙酸多批次生产和在线分离，极大的提高了发酵法生产丙酸的的产率。此外，固定化细胞的可重复利用的特点使得固定化纤维床反应器可以在单批次发酵的基础上，循环操作，实现多批次发酵生产。但是，在应对工业生产中的实际问题比如染菌等，这种装置的在实际生产中应变性较差，很难实现真正的连续发酵，同时现有的纤维床生物反应器主要用于有机酸的发酵，属于厌氧发酵，对需氧发酵过程应用很少。
发明内容
本发明的目的是针对上述技术问题提供一种适用于需氧发酵的纤维床反应器及其生产L-鸟氨酸方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种适用于需氧发酵的纤维床反应器，该反应器包括第一搅拌反应器、第二搅拌反应器、固定化装置、第一补料罐和第二补料罐；
所述固定化装置的上部分别与第一搅拌反应器上部和第二搅拌反应器上部相连，所述固定化装置的下部分别通过恒流泵与第一搅拌反应器下部和第二搅拌反应器下部相连，从而固定化装置分别与第一搅拌反应器和第二搅拌反应器形成各自的循环回路；
所述的第一补料罐通过恒流泵分别与第一搅拌反应器和第二搅拌反应器相连，所述的第二补料罐通过恒流泵也分别与第一搅拌反应器和第二搅拌反应器相连；
所述的第一搅拌装置的下部、第二搅拌装置的下部和固定化装置的下部均设有与其匹配的通气装置。
所述的适用于需氧发酵的纤维床反应器中固定化装置为含有固定化材料的固定化柱，所述的固定化材料由支撑挡板分割成多层固定于固定化柱中；所述的固定化材料为植物纤维、动物纤维、金属纤维和合成纤维中的任意一种。
上述第一补料罐用于补充发酵培养基；第二补料罐用于补充葡萄糖。
一种利用上述装置进行细菌需氧发酵生产的方法，该方法包括以下步骤：
(1)将生产所用菌接入装有种子培养基的第一搅拌反应器中，开启恒流泵和/或通过通气装置进气口产生的负压使得第一搅拌反应器与固定化装置进行物料循环交换，物料循环交换的时间为10～15h，从而使得菌体固定于固定化装置中，菌体固定后放出第一搅拌装置中的种子培养基；
(2)将第一补料罐中的发酵培养基补充到第一搅拌反应器中，开启恒流泵和/或通过通气装置进气口产生的负压使得第一搅拌反应器的发酵培养基与固定化装置进行物料循环交换，通过固定化装置中的菌体进行发酵30～50h，发酵完毕后关闭第一搅拌反应器与固定化装置循环回路，放出第一搅拌反应器中的发酵液；
(3)将第一补料罐中的发酵培养基装入第二搅拌反应器中，开启恒流泵和/或通过通气装置进气口产生的负压使得第二搅拌反应器的发酵培养基与固定化装置进行物料循环交换，通过固定化装置中的菌体进行发酵30～50h，发酵完毕后关闭第二搅拌反应器与固定化装置循环回路，放出第二搅拌反应器中的发酵液；
(4)依次重复步骤(2)和步骤(3)的操作步骤，即为生成L-鸟氨酸的方法。
本发明技术方案中，种子培养基的成分为：葡萄糖为20～30g/L，玉米浆为5～15g/L，酵母膏为5～15g/L，(NH4)2SO4为10～20g/L，MgSO4·7H2O为1～5g/L，KH2PO4为1～5g/L，K2HPO4·3H2O为0.1～1g/L，NaHPO4·2H2O为0.1～1g/L，CaCO3为5～15g/L，该种子培养基的pH 6～8。
本发明技术方案中，葡萄糖为85～95g/L，玉米浆为20～30g/L，(NH4)2SO4为30～40g/L，MgSO4·7H2O为1～5g/L，KH2PO4为0.5～1.5g/L，K2HPO4·3H2O为0.1～1g/L，NaHPO4·2H2O为0.1～1g/L，CaCO3为5～15g/L，FeSO4·7H2O为15～25mg/L，MnSO4·H2O为15～25mg/L，Biotin为0.01～0.1mg/L，该发酵培养基的pH 6～8。
本发明技术方案步骤(1)中：第一搅拌反应器搅拌的速度为350～500r/min；物料循环交换的循环速度为30～80ml/min；固定化装置中固定化柱的温度为28～32℃，pH值为6～8。优选步骤(1)中，第一搅拌反应器搅拌的速度为350～400r/min；物料循环交换的循环速度为50～60ml/min。
本发明技术方案步骤(2)中：第一搅拌反应器搅拌的速度为350～500r/min；物料循环交换的循环速度为50～100ml/min；发酵的条件是温度为28～32℃，pH值为6～8。
优选步骤(2)中，第一搅拌反应器搅拌的速度为350～400r/min；物料循环交换的循环速度为50～60ml/min。
本发明技术方案步骤(3)中：第二搅拌反应器搅拌的速度为350～500r/min；物料循环交换的循环速度为50～100ml/min；发酵的条件是温度为28～32℃，pH值为6～8。
优选步骤(3)中，第一搅拌反应器搅拌的速度为350～400r/min；物料循环交换的循环速度为50～60ml/min。
本发明技术方案在步骤(2)和步骤(3)的发酵过程中，当发酵液中糖的浓度低于15g/L时，通过第二补料罐向第一搅拌反应器或第二搅拌反应器中补充葡萄糖。
本发明技术方案与第一搅拌反应器、第二搅拌反应器和固定化装置匹配通气装置的通气比为1：0.5～1.5。
本发明所述的Corynebacterium glitamicm1006于2010.3.12日保藏于CGMCC，菌种保藏号为：NO.3663。
本发明的有益效果：
1.生产效率高：固定化反应器应用于L-鸟氨酸的生产，L-鸟氨酸的生产效率可达1.2g/L/h，且生产时间缩短5～10个小时，这对发酵生产效率是非常有利的，利用两个反应器轮流与固定化装置进行反应，减少了反应等待期，消除了等待期菌体活力的损耗，同时减少了等待期间保藏固定化柱的成本。
2.传质效率高：纤维床固定化细胞反应器克服了传统细胞固定方法传质效率低的缺点，将氧气通入固定化柱中，使固定化柱中氧的传递效率高于传统搅拌式反应器。
3.细胞的高效吸附与不断的更新：纤维床反应器中的纤维材料利用自身的网状结构能够保证大量菌体的高效吸附，同时，与传统固定化方法不同，只有具有高效活力的菌体才能结合与纤维床上，处于衰退期的菌体活力较差时细胞会自动脱落，保证了纤维床细胞的活力，可以实现连续多批次固定化发酵生产。
附图说明
图1为发酵生产L-鸟氨酸纤维床反应器结构示意图。
其中，1为第一搅拌反应器，2为第二搅拌反应器，3为固定化装置，4为第一补料罐，5为第二补料罐，6为恒流泵，7为通气装置。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步说明，然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的反应器的工作方式，工艺条件和结果仅用于说明本发明，不应当也不会限制本发明。
一种适用于需氧发酵的纤维床反应器，该反应器包括第一搅拌反应器(1)、第二搅拌反应器(2)、固定化装置(3)、第一补料罐(4)和第二补料罐(5)；
所述固定化装置(3)的上部分别与第一搅拌反应器(1)上部和第二搅拌反应器(2)上部相连，所述固定化装置(3)的下部分别通过恒流泵与第一搅拌反应器(1)下部和第二搅拌反应器(2)下部相连，从而固定化装置(3)分别与第一搅拌反应器(1)和第二搅拌反应器(2)形成各自的循环回路；
所述的第一补料罐(4)通过恒流泵分别与第一搅拌反应器(1)和第二搅拌反应器(2)相连，所述的第二补料罐(5)通过恒流泵也分别与第一搅拌反应器(1)和第二搅拌反应器(2)相连；
所述的第一搅拌装置的下部(1)、第二搅拌装置的下部(2)和固定化装置的下部(3)均设有与其匹配的通气装置(6)。
所述的固定化装置(3)为含有固定化材料的固定化柱，所述的固定化材料由支撑挡板分割成多层固定于固定化柱中；所述的固定化材料为植物纤维、动物纤维、金属纤维和合成纤维中的任意一种。
上述第一补料罐用于补充发酵培养基；第二补料罐用于补充葡萄糖。
与第一搅拌反应器、第二搅拌反应器和固定化装置匹配通气装置的通气比为1：0.5～1.5。
在实施方案中所述的种子培养基为：葡萄糖为25g/L，玉米浆为10g/L，酵母膏为10g/L，(NH4)2SO4为15g/L，MgSO4·7H2O为2.5g/L，KH2PO4为1g/L，K2HPO4·3H2O为0.5g/L，NaHPO4·2H2O为0.5g/L，CaCO3为10g/L，该种子培养基的pH 7.6。
在实施方案中所述的发酵培养基为：葡萄糖为89g/L，玉米浆为26.2g/L，(NH4)2SO4为34.20g/L，MgSO4·7H2O为2.8g/L，KH2PO4为1g/L，K2HPO4·3H2O为0.5g/L，NaHPO4·2H2O为0.5g/L，CaCO3为10g/L，FeSO4·7H2O为18.30mg/L，MnSO4·H2O为22.38mg/L，Biotin 0.05mg/L，pH 7.6。
实施例1
5L搅拌式反应器以葡萄糖为碳源纤维床固定化细胞发酵生产L-鸟氨酸。
以网状植物纤维纱布为固定化材料，将新鲜Corynebacterium glitamicum1006接种于装有2L种子培养基的5L的第一搅拌反应器中，开启恒流泵使得第一搅拌反应器与固定化装置进行物料循环交换，从而使菌体固定于固定化柱上，其中，培养条件：温度30℃，搅拌速度为400r/min，物料循环交换的速度为50ml/min，通过pH控制装置控制pH在7～8之间，搅拌式反应器通气比1：0.5～1.5，固定化柱的通气比1：0.5～1.5，培养20h后；放出第一搅拌反应器中的种子培养基；
通过第一补料罐向第一搅拌反应器中补加3L发酵培养基，之后开启第一搅拌反应器与固定化装置间的循环，利用固定化装置上的菌体进行发酵，发酵条件：温度30℃，第一搅拌反应器的搅拌速度400r/min，物料循环交换的速度为60ml/min，所述的第一搅拌反应器的通气比1：0.5～1.5，固定化柱的通气比1：0.5～1.5，通过pH控制装置控制pH在6～8之间，当发酵液中葡萄糖浓度低于10g/L时，通过第二补料罐向第一搅拌反应器中补充葡萄糖，维持葡萄糖浓度在10～15g/L，发酵38～45h，关闭第一搅拌反应器与固定化装置的循环并放出第一搅拌反应器中的发酵液；
同时通过第一补料罐向第二搅拌反应器中加入3L发酵培养基，开启第二搅拌反应器与固定化装置间的循环，利用固定化装置上的菌体进行发酵，发酵条件：固定化装置的温度30℃，发酵培养基的pH 7.6，第一搅拌反应器的400r/min，物料循环交换的速度为60ml/min，所述的第二搅拌反应器通气比1：0.5～1.5，固定化柱的通气比1：0.5～1.5，当发酵液中葡萄糖浓度低于10g/L时，通过第二补料罐向第二搅拌反应器中补充葡萄糖，维持葡萄糖浓度在10～15g/L，发酵38～45h，关闭第二搅拌反应器与固定化装置的循环并放出第二搅拌反应器中的发酵液；
如此，生产两批产量稳定后，继续进行10批连续发酵，L-鸟氨酸的平均产量可达45g/L，产率为1.125g/L/h。
实施例2
5L搅拌式反应器以葡萄糖为碳源以气升式循环纤维床固定化细胞发酵生产L-鸟氨酸。
以网状植物纤维纱布为固定化材料，将新鲜Corynebacterium glitamicm1006接于预装有2L种子培养基的5L的第一搅拌式反应器中，通过与第一搅拌反应器匹配的通气装置进气口产生的负压，使液体在第一搅拌式反应器与固定化装置之间进行物料循环交换，从而使菌体固定于固定化柱上，其中，固定化装置的温度为30℃，第一搅拌反应器搅拌的速度为350r/min，物料循环交换的速度为60ml/min，反应器通气比1：0.5～1.5，固定化柱的通气比1：0.5～1.5，通过pH控制装置控制pH在6～8之间，物料循环交换16～24h后放出第一搅拌式反应器中的种子培养基；
通过第一补料罐向第一搅拌反应其中补充发酵培养基，之后利用固定化装置上的菌体进行发酵，发酵条件：固定化装置的温度为温度30℃，第一搅拌反应器搅拌的速度为400r/min，物料循环交换的速度为60ml/min，反应器通气比1：0.5～1.5，固定化柱的通气比1：0.5～1.5，通过pH控制装置控制pH在6～8之间，当发酵液中葡萄糖浓度低于10g/L时，通过第二补料罐补充葡萄糖，维持葡萄糖浓度在10～15g/L，发酵38～45h，关闭第一搅拌反应器与固定化装置的循环并放出第一搅拌反应器中的发酵液；
同时通过第一补料罐向第二搅拌反应器中放入发酵培养基，开启第二搅拌反应器与固定化装置间的循环，利用固定化装置上的菌体进行发酵，发酵条件：固定化装置的温度30℃，第一搅拌反应器的400r/min，物料循环交换的速度为60ml/min，所述的第二搅拌反应器通气比1：0.5～1.5，固定化柱的通气比1：0.5～1.5，pH控制在6～8，当发酵液中葡萄糖浓度低于10g/L时，通过第二补料罐向第二搅拌反应器中补充葡萄糖，维持葡萄糖浓度在10～15g/L发酵40～45h，关闭第二搅拌反应器与固定化装置的循环并放出第二搅拌反应器中的发酵液；
如此，生产两批产量稳定后继续进行10批连续发酵，L-鸟氨酸的平均产量可达40g/L，产率为0.89g/L/h。
实施例3
5L搅拌式反应器以葡萄糖为碳源游离细胞批次发酵L-鸟氨酸(不接外置固定化装置)；
将新鲜Corynebacterium glutamicum1006接于预装有100ml种子培养基的500ml三角瓶中，30℃，220r/min的摇床条件下培养11h，将种子液按3.3％(v/v)的种子量接种于预装有3L灭菌后的发酵培养基的5L发酵罐中进行培养，培养条件：30℃，400r/min，通过pH控制装置控制pH在6～8之间，通气比1:0.5～1.5。当发酵液中残糖在10g/L左右，进行补料发酵，发酵50小时，L-鸟氨酸的浓度为34.05g/L。
表1.不同的生产方式对L-鸟氨酸生产的影响

Claims (5)

1.一种生成L-鸟氨酸的方法，其特征在于：
生产L-鸟氨酸所采用的装置包括第一搅拌反应器（1）、第二搅拌反应器（2）、固定化装置（3）、第一补料罐（4）和第二补料罐（5）；
所述固定化装置（3）的上部分别与第一搅拌反应器（1）上部和第二搅拌反应器（2）上部相连，所述固定化装置（3）的下部分别通过恒流泵与第一搅拌反应器（1）下部和第二搅拌反应器（2）下部相连，从而固定化装置（3）分别与第一搅拌反应器（1）和第二搅拌反应器（2）形成各自的循环回路；
所述的第一补料罐（4）通过恒流泵分别与第一搅拌反应器（1）和第二搅拌反应器（2）相连，所述的第二补料罐（5）也通过恒流泵分别与第一搅拌反应器（1）和第二搅拌反应器（2）相连；
所述的第一搅拌反应器（1）的下部、第二搅拌反应器（2）的下部和固定化装置的下部（3）均设有与其匹配的通气装置（6）；
利用上述装置生产L-鸟氨酸的方法如下：
1）将谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)1006，保藏号：CGMCC No.3663；接于装有种子培养基的第一搅拌反应器中，开启恒流泵和/或通过通气装置进气口产生的负压使得第一搅拌反应器与固定化装置进行物料循环交换，物料循环交换的时间为16~24h，从而使得菌体固定于固定化装置中，菌体固定后放出第一搅拌反应器中的种子培养基；
2）将第一补料罐中的发酵培养基补充到第一搅拌反应器中，开启恒流泵和/或通过通气装置进气口产生的负压使得第一搅拌反应器的发酵培养基与固定化装置进行物料循环交换，通过固定化装置中的菌体进行发酵30~50 h，发酵完毕后关闭第一搅拌反应器与固定化装置之间的循环回路，放出第一搅拌反应器中的发酵液；
3）将第一补料罐中的发酵培养基装入第二搅拌反应器中，开启恒流泵和/或通过通气装置进气口产生的负压使得第二搅拌反应器的发酵培养基与固定化装置进行物料循环交换，通过固定化装置中的菌体进行发酵30~50 h，发酵完毕后关闭第二搅拌反应器与固定化装置循环回路，放出第二搅拌反应器中的发酵液；
4）依次重复步骤（2）和步骤（3）的操作步骤，即为生成L-鸟氨酸的方法；
其中：步骤1）中：第一搅拌反应器搅拌的速度为350~500 r/min；物料循环交换的循环速度为30~80 ml/min；固定化装置中固定化柱的温度为28~32℃，pH值为6~8；
步骤（2）中：第一搅拌反应器搅拌的速度为350~500 r/min；物料循环交换的循环速度为50~100 ml/min；发酵的条件是温度为28~32℃，pH值为6~8；
步骤（3）中：第二搅拌反应器搅拌的速度为350~500 r/min；物料循环交换的循环速度为50~100 ml/min；发酵的条件是温度为28~32℃，pH值为6~8；
且：第一搅拌反应器、第二搅拌反应器和固定化装置匹配通气装置的通气比为1：0.5~1.5。
2.根据权利要求1所述的生成L-鸟氨酸的方法，其特征在于：所述的固定化装置（3）为含有固定化材料的固定化柱，所述的固定化材料由支撑挡板分割成多层固定于固定化柱中；所述的固定化材料为植物纤维、动物纤维、金属纤维和合成纤维中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的生成L-鸟氨酸的方法，其特征在于：种子培养基的成分为：
葡萄糖为20~30 g/L，玉米浆为5~15 g/L，酵母膏为5~15 g/L，（NH4）2SO4为10~20 g/L，MgSO4·7H2O为1~5 g/L，KH2PO4为1~5 g/L，K2HPO4·3H2O为0.1~1 g/L，NaHPO4·2H2O为0.1~1g/L，CaCO3为5~15 g/L，该种子培养基的pH 6~8。
4.根据权利要求1所述的生成L-鸟氨酸的方法，其特征在于：发酵培养基的成分：葡萄糖为85~95 g/L，玉米浆为20~30 g/L，（NH4）2SO4为30~40 g/L，MgSO4·7H2O为1~5 g/L，KH2PO4为0.5~1.5 g/L，K2HPO4·3H2O为0.1~1 g/L，NaHPO4·2H2O为0.1~1 g/L，CaCO3为5~15g/L，FeSO4·7H2O为15~25 mg/L，MnSO4·H2O为15~25 mg/L，Biotin为0.01~0.1 mg/L，该发酵培养基的pH 6~8。
5.根据权利要求1所述的生成L-鸟氨酸的方法，其特征在于：在步骤2）和步骤3）的发酵过程中，当发酵液中葡萄糖的浓度低于10 g/L时，通过第二补料罐向第一搅拌反应器或第二搅拌反应器中补充葡萄糖。
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Application publication date: 20150422

Assignee: Nanjing Siddartha medical science and Technology Co Ltd

Assignor: Nanjing University of Technology

Contract record no.: 2017320000159

Denomination of invention: Fiber bed reactor suitable for aerobic fermentation and method for producing L-ornithine by adopting fiber bed reactor

Granted publication date: 20170412

License type: Exclusive License

Record date: 20170711