CN102559783B - 利用多联纤维床生物反应器系统发酵生产丁酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多联纤维床生物反应器系统发酵生产丁酸的方法，其步骤包括：制备多联纤维床生物反应器、菌种活化、种子液培养、预发酵培养、及进行批次或补料发酵。本发明工艺简单，利用多联纤维床生物反应器系统发酵生产丁酸，一方面，可以较低的成本实现大规模工业放大，另一方面，可以避免单纯反应器体积放大所产生的多相传质问题和纤维床填充物强度不足问题，同时还减短了发酵过程的延滞期、大幅缩短了生产周期、提高了终产物浓度，有利于发酵液的后续分离，并便于发酵过程的检测和控制，以及设备的维护。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及使用以多联纤维床生物反应器系统发酵生产丁酸的方法。
背景技术
丁酸是一种多用途的精细化学品，广泛应用于食品、化学和医药等行业。在食品工业中配制糖果、饮料调味剂，在香料工业中用于配制果子香精；丁酸纤维素在防老化、耐水性、收缩性等方面均优于醋酸纤维素；醋酸丁酸纤维素酯能溶于许多溶剂中，与树脂、塑料互混能力比单醋酸纤维素酯强，并具有良好的耐热、耐光和抗湿性；还能用于医药中间体的制备，如γ-氨基丁酸的抗缺氧能力显著，(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯是用于合成多种血管紧张素转化酶抑制剂的重要中间体，用于治疗高血压和充血性心力衰竭等心血管疾病；此外，丁酸钠盐还可作为替代抗生素的饲料添加剂饲喂家禽，以促进生长。
目前，丁酸的工业生产是以化学合成法为主，其中以间歇式丁醛氧化法最为普遍，但其工艺复杂，环境污染严重。随着化石性资源日渐枯竭、传统化工造成环境污染以及人们对生物基化学品需求的快速增加，化学工业呈现出从石油基到生物基的转变趋势。另外，由于丁酸和下游衍生产品相当比例应用于食品、饲料和医药等行业，从生物质出发经过生物合成的丁酸（称为生物丁酸）更受欢迎。
目前，生物法制备丁酸的工作仅限于实验室研究，尚未实现工业化生产。主要问题是生物发酵法生产丁酸存在原料成本高（占产品成本的20-50%）、单位体积产量低（质量浓度小于100 g/L）、副产物乙酸含量高等缺点，使其始终无法替代化学合成法。因此，一方面需要寻找和利用廉价的基质原料，另一方面需要探索高效稳定的发酵生产丁酸工艺。
生物丁酸只能利用酪丁酸梭菌（中文名为酪丁酸梭菌，拉丁文学名为 Clostridium tyrobutyricum）等厌氧微生物经厌氧发酵获得。固定化发酵被证实能有效降低发酵成本并大幅提高厌氧发酵的产物终浓度。美国俄亥俄州立大学的杨尚天教授等人在传统的填充床反应器上（packed bed reactor，PBR）的基础上设计出的一种简单、高效的固定床生物反应器，适用于厌氧性微生物发酵。但是，目前这种反应器的应用仅限于实验室小规模（反应器体积小于1升），并只能单个使用。若单纯体积放大，将无法解决复杂的多相传质问题和填充物强度问题。
发明内容
针对游离发酵中由于产物抑制以及细胞密度小而引起的发酵效率低下、产量和得率低以及常见的固定化发酵反应器难以工业放大等问题，本发明的目的是提供一种生产过程中能够大幅缩短生产周期、提高终产物浓度，有利于发酵液的后续分离，并有效解决生物反应器系统放大问题、适用于工业化生产的利用多联纤维床生物反应器系统发酵生产丁酸的方法。
本发明的利用多联纤维床生物反应器系统发酵生产丁酸的方法，包括以下步骤，
（1）多联纤维床生物反应器的制备：多联纤维床生物反应器由数个纤维床生物反应器相互间通过管道串联或并联连接而成，所说的串联是前一个纤维床生物反应器的物料出口与下个纤维床生物反应器的物料进口依次连接，形成串联式纤维床生物反应器；所说的并联是所有纤维床生物反应器的物料进口并联成一个共同的物料进口，所有纤维床生物反应器的物料出口并联形成一个共同的物料出口，形成并联式纤维床生物反应器。在各个纤维床生物反应器的物料进口和物料出口管道上设置泵和流量计，在每个纤维床生物反应器出口管路设置pH计和温度计，每个纤维床生物反应器为由同心式内、外圆筒构成的带夹层的填充柱体，在填充柱体上、下两端的密封盖上分别设置物料进口和物料出口，填充柱体的夹层通水浴循环水，填充柱体的内圆筒中充满填充物，该填充物以棉纤维织物为填充基质，钢丝网做支撑材料，钢丝网在外侧，棉纤维织物置于内侧，卷制成圆筒状，将预发酵罐的出料口与多联纤维床生物反应器的物料进口相连接，预发酵罐的进料口与多联纤维床生物反应器的物料出口相连构成封闭循环系统；
（2）用接种针蘸取酪丁酸梭菌菌液，在含有50 mg / mL丁酸钠的强化培养基平板上划线后， 置37 ℃培养72 小时；
（3）将步骤2）平板上的单菌落接种于含50 mL生长培养基的100 mL厌氧瓶中培养72 小时，得到发酵母种；
（4）取3 mL发酵母种接种于含100 mL生长培养基的500 mL厌氧瓶中培养48 小时后，接种于含2 L 生长培养基的5 L预发酵罐中进行24 小时的扩大培养，使菌体浓度达到6.0-10.0 g/L，用泵以10-100 mL/min的速度将经扩大培养的培养液泵入步骤（1）制备的多联纤维床生物反应器内，维持循环，当发酵液中糖浓度接近0时，更换新鲜生长培养基进行下一批次发酵，或补入葡萄糖液进行补料发酵，得到丁酸；发酵过程中通过pH计、温度计、流量计检测各个纤维床生物反应器的发酵状态，控制发酵温度为37°С，用6 mol/L的NaOH维持pH在6.0，通过泵来控制发酵液的循环速度；
上述的生长培养基成分为：葡萄糖 30 g/L、酵母抽提物 5 g/L、蛋白胨 5 g/L、（NH4）2SO4 3 g/L 、K2HPO4 1.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.6 g/L、FeSO4·7H2O 0.03 g/L；
上述的强化培养基是在生长培养基的基础上添加50 mg/mL丁酸钠。
通常，对于实验室小试发酵生产丁酸，构成多联纤维床生物反应器的各纤维床的填充柱体体积为100-800mL，填充柱体为玻璃材质。
对于工业化中试发酵生产丁酸，构成多联纤维床生物反应器的各纤维床的填充柱体体积为100-800L，填充柱体为不锈钢材质。
本发明中，所说的钢丝网的孔径一般为30目。
本发明的有益效果在于：
本发明工艺简单，利用多联纤维床生物反应器系统发酵生产丁酸，一方面，可以较低的成本实现大规模工业放大，另一方面，可以避免单纯反应器体积放大所产生的多相传质问题和纤维床填充物强度不足问题，同时还减短了发酵过程的延滞期、大幅缩短了生产周期、提高了终产物浓度，有利于发酵液的后续分离，并便于发酵过程的检测和控制，以及设备的维护。
附图说明
图1是多个纤维床生物反应器串联发酵生产丁酸系统示意图；
图2是多个纤维床生物反应器并联发酵生产丁酸系统示意图；
图1和图2中：1.预发酵罐； 2.纤维床生物反应器； 3.泵； 4.流量计；5.温度计；6.物料进口；7. pH计；8.物料出口；9. 填充物。
具体实施方式
实施例1：
本实例给出的是两个纤维床生物反应器串联系统发酵生产丁酸的工艺，步骤如下：
（1）多联纤维床生物反应器的制备：图1的多联纤维床生物反应器为由两个纤维床生物反应器2串联形成的纤维床生物反应器；在各个纤维床生物反应器的物料进口和物料出口管道上设置泵3和流量计4，在每个纤维床生物反应器出口管路设置pH计7和温度计5。通过流量计、pH计、温度计等检测元件检测各个纤维床生物反应器的发酵状态，通过泵来控制发酵液的循环速度。每个纤维床生物反应器为由同心式内、外圆筒构成的带夹层的填充柱体，此例中各纤维床填充柱体的体积为500mL，填充柱体为玻璃材质。在填充柱体上、下两端的密封盖上分别设置物料进口6和物料出口8，填充柱体的夹层通水浴循环水，填充柱体的内圆筒中充满填充物9，该填充物以棉纤维织物为填充基质，钢丝网做支撑材料，钢丝网在外侧，棉纤维织物置于内侧，卷制成圆筒状，将预发酵罐1的出料口与多联纤维床生物反应器的物料进口相连接，预发酵罐的进料口与多联纤维床生物反应器的物料出口相连构成封闭循环系统；
（2）用接种针蘸取酪丁酸梭菌菌液，在含有50 mg / mL丁酸钠的强化培养基平板上划线后， 置37 ℃培养72 小时；
（3）将步骤2）平板上的单菌落接种于含50 mL生长培养基的100 mL厌氧瓶中培养72 小时，得到发酵母种；
（4）取3 mL发酵母种接种于含100 mL生长培养基的500 mL厌氧瓶中培养48 小时后， 接种于含2 L 生长培养基的5 L预发酵罐中进行24 小时的扩大培养，使菌体浓度达到10.0 g/L，利用泵以80 mL/min的速度将经扩大培养的培养液泵入上述纤维床生物反应器内，维持循环，当发酵液中糖浓度接近0时，更换新鲜生长培养基进行下一批次发酵，得到丁酸；发酵温度设定为37°С，用6 mol/L的NaOH维持pH在6.0；利用批次发酵，发酵液中丁酸终浓度达21.29g/L。 本例，当发酵液中糖浓度接近0时，采用补入葡萄糖液进行补料发酵，发酵液中丁酸终浓度达71.2g/L。发酵时间120小时。（结果见表1）。
实施例2：
本实例给出的是以两个纤维床生物反应器并联系统发酵生产丁酸的工艺，步骤如下：
1)多联纤维床生物反应器的制备同实施例1，区别在于多联纤维床生物反应器为由两个纤维床生物反应器2并联形成的纤维床生物反应器；各纤维床填充柱体的体积为500mL，填充柱体为玻璃材质；
2）同实施例1步骤2）；
3）同实施例1步骤3）；
4）同实施例1步骤4），利用批次发酵，发酵液中丁酸终浓度19.44g/L。
本例，当发酵液中糖浓度接近0时，采用补入葡萄糖液进行补料发酵，发酵液中丁酸终浓度74.72g/L。发酵时间96小时。（结果见表1）。
实施例3：
本实例给出的是以三个纤维床生物反应器并联系统发酵生产丁酸的工艺，步骤如下：
1)多联纤维床生物反应器的制备同实施例1，区别在于多联纤维床生物反应器为由三个纤维床生物反应器2并联形成的纤维床生物反应器；各纤维床填充柱体的体积为500mL，填充柱体为玻璃材质；
2）同实施例1步骤2）；
3）同实施例1步骤3）；
4）同实施例1步骤4），利用批次发酵，发酵液中丁酸终浓度26.09g/L。
本例，当发酵液中糖浓度接近0时，采用补入葡萄糖液进行补料发酵，发酵液中丁酸终浓度约78g/L。发酵时间84小时。（结果见表1）。
实施例4：
本实例给出的是以四个纤维床生物反应器并联系统发酵生产丁酸的工艺，步骤如下：
1)多联纤维床生物反应器的制备同实施例1，区别在于多联纤维床生物反应器为由四个纤维床生物反应器2并联形成的纤维床生物反应器（见图2）；各纤维床填充柱体的体积为500mL，填充柱体为玻璃材质；
2）同实施例1步骤2）；
3）同实施例1步骤3）；
4）同实施例1步骤4），利用批次发酵，发酵液中丁酸终浓度18.28g/L。
本例，当发酵液中糖浓度接近0时，采用补入葡萄糖液进行补料发酵，发酵液中丁酸终浓度86.42g/L。发酵时间80小时。（结果见表1）。
比较例：
本实例给出的是单个纤维床生物反应器发酵生产丁酸的工艺，步骤如下：
1）同实施例1步骤1），区别在于纤维床生物反应器为单个；
2）同实施例1步骤2）；
3）同实施例1步骤3）；
4）同实施例1步骤4），利用批次发酵，发酵液中丁酸终浓度16.5g/L。
本例，当发酵液中糖浓度接近0时，采用补入葡萄糖液进行补料发酵，发酵液中丁酸终浓度达60.94g/L。发酵时间140小时。（结果见表1）。
表1 多联纤维床生物反应器系统发酵生产丁酸结果比较
从表1可见：实施例1相比于比较例单柱补料发酵，丁酸浓度提高约7%，发酵周期缩短18%。实施例2相比于比较例单柱补料发酵，丁酸浓度提高约23%，发酵周期缩短31%。实施例3相比于比较例单柱补料发酵，丁酸浓度提高约30%，发酵周期缩短40%。实施例4相比于比较例单柱补料发酵，丁酸浓度提高约43%，发酵周期缩短43%。
Claims (4)
1.利用多联纤维床生物反应器系统发酵生产丁酸的方法，其特征是包括以下步骤：
（1）多联纤维床生物反应器的制备：多联纤维床生物反应器由数个纤维床生物反应器相互间通过管道串联或并联连接而成，所说的串联是前一个纤维床生物反应器的物料出口与下个纤维床生物反应器的物料进口依次连接，形成串联式纤维床生物反应器；所说的并联是所有纤维床生物反应器的物料进口并联成一个共同的物料进口，所有纤维床生物反应器的物料出口并联形成一个共同的物料出口，形成并联式纤维床生物反应器，在各个纤维床生物反应器的物料进口和物料出口管道上设置泵和流量计，在每个纤维床生物反应器出口管路设置pH计和温度计，每个纤维床生物反应器为由同心式内、外圆筒构成的带夹层的填充柱体，在填充柱体上、下两端的密封盖上分别设置物料进口和物料出口，填充柱体的夹层通水浴循环水，填充柱体的内圆筒中充满填充物，该填充物以棉纤维织物为填充基质，钢丝网做支撑材料，钢丝网在外侧，棉纤维织物置于内侧，卷制成圆筒状，将预发酵罐的出料口与多联纤维床生物反应器的物料进口相连接，预发酵罐的进料口与多联纤维床生物反应器的物料出口相连构成封闭循环系统；
（2）用接种针蘸取酪丁酸梭菌菌液，在含有50 mg / mL丁酸钠的强化培养基平板上划线后， 置37 ℃培养72 小时；
（3）将步骤2）平板上的单菌落接种于含50 mL生长培养基的100 mL厌氧瓶中培养72 小时，得到发酵母种；
（4）取3 mL发酵母种接种于含100 mL生长培养基的500 mL厌氧瓶中培养48 小时后，接种于含2 L 生长培养基的5 L预发酵罐中进行24 小时的扩大培养，使菌体浓度达到6.0-10.0 g/L，用泵以10-100 mL/min的速度将经扩大培养的培养液泵入步骤（1）制备的多联纤维床生物反应器内，维持循环，当发酵液中糖浓度接近0时，更换新鲜生长培养基进行下一批次发酵，或补入葡萄糖液进行补料发酵，得到丁酸；发酵过程中通过pH计、温度计、流量计检测各个纤维床生物反应器的发酵状态，控制发酵温度为37°С，用6 mol/L的NaOH维持pH在6.0，通过泵来控制发酵液的循环速度；
上述的生长培养基成分为：葡萄糖 30 g/L、酵母抽提物 5 g/L、蛋白胨 5 g/L、（NH4）2SO4 3 g/L 、K2HPO4 1.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.6 g/L、FeSO4·7H2O 0.03 g/L；
上述的强化培养基是在生长培养基的基础上添加50 mg/mL丁酸钠。
2.根据权利要求1所述的利用多联纤维床生物反应器系统发酵生产丁酸的方法，其特征是构成多联纤维床生物反应器的各纤维床的填充柱体体积为100-800mL，填充柱体为玻璃材质。
3.根据权利要求1所述的利用多联纤维床生物反应器系统发酵生产丁酸的方法，其特征是构成多联纤维床生物反应器的各纤维床的填充柱体体积为100-800L，填充柱体为不锈钢材质。
4.根据权利要求1所述的利用多联纤维床生物反应器系统发酵生产丁酸的方法，其特征是所说的钢丝网的孔径为30目。
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