CN104946516B - 一种利用木质纤维素连续发酵生产丁醇的装置及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用木质纤维素连续发酵生产丁醇的装置,其中一级发酵罐为搅拌釜式发酵罐;二级发酵罐为长方体管式发酵罐,管式发酵罐内部设置竖直隔板将其分割为若干相同的反应单元,隔板下端与发酵罐底部固定连接,隔板上端留有过水通道,每个反应单元设有倒立的T型挡板,T型挡板与反应单元的前后端固定连接,顶端与发酵罐顶部固定连接。采用上述装置连续发酵生产丁醇的方法,发酵前二级发酵罐为空罐,发酵液利用液位差由一级发酵罐从二级发酵罐的第一个反应单元顶部流入,并逐级溢流到每个反应单元,最终从最后一个反应单元流出。本发明可以实现丁醇的连续化生产,操作过程简单,设备利用率高,可同时获得较高的总溶剂产量和溶剂生产率。
Description
技术领域
本发明属于生物质能源技术领域,涉及一种利用木质纤维素发酵生产丁醇的装置及方法,尤其涉及一种利用木质纤维素类生物质酶解液连续发酵生产生物丁醇的装置及方法。
背景技术
丁醇是一种重要的化工原料,广泛用于各种塑料和橡胶制品的制造和丁醛、丁酸、丁胺和乳酸丁酯等化学品的合成。近年来,随着下游产业的发展,市场需求直线上升,2013年我国丁醇的进口量在40万吨左右;丁醇也是继燃料乙醇后又一种极具潜力的新型生物燃料,其热值、辛烷值与汽油相当,蒸汽压低,与汽油任意比混溶,使用安全性能高,并且不产生SOx及NOx等传统化石燃料所产生的环境污染废弃。另外,丁醇不会腐蚀管道、不易吸水,依靠现有的汽油输送管道及分销渠道便可以实现远程输送,基于以上的优良特性,联合国国际能源署将生物丁醇列为第二代生物燃料。
微生物发酵产丁醇作为一种重要的生物转化技术极具发展和产业化的潜力。传统的发酵法生产丁醇的主要原料为粮食类淀粉质原料,如玉米等,生产成本高。为了降低生产成本,近年来许多企业的研究机构和高校开始研究用各种木质纤维素生物质原料代替粮食类淀粉质原料发酵生产丁醇,但是这些报道大都采用分批发酵的操作方式,丁醇的生产率受到一定程度的限制。
近年来,也有一些关于连续生产丁醇的报道,Richter等(Richter H, et al,BiotechnolBioeng,2011(109):913-921)以Clostridium saccharoperbutylacetonicm N1-4为发酵菌种,以丁酸和葡萄糖为底物,采用耦合气体两级连续发酵的操作方式,在0.025h-1的稀释率下,丁醇生产率为0.39g/(L·h),获得15.7g/L的总溶剂。CN102925495A公开了一种利用糖质原料连续发酵生产丁醇的方法,以丙酮丁醇梭菌(Clostridiumsaccharobutylicum)DSM13864为发酵菌,以葡萄糖、甘蔗糖蜜或玉米秸秆水解液等糖质为原料,采用多个发酵罐串联组合成多级连续发酵装置,连续发酵生产丁醇。采用多级连续发酵可获得高的溶剂浓度和溶剂生产率,减少设备清洗次数和灭菌等非生产占用时间,降低劳动强度,提高设备利用率。采用玉米秸秆水解液原料时,平均总溶剂可达13.44g/L(其中丁醇9.29g/L),总溶剂生产率达到0.439g/(L·h)。连续发酵生产率比分批发酵高,但是总溶剂产量往往较低。此外,连续发酵的装置为立式搅拌釜式发酵罐的串联,每个发酵罐需要设有搅拌装置,并且发酵罐之间通过管道连接,数据检测点较多,操作复杂,不便于自动化集中控制。
徐铁军等(自絮凝酵母SPSC01在组合反应器系统中酒精连续发酵的研究,生物工程学报, 2005, 21(1): 113-117)建立了一套由四级磁力搅拌发酵罐串联组成、总有效容积4000mL的小型组合生物反应器系统,种子培养用培养基用蠕动泵按照设定的稀释速率输送到种子罐中,从种子罐中流出的自絮凝颗粒酵母种子悬浮液直接溢流进入第一级发酵罐,发酵培养基用蠕动泵按照设定的稀释速率全部输送到第一级发酵中,并依次溢流进入第二级和第三级发酵罐。由于发酵状态下各发酵罐产生的热量按第一级、第二级、第三级的顺序依次递减,系统保温水逆向按第三级、第二级、第一级的顺序进入各发酵罐,控制第一级发酵罐的温度为33±0.5℃,第二级发酵罐和第三级发酵罐的温度可以保持在30~32℃,满足自絮凝颗粒酵母酒精发酵的温度要求。其利用发酵罐串联进行连续发酵生产酒精,然而多个发酵罐串联,每个发酵罐也需要单独设搅拌装置,而且发酵罐之间需通过管道连接,也存在数据检测点增多,操作复杂的问题。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明的目的在于提供一种利用木质纤维素连续发酵生产丁醇的装置及方法。本发明可以实现丁醇的连续化生产,操作过程简单,设备利用率高,可以同时获得较高的总溶剂产量和溶剂生产率。
本发明利用木质纤维素连续发酵生产丁醇的装置,包括一级发酵罐和二级发酵罐,一级发酵罐为立式搅拌釜式发酵罐;二级发酵罐为长方体管式发酵罐,管式发酵罐内部设置竖直隔板将其分割为若干相同的反应单元,隔板下端与管式发酵罐底部固定连接,隔板上端留有过水通道,每个反应单元设有倒立的T型挡板,T型挡板与反应单元的前后端固定连接,顶端与发酵罐顶部固定连接;一级发酵罐出口的水平位置高于二级发酵罐入口的水平位置,发酵液利用液位差由一级发酵罐从二级发酵罐的第一个反应单元顶部流入,并逐级溢流到每个反应单元,由最后一个反应单元流出,流出口高度与竖直隔板的高度一致。
本发明中,竖直隔板可以将管式发酵罐分割为2-10个相同的反应单元,隔板的高度为管式发酵罐高度的0.75-0.9倍。每个反应单元顶部设有气体排出口。T型挡板下端宽度为每个反应单元宽度的0.5-0.8倍,T型挡板的高度为管式发酵罐高度的0.25-0.5倍。本发明采用上述返混设施可以将发酵过程产生的气体利用起来,加剧返混,并且不产生发酵液流动死角,不需要设置专门的搅拌器,能耗显著降低。
本发明采用上述装置连续发酵生产丁醇的方法,包括如下步骤:
(1)将木质纤维素原料进行预处理、酶解获得酶解液,以酶解液为碳源制备发酵培养基,控制总糖浓度为60-80g/L;
(2)在一级发酵罐中加入发酵培养基,并接入发酵菌种子液进行培养,当发酵液OD600值达到5-10时,补加新鲜发酵培养基,随着培养基的不断补加,一级发酵罐中的发酵液溢流至二级发酵罐中;
(3)连续发酵前二级发酵罐为空罐,发酵液利用液位差由一级发酵罐从二级发酵罐的第一个反应单元顶部流入,并逐级溢流到每个反应单元,最终发酵液从最后一个反应单元溢流流出。
本发明中,步骤(1)所述木质纤维素包括一切含纤维素的生物质原料,如秸秆、木屑、能源植物(如柳枝稷)和废纸等,优选为玉米秸秆。所述预处理方式可以采用一切可提高木质纤维素酶解性能的物理、化学和热化学技术,优选采用稀酸蒸汽爆破组合预处理。控制酶解体系的干物质浓度(可溶性固体和不可溶性固体质量之和与体系总质量的百分比,下同)为20wt%-30wt%,纤维素酶的加入量使得纤维素酶与预处理原料中纤维素的比例为5-25IU/g纤维素,酶解的pH值为4.5-5.5,温度为45-55℃,酶解时间为48-96h。
本发明中,步骤(1)所述发酵培养基以木质纤维素酶解液为碳源,控制总糖浓度为60-80g/L,加入以下营养元素配成发酵培养基,以g/L计为:酵母 1.0,CH3COONH4 2.2,KH2PO4 0.5,K2HPO4 0.5,MnSO4 0.01,NaCl 0.01,MgSO4·7H2O 0.2,FeSO4 0.01,对氨基苯甲酸 0.001,维生素B1 0.001,生物素0.01×10-3。
本发明中,步骤(2)所述丁醇发酵菌为拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)或者丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum),如可以采用丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) ATCC 824,购于美国模式菌种收集中心;或者采用拜氏梭菌CM20,其分类命名为拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii),已于2014年06月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.9354。两菌种采用RCM培养基制备种子液,具体配方以g/L计为:蛋白胨10,牛肉粉10,酵母粉 3.0,葡萄糖 5,可溶性淀粉1.0,氯化钠5.0,醋酸钠 3.0,L-半胱氨酸盐酸盐 0.5,琼脂 0.5,以纯水配置,115℃,灭菌20min。发酵菌种子液是在种子培养基中接入丁醇发酵菌,厌氧环境下于36-38℃下培养16-20h获得的。
本发明中,步骤(2)按照2%-10%(v/v)的接种量由一级发酵罐顶部接入种子液,发酵温度36-38℃,当菌体的OD600值达到5-10后,以恒流速0.02-0.06V/h补加新鲜发酵培养基到一级发酵罐中,对应稀释率为0.02 h-1-0.04 h-1,稀释率D为新鲜发酵培养基的补加速率F (ml/h)与发酵罐中培养基体积V (ml)的比值,同时一级发酵罐中的发酵液等流速溢流至二级发酵罐中。
本发明中,步骤(3)中一级发酵罐和二级发酵罐在接种前用高压水蒸气灭菌并持续用高纯氮气吹扫以维持厌氧的环境直至菌体发酵产气。通过调节蠕动泵的转速以控制流速从而调整培养基从一级发酵罐顶部补入至二级管式发酵罐溢流出的总时间为菌种发酵产丁醇的时间。当发酵液将管式发酵罐体积填充完全开始溢流后,收集发酵液至收集罐。
本发明为工业化微生物发酵生产生物丁醇提供一种生产成本低、能源消耗少、集中化程度及生产强度高,易于自动化操作的连续发酵生产方法。与现有技术已报道的连续发酵相比较,具有以下优势:
1、利用管式发酵罐取代单独立式发酵罐的串联或并联,减少了罐体连接间的泵和管道,使发酵设备更加简单,易于自动化控制,降低了生产强度,提高了设备的利用率,保证生产率的同时,获得了更高的总溶剂产量,实现了真正意义上的连续发酵。此外,本发明只需一次灭菌和接种,节约了反复洗罐、多次灭菌等步骤,大大缩短了生产周期,更加适合工业化生产;
2、本发明中连续发酵方法以管式发酵罐为基础,利用一级立式搅拌发酵罐和二级管式发酵罐组合发酵,通过不断地补加新鲜培养基,同时等量将发酵后期的发酵液排出,以实现连续发酵得到相应的发酵产物。与其他现有连续发酵工艺相比较,采用管式发酵设备进行连续发酵,代替传统的发酵的串联,发酵设备更加简化,生产操作更为简便,从而提高设备利用率,在提高溶剂生产率的同时,增加了总溶剂产量;
3、将管式发酵罐分成很多个小反应单元,并在每个单元设置倒立的T型挡板,不需要设专门的搅拌设备,降低了处理成本;并且可以将发酵过程产生的气体利用起来,在T型挡板的共同作用下,可以提高发酵液在发酵过程中的湍流程度,有助于提高发酵效果。
附图说明
图1为本发明连续发酵生产丁醇的装置的流程图;
其中,1-7为竖直隔板将二级管式发酵罐分割为7个相同的反应单元;
图2为本发明管式发酵罐中T型挡板的俯视图及侧视轮廓图(虚线为反应单元边界);
图3为本发明管式发酵罐中T型挡板的立体图。
具体实施方式
下面结合附图通过实施例对本发明作进一步说明。以下实施例仅限于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
如图1所示的连续发酵生产丁醇的装置,包括一级发酵罐和二级发酵罐,一级发酵罐为立式搅拌釜式发酵罐,装液量为3L;二级发酵罐为长方体管式发酵罐,总装液量为7L,管式发酵罐内部设置竖直隔板将其分割为7个相同的反应单元,隔板的高度为管式发酵罐高度的0.8倍;隔板下端与管式发酵罐底部固定连接,隔板上端留有过水通道,每个反应单元设有倒立的T型挡板,如图2所示,T型挡板与反应单元的前后端固定连接,顶端与发酵罐顶部固定连接,T型挡板下端宽度为每个反应单元宽度的0.6倍,T型挡板的高度为管式发酵罐高度的0.5倍。一级发酵罐出口的水平位置高于二级发酵罐入口的水平位置,发酵液利用液位差由一级发酵罐从二级发酵罐的第一个反应单元顶部流入,并逐级溢流到每个反应单元,最后一个反应单元的出口高度与竖直隔板的高度一致。每个反应单元顶部设有气体排出口。
木质纤维素原料为玉米干秸秆,其中纤维素38.2 wt%,半纤维素22.1 wt%,木质素20.2 wt%,灰分3.9 wt%,用粉碎机粉碎至颗粒大小为1-5mm。采用稀酸蒸汽爆破进行预处理,反应温度为190℃,反应时间5min,固液比为1:2,稀硫酸浓度为2.0wt%。预处理后原料和pH值为4,浓度为0.1M 的醋酸钠-醋酸缓冲液按固液比10% (w/v)混合,经过脱氧处理后于115℃灭菌20min。待冷却至室温后,加入纤维素酶(15IU/g纤维素),于50℃、110rpm摇床酶解72h。所述纤维素酶为诺维信公司生产的用于转化木质纤维素原料的Biomass Kit,其中包括纤维素酶复合物(NS 50013) 和β-葡萄糖苷酶(NS 50010),酶解pH 值为4.5。
发酵培养基以上述木质纤维素酶解液为碳源,总糖浓度为60-80g/L,加入以下营养元素配成,以g/L计为:酵母 1.0,CH3COONH4 2.2,KH2PO4 0.5,K2HPO4 0.5,MnSO4 0.01,NaCl 0.01,MgSO4·7H2O 0.2,FeSO4 0.01,对氨基苯甲酸 0.001,维生素B1 0.001,生物素0.01×10-3。
实施例1
丁醇发酵菌采用丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) ATCC 824,购于美国模式菌种收集中心。发酵培养基以上述木质纤维素酶解液为碳源,总糖浓度为80g/L,加入以下营养元素,以g/L计为:酵母 1.0,CH3COONH4 2.2,KH2PO4 0.5,K2HPO4 0.5,MnSO40.01,NaCl 0.01,MgSO4·7H2O 0.2,FeSO4 0.01,对氨基苯甲酸 0.001,维生素B1 0.001,生物素0.01×10-3。发酵种子液是在RCM种子培养基中接入丙酮丁醇梭菌 ATCC 824,厌氧环境下于37 ℃培养20h获得的。
采用本发明所述的连续发酵操作方式,在一级发酵罐中加入上述发酵培养基,加入量为发酵罐体积的一半,并接入丁醇发酵菌种子液进行培养,发酵温度控制在37℃,当发酵液OD600值达到5时,恒流速补加新鲜发酵培养基,随着培养基的补加,一级发酵罐中的发酵液溢流至二级发酵罐中;连续发酵前二级发酵罐为空罐,发酵液利用液位差由一级发酵罐从二级发酵罐的第1个反应单元顶部流入,并逐级溢流到每个反应单元,最终发酵液从最后一个反应单元溢流流出。将一级发酵罐的稀释率分别控制在0.02 h-1,0.03h-1、0.04 h-1及0.06 h-1,以二级发酵罐第一次溢流出发酵液为连续发酵的起点,整个过程连续运行840h,其结果如下表1所示。糖含量通过高效液相色谱法分析测定,乙醇、丙酮、丁醇通过气相色谱法分析测定,总溶剂含量为乙醇、丙酮、丁醇三者含量的总和。
表1 实施例1的发酵结果
由表1可知,当一级罐稀释率为0.03 h-1,发酵效果最好。在该稀释率下连续发酵72h后,发酵液中糖含量为零,溶剂产量趋于稳定并达到最高水平,发酵液中平均丁醇产量为11.5g/L,丁醇生产率为0.345g·L-1·h-1,平均总溶剂产量为19.2g/L。
实施例2
处理工艺和操作条件与实施例1相同,不同之处在于采用拜氏梭菌CM20,发酵培养基以上述木质纤维素酶解液为碳源,还原糖浓度为60g/L,加入以下营养元素,以g/L计为:酵母 1.0,CH3COONH4 2.2,KH2PO4 0.5,K2HPO4 0.5,MnSO4 0.01,NaCl 0.01,MgSO4·7H2O0.2,FeSO4 0.01,对氨基苯甲酸 0.001,维生素B1 0.001,生物素0.01×10-3。发酵种子液是在RCM种子培养基中接入拜氏梭菌CM20,厌氧环境下于37 ℃培养20h获得的。将一级发酵罐的稀释率控制在0.03h-1,以二级发酵罐第一次溢流出发酵液为连续发酵的起点,其结果如下表2所示。
表2实施例2的发酵结果
由表2可知,当一级罐稀释率为0.03 h-1,连续发酵72h后,发酵液中糖含量为零,溶剂产量趋于稳定并达到最高水平,发酵液中丁醇平均产量为12.125g/l,丁醇生产率为0.364g·L-1·h-1,总溶剂平均产量为20.229g/L。
比较例1
处理工艺和操作条件与实施例1相同,不同之处在于:二级管式发酵罐未设置T型挡板,设置竖直挡板,按照上述发酵操作方式,在0.03h-1的稀释率下,进行了相应的连续发酵实验。以二级发酵罐第一次溢流出发酵液为连续发酵的起点,其结果如下表3所示。
表3比较例1的发酵结果
由于未设置T型挡板,发酵液在管式发酵罐内无法形成有效的湍流,混合不均匀,导致菌种无法充分消耗糖进行发酵。实验数据显示,丁醇的平均产量5.941g/L,溶剂平均总产量9.867g/L,发酵效果不佳。
Claims (11)
1.一种利用木质纤维素连续发酵生产丁醇的装置,其特征在于:包括一级发酵罐和二级发酵罐,一级发酵罐为立式搅拌釜式发酵罐;二级发酵罐为长方体管式发酵罐,管式发酵罐内部设置竖直隔板将其分割为若干相同的反应单元,隔板下端与管式发酵罐底部固定连接,隔板上端留有过水通道,每个反应单元设有倒立的T型挡板,T型挡板与反应单元的前后端固定连接,顶端与发酵罐顶部固定连接;一级发酵罐出口的水平位置高于二级发酵罐入口的水平位置,发酵液利用液位差由一级发酵罐从二级发酵罐的第一个反应单元顶部流入,并逐级溢流到每个反应单元,由最后一个反应单元流出,流出口高度与竖直隔板的高度一致。
2.根据权利要求1所述的装置,其特征在于:竖直隔板将管式发酵罐分割为2-10个相同的反应单元,隔板的高度为管式发酵罐高度的0.75-0.9倍。
3.根据权利要求1所述的装置,其特征在于:T型挡板下端宽度为每个反应单元宽度的0.5-0.8倍,高度为管式发酵罐高度的0.25-0.5倍。
4.采用权利要求1-3任一所述装置连续发酵生产丁醇的方法,其特征在于包括如下步骤:
(1)将木质纤维素原料进行预处理、酶解获得酶解液,以酶解液为碳源制备发酵培养基,控制总糖浓度为60-80g/L;
(2)在一级发酵罐中加入发酵培养基,并接入发酵菌种子液进行培养,当发酵液OD600值达到5-10时,补加新鲜发酵培养基,随着培养基的不断补加,一级发酵罐中的发酵液溢流至二级发酵罐中;
(3)连续发酵前二级发酵罐为空罐,发酵液利用液位差由一级发酵罐从二级发酵罐的第一个反应单元顶部流入,并逐级溢流到每个反应单元,最终发酵液从最后一个反应单元溢流流出。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于:步骤(1)所述木质纤维素为玉米秸秆,预处理方式采用稀酸蒸汽爆破组合预处理。
6.根据权利要求4所述的方法,其特征在于:步骤(1)控制酶解体系的干物质浓度为20wt%-30wt%,纤维素酶的加入量使得纤维素酶与预处理原料中纤维素的比例为5-25IU/g纤维素,酶解的pH值为4.5-5.5,温度为45-55℃,酶解时间为48-96h。
7.根据权利要求4所述的方法,其特征在于:步骤(1)所述发酵培养基以木质纤维素酶解液为碳源,控制总糖浓度为60-80g/L,加入以下营养元素配成发酵培养基,以g/L计为:酵母 1.0,CH3COONH4 2.2,KH2PO4 0.5,K2HPO4 0.5,MnSO4 0.01,NaCl 0.01,MgSO4·7H2O 0.2,FeSO4 0.01,对氨基苯甲酸 0.001,维生素B1 0.001,生物素0.01×10-3。
8.根据权利要求4所述的方法,其特征在于:步骤(2)所述丁醇发酵菌采用丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) ATCC 824,购于美国模式菌种收集中心;或者采用拜氏梭菌CM20,其分类命名为拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii),已于2014年06月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.9354。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于:步骤(2)采用RCM培养基制备发酵菌种子液,在种子液培养基中接入丁醇发酵菌,厌氧环境下于36-38℃下培养16-20h获得的。
10.根据权利要求4所述的方法,其特征在于:步骤(2)按照2%-10%(v/v)的接种量由一级发酵罐顶部接入种子液,发酵温度36-38℃,当菌体的OD600值达到5-10后,以恒流速0.02-0.06V/h补加新鲜发酵培养基到一级发酵罐中。
11.根据权利要求4所述的方法,其特征在于:步骤(3)中一级发酵罐和二级发酵罐在接种前用高压水蒸气灭菌并持续用高纯氮气吹扫以维持厌氧的环境直至菌体发酵产气。
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