CN106755146B

CN106755146B - 一种连续发酵生产长链二元酸的方法及装置

Info

Publication number: CN106755146B
Application number: CN201510802343.4A
Authority: CN
Inventors: 张霖; 樊亚超; 廖莎; 李晓姝; 师文静
Original assignee: China Petroleum and Chemical Corp; Sinopec Fushun Research Institute of Petroleum and Petrochemicals
Current assignee: China Petroleum and Chemical Corp; Sinopec Fushun Research Institute of Petroleum and Petrochemicals
Priority date: 2015-11-19
Filing date: 2015-11-19
Publication date: 2020-04-10
Anticipated expiration: 2035-11-19
Also published as: CN106755146A

Abstract

本发明公开了一种连续发酵生产长链二元酸的方法，包括（1）将发酵菌种进行活化培养获得发酵菌液，加入到种子循环罐中；（2）在种子循环罐中进行扩大培养；（3）将种子循环罐与发酵罐连接成双向闭合循环回路，双向回路交替运行，进行发酵菌种扩大培养，在种子循环罐顶部和底部设有金属过滤膜，在循环过程中以滤膜形式对菌体进行选择性截留；（4）当发酵罐内菌体培养至一定浓度，与种子循环罐断开，补加正构烷烃，进行单独发酵；（5）将种子循环罐与培养基储罐连接成单向闭合循环回路，进行发酵菌种二次培养；（6）当种子循环罐内生物量累积到一定量，将种子循环罐与培养基储罐断开，与新发酵罐连接，从而实现连续发酵过程。本发明提高了发酵种子液的培养效果，优化了连续发酵模式，提高了发酵效率和稳定性。

Description

一种连续发酵生产长链二元酸的方法及装置

技术领域

本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种连续发酵生产长链二元酸的方法及装置。

背景技术

长链二元酸（Long chain dicarboxylic acids）是指碳链中含有10个以上碳原子的脂肪族二羧酸（简称DCn或DCA），包括饱和及不饱和二羧酸，是一类有着重要和广泛工业用途的精细化工产品，是化学工业中合成高级香料、高性能尼龙工程塑料、高档尼龙热熔胶、高温电介质、高级油漆和涂料、高级润滑油、耐寒性增塑剂、树脂、医药和农药等重要原料。

发酵法生产长链二元酸是利用微生物特有的氧化能力和微生物胞内酶的作用，在常温常压下分别通过α、ω-氧化，将长链正烷烃两端的甲基氧化成为羧基，生成相应链长的各种长链二元酸。能利用石油烃类的细菌、霉菌和放线菌的种类很多，其中假丝酵母属（candida）的酵母菌是正烷烃发酵生产二元酸的高产微生物。长链二元酸发酵是典型的气相（空气）—水相（发酵液）—油相（烷烃）—固相（菌体）四相体系，培养基传质不均、高通气量带来的染菌风险、长达144h以上的发酵周期，诸多不利影响因素严重影响发酵菌种的活力，制约发酵水平。

在生物发酵生产长链二元酸的过程中，长链二元酸的产品收率通过提取、精制技术的改进进一步提升的空间非常有限，降低长链二元酸生产成本的潜力在于发酵技术的提高。目前，生物发酵生产DCA 都采用间歇式分批培养发酵，种子培养需采取逐级扩大的方法，即从斜面到摇瓶，再依次经过一级和二级种子罐逐级培养后，转入发酵罐进行目的产物生产。

CN102115768A公开了一种利用微生物同步发酵正十六烷烃高产十六碳二元酸的方法，在热带假丝酵母(candida tropicalis)突变株ly-6接入含有正十六烷烃为基质的培养基后，28小时以内，pH控制在7.1以下，以菌体生长为主，产生一定量的二元酸；28-60小时，pH控制在7.5以内，以产酸为主，也增长一定量的菌体；60小时以后，pH控制在8.0以下，迅速生产二元酸；120小时以后，pH控制在8.5以下，连续生产二元酸。在30m³发酵罐内，发酵165小时，DC₁₆产量达到170.5g/l。CN102115767A公开了一种利用微生物同步发酵正十一烷(nC11)高产十一碳二羧酸(DC₁₁)的方法，在热带假丝酵母(Candida tropicalis) ly-1接入正烷烃为基质的培养基后，28小时内，pH控制在6.8以下，以菌体生长为主，也产生一定量的二元酸；28-60小时，pH控制在7.3以下，以产酸为主，也增长一定量的菌体；60小时以后，pH控制在8.0以下，迅速产生各种二元酸。在210m³发酵罐内，发酵150小时，DC11产量高达156g/L，转化率达到86.7%，DC₁₁纯度达到98.2%。

上述发酵过程中，种子培养均需采取逐级扩大的方式，种子培养累计需要3-5 天，造成设备利用率降低，由于转种的次数多，在转种的过程中种子发生染菌的机率大大增加，同时，发酵批次之间产酸水平波动较大，造成生产不稳定。

CN102071226A公开了一种长链二元酸制备过程中的串罐发酵工艺，每个发酵罐的种子都直接来源于前一个发酵罐的发酵液，而不经过逐级扩大培养。取发酵液的一部分作为种子接种到另一发酵罐进行培养发酵，依次类推，进行串罐发酵培养，虽然能够缩短周期，提高设备的利用率，但是在实际应用中，存在菌体活力退化、染菌风险增加等不利影响。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种连续发酵生产长链二元酸的方法和装置。本发明方法提高了发酵种子液的培养效果，优化了连续发酵模式，提高了发酵效率和发酵稳定性。

本发明连续发酵生产长链二元酸的方法，包括如下内容：

（1）将发酵菌种进行活化培养获得发酵菌液，加入到种子循环罐中；

（2）在种子循环罐中对发酵菌种进行扩大培养，培养至一定生物量后结束；

（3）将种子循环罐与发酵罐通过泵、阀和管道连接成双向闭合循环回路，双向回路交替运行，进行发酵菌种的扩大培养，在种子循环罐的顶部和底部分别设有金属过滤膜，在循环运行过程中以滤膜形式对菌体进行选择性截留；

（4）步骤（3）中当发酵罐内菌体细胞培养至一定浓度后，与种子循环罐断开，在发酵罐内补加正构烷烃，进行单独发酵；

（5）将种子循环罐与培养基储罐通过泵、阀和管道连接成单向闭合循环回路，进行发酵菌种二次培养；

（6）当种子循环罐内生物量累积到一定量后，将种子循环罐与培养基储罐断开，与新的发酵罐连接，重复上述操作，从而实现连续发酵过程。

本发明中，所述的二元酸发酵菌种选自能利用正构烷烃生长的微生物或具有完整α、ω-氧化途径，并且在生命周期内具有明显形态差异的微生物，如假丝酵母属，优选热带假丝酵母。该类菌体在某些条件下处于发酵期，形成球状菌体形态，从而利于菌体从种子循环罐到发酵罐的扩散；在某些条件下，则处于旺盛的生长期，形成长丝状菌体形态，从而利于在种子循环罐中进行细胞固定。

本发明中，步骤（1）所述的活化培养是将发酵菌种进行斜面活化、摇瓶培养活化等本领域常规采用的手段。一般培养温度为29-32℃，摇床转数为100-200rpm。当菌体细胞浓度达到10-20g/L时，转入种子循环罐中。种子培养基组成为：蔗糖20-50g/L、玉米浆1-3g/L、酵母膏1-2g/L、氯化钠0.5-1.5g/L、磷酸二氢钾3-8g/L、硫酸镁1-2g/L、尿素1-5g/L。

本发明中，步骤（2）按照5-15倍进行扩大培养，优选7-10倍进行扩大培养。培养条件为：搅拌转速为100-200rpm，通气量为0.1-0.4VVM，培养温度为29-32℃，培养pH为5-7。当菌体细胞浓度达到10-20g/L时，结束培养。

本发明中，步骤（3）将发酵罐与种子循环罐连通，顺时针循环运行一定时间后，切换至逆时针循环运行，直至进入单独发酵阶段，每次运行时间为15-30min，泵的流速为每小时1-3倍于种子循环罐体积。发酵培养基组成为：蔗糖10-20g/L、玉米浆1-3g/L、酵母膏1-2g/L、氯化钠0.5-1.5g/L、磷酸二氢钾3-8g/L、硫酸镁1-2g/L、尿素1-5g/L、醋酸钠1-5g/L。发酵罐中，发酵培养基的初始装液体积为发酵罐体积的50%-60%。本发明发酵初期控制体系pH值为4-6，搅拌转速为500-800rpm，通气量为0.8-1.2VVM，培养温度为29-32℃。本发明在低糖浓度、高溶氧的条件下，使菌体处于发酵期，形成球状菌体形态，从而利于菌体从种子循环罐到发酵罐的扩散。

本发明中，步骤（3）在种子循环罐的顶部和底部设置有金属过滤膜，膜孔直径为30-100μm，优选为30-50μm，在循环运行过程中以滤膜形式对菌体进行选择性截留，避免非球状菌体进入发酵罐中，也不影响球状菌体的输送。

本发明中，步骤（3）中当发酵罐中菌体细胞浓度达到5-10g/L时，可以将发酵罐与种子循环罐断开，进行单独发酵。

本发明中，步骤（4）单独发酵开始时，将体系pH值调至6.8-7，并一次加入发酵培养基体积20%-30%的正构烷烃。通过逐级调节pH值的方式进行调控，每间隔24小时提高一次pH值，每次提高0.1-0.5，同时补加一定体积的正构烷烃，以维持发酵液中烷烃体积比（烷烃占发酵液的体积比）为10%-15%，直至发酵结束。单独发酵条件为：搅拌转速为100-700rpm，通气量为0.6-1.0VVM，发酵温度为29-32℃，发酵时间为96-120小时。

本发明中，步骤（5）种子循环罐内菌种的二次培养条件为：pH值为6-8，搅拌转速为50-100rpm，通气量为0.2-0.4VVM，泵的流速为每小时0.02-0.1倍于培养基储罐的体积。本发明步骤（5）在高糖浓度、低溶氧的条件下，使菌体处于旺盛的生长期，形成长丝状菌体形态，从而利于在种子循环罐中进行细胞固定。以流加蔗糖的形式对蔗糖浓度进行控制，使体系蔗糖浓度为20-50g/L。

本发明中，步骤（6）当种子循环罐内菌体细胞浓度达到10-20g/L时，将种子循环罐与培养基储罐断开，与其他新的发酵罐连接，重复上述操作，从而实现连续发酵过程。

本发明中，发酵反应结束后，取发酵罐中发酵液，除去菌体蛋白，通过酸析结晶后获得长链二元酸产品。

本发明用于上述连续发酵生产长链二元酸的装置，包括发酵罐、种子循环罐和培养基储罐，在种子循环罐顶部和底部设有金属过滤膜，膜孔直径为30-100μm，将种子循环罐与发酵罐通过泵、阀和管道连接成双向闭合循环回路，双向回路交替运行，在循环运行过程中以滤膜形式对菌体进行选择性截留；当发酵罐内菌体细胞培养到一定浓度后，与种子循环罐断开，在发酵罐内补加正构烷烃，进行单独发酵；种子循环罐与培养基储罐通过泵、阀和管道连接成单向闭合循环回路，进行发酵菌种二次培养；当种子循环罐内生物量累积到一定量后，将种子循环罐与培养基储罐断开，与新的发酵罐连接，重复上述操作，从而实现连续发酵过程。在发酵罐和种子循环罐底部分别设有供气系统，提供反应体系所需气量。

与现有技术相比，本发明方法具有如下优点：

（1）本发明首先在低糖浓度、高溶氧条件下，使菌体处于发酵期，形成球状菌体形态，从而利于菌体从种子循环罐到发酵罐的扩散；当菌体细胞干重达到一定质量后，发酵罐与种子循环罐断开，进行单独发酵；最后在高糖浓度、低溶氧条件下，使菌体处于旺盛生长期，形成长丝状菌体形态，从而利于在种子循环罐中进行细胞固定培养。本发明利用二元酸发酵菌体生长周期中存在的形态变化，对菌体形态进行特定调节，满足发酵过程和种子培养过程菌体形态的不同要求，提高了发酵效率和发酵稳定性。

（2）针对菌体形态的显著差异，以滤膜形式对菌体进行选择性截留的细胞固定方式，区别于细胞包埋等传统的细胞固定手段，对细胞损害较小，易于进行连续发酵生产。

（3）利用培养基储罐对种子循环罐进行限制性生长因子的补充，并采用溶氧、pH调节方式对发酵菌种进行生长形态的调控，利于生物量累积，从而实现连续发酵的生产模式。

（4）对于二元酸这样的好氧发酵体系而言，染菌问题非常普遍。本发明方法减少了菌体逐级培养的传统模式，克服了菌体串罐培养的不足，使发酵菌种始终处于一级培养阶段，从而有利于降低发酵染菌风险，并缩短发酵周期，提高发酵效率。

附图说明

图1是本发明连续发酵生产长链二元酸装置发酵段的结构示意图；

图2是本发明连续发酵生产长链二元酸装置种子二次培养的结构示意图；

其中，1-发酵罐，2-种子循环罐，3-培养基储罐，4-金属过滤膜，5-供气系统，6-阀门组件，7-泵组件。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明方法的具体过程及效果进行详细说明，但不局限于以下实施例。

本发明连续发酵生产长链二元酸的装置如附图1和2，包括发酵罐1、种子循环罐2和培养基储罐3，在种子循环罐的顶部和底部设置有金属过滤膜4，膜孔直径为50μm，在循环运行过程中以滤膜形式对菌体进行选择性截留；将种子循环罐2与发酵罐1通过泵7-1、7-2，以及阀6-1、6-2、6-3、6-4和管道连接成双向闭合循环回路，双向回路交替运行；当发酵罐内菌体细胞浓度达到一定量后，与种子循环罐断开，在发酵罐内补加正构烷烃，进行单独发酵；种子循环罐2与培养基储罐3通过泵7-5、阀6-5、6-6、6-7和管道连接成单向闭合循环回路，进行发酵菌种二次培养；当种子循环罐内生物量累积到一定量后，将种子循环罐与培养基储罐断开，与新的发酵罐连接，重复上述操作，从而实现连续发酵过程。在发酵罐和种子循环罐底部分别设有供气系统5，提供反应体系所需的气体。

本实施例中选用热带假丝酵母（Candida tropicalis）突变株PF-UV-56作为发酵菌株进行长链烷烃发酵生产长链二元酸实验，该突变株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.0356。

本发明采用的发酵罐体积100L，种子循环罐体积10L，培养基储罐体积7L，初始状态下，种子循环罐和培养基储罐装液体积为罐体积的80%，发酵罐装液体积为罐体积的56%。

本发明种子培养基各组分含量为：蔗糖50g/L、玉米浆3g/L、酵母膏1g/L、氯化钠0.5g/L、磷酸二氢钾3g/L、硫酸镁2g/L、尿素1g/L。

本发明发酵培养基各组分含量为：蔗糖10g/L、玉米浆1g/L、酵母膏2g/L、氯化钠1.5g/L、磷酸二氢钾8g/L、硫酸镁2g/L、尿素5g/L、醋酸钠1g/L。

本发明中菌体细胞浓度的测定方法如下：（1）打开分光光度计电源，置波长于620nm下，选择吸光度方式；（2）取一定体积的试样，按一定的稀释倍数( 使吸光度在0.2～0.8范围内 )用溶媒稀释，以溶媒做空白测定其吸光度，根据回归方程计算菌体浓度。回归方程为：；C为菌体浓度，g/L； A为吸光度；n为稀释倍数。

本发明中二元酸浓度的测定方法如下：

（1）用6M氢氧化钠溶液调节试样发酵液的pH值至10，煮沸、离心、除去菌体和烷烃，留取清液做待测试样；

（2）取一定体积的待测试样，用12M 硫酸溶液调 pH 值至 2，加热、冷却、置于布氏漏斗中，用蒸馏水洗涤至中性；

（3）将滤纸及沉淀物转入 250mL锥形瓶中，加入30mL中性乙醇溶液，使二元酸完全溶于中性乙醇溶液中，用0.2M标准氢氧化钾溶液滴定至与中性乙醇溶液相同的微红色止。

（4）按照公式计算出二元酸浓度

式中：C为二元酸浓度，g/L； N为氢氧化钾标准溶液的浓度，mol/L；V₁为滴定消耗氢氧化钾标准溶液的体积，mL；E为二元酸分子量之半；V为待测试样（清液）的体积，mL。

实施例1

（1）将斜面保藏菌种接种于4个5L摇瓶（摇瓶装液量200mL）进行菌种活化培养，培养温度为32℃，摇床转数为200rpm。当菌体细胞浓度达到10g/L时，取活化培养液800mL，转入10L种子循环罐。

（2）在种子循环罐中加入7.2L种子培养基进行发酵菌种的扩大培养。培养条件为：搅拌转速为200rpm，通气量为0.4VVM，培养温度为32℃，培养pH为5.0。当菌体细胞浓度达到10g/L时，结束培养。

（3）将发酵罐与种子循环罐连通，进行发酵菌种的扩大培养，发酵罐中加入56L发酵培养基。具体过程为：将发酵罐与种子循环罐连接，开启阀6-1、阀6-2、阀6-4、泵7-1，关闭阀6-3、泵7-2；运行15min后，关闭阀6-4、泵7-1，开启阀6-1、阀6-2、阀6-3、泵7-2；每隔15min进行一次切换，泵的流速为25L/h。培养条件为：搅拌转速为500rpm，通气量为0.8VVM，培养温度为32℃，培养pH为4。

（4）当发酵罐内菌体细胞浓度达到8g/L，将发酵罐与种子循环罐断开，发酵罐内补加12L十二碳正构烷烃，发酵体系pH值调至6.8，进行单独发酵。单独发酵条件为：搅拌转速为100rpm，通气量为0.6VVM，发酵温度为32℃，发酵时间为120小时。发酵过程中，每间隔24小时将pH提高0.2，并补加一定体积烷烃，使发酵液中烷烃体积比达到10%，直至发酵结束。

（5）将种子循环罐与培养基储罐连通，开启阀6-5、阀6-6、泵7-5，泵的流速为0.56L/h，进行发酵菌种二次培养。二次培养条件为：pH值为7，搅拌转速为50rpm，通气量为0.3VVM。以200g/L蔗糖流加的形式对蔗糖浓度进行控制，使体系蔗糖浓度维持在20g/L。

（6）当种子循环罐内生物量累积到菌体细胞浓度达到10g/L，将种子循环罐与培养基储罐断开，完成发酵菌种二次培养。将种子循环罐与新的发酵罐连接，重复（2）-（5）过程，从而实现连续发酵。

一个连续发酵周期内（300h），共实现4个发酵罐的连续运转，终止发酵时各个发酵罐内十二碳二元酸浓度为145g/L、152g/L、146g/L、150g/L，经破乳、超滤、酸析、干燥处理，共收集粗酸精制产品37.95Kg。

实施例2

（1）将斜面保藏菌种接种于5个5L摇瓶（摇瓶装液量200mL）进行菌种活化培养，培养温度为32℃，摇床转数为200rpm。当菌体细胞浓度达到15g/L时，取活化培养液1000mL，转入10L种子循环罐。

（2）在种子循环罐中加入7L种子培养基进行发酵菌种的扩大培养。培养条件为：搅拌转速为200rpm，通气量为0.4VVM，培养温度为32℃，培养pH为5.0。当菌体细胞浓度达到12g/L时，结束培养。

（3）将发酵罐与种子循环罐连通，进行发酵菌种的扩大培养，发酵罐中加入56L发酵培养基。具体过程为：将发酵罐与种子循环罐连接，开启阀6-1、阀6-2、阀6-4、泵7-1，关闭阀6-3、泵7-2；运行30min后，关闭阀6-4、泵7-1，开启阀6-1、阀6-2、阀6-3、泵7-2；每隔30min进行一次切换，泵的流速为10L/h。培养条件为：搅拌转速为800rpm，通气量为1.2VVM，培养温度为32℃，培养pH为6。

（4）当发酵罐内菌体细胞浓度达到9.2g/L，将发酵罐与种子循环罐断开，发酵罐内补加15L十二碳正构烷烃，发酵体系pH值调至6.8，进行单独发酵。单独发酵条件为：搅拌转速为100rpm，通气量为0.6VVM，发酵温度为32℃，发酵时间为120小时。发酵过程中，每间隔24小时将pH提高0.3，并补加一定体积烷烃，使发酵液中烷烃体积比达到12%，直至发酵结束。

（5）将种子循环罐与培养基储罐连通，开启阀6-5、阀6-6、泵7-5，泵的流速为0.28L/h，进行发酵菌种二次培养。二次培养条件为：pH值为7，搅拌转速为100rpm，通气量为0.2VVM。以200g/L蔗糖流加的形式对蔗糖浓度进行控制，使体系蔗糖浓度维持在45g/L。

（6）当种子循环罐内生物量累积到菌体细胞浓度达到15g/L，将种子循环罐与培养基储罐断开，完成发酵菌种二次培养。将种子循环罐与新的发酵罐连接，重复（2）-（5）过程，从而实现连续发酵。

一个连续发酵周期内（336h），共实现4个发酵罐的连续运转，终止发酵时各个发酵罐内十二碳二元酸浓度为139g/L、142g/L、155g/L、148g/L，经破乳、超滤、酸析、干燥处理，共收集粗酸精制产品37.37Kg。

实施例3

（1）将斜面保藏菌种接种于5个5L摇瓶（摇瓶装液量200mL）进行菌种活化培养，培养温度为32℃，摇床转数为200rpm。当菌体细胞浓度达到20g/L时，取活化培养液1000mL，转入10L种子循环罐。

（2）在种子循环罐中加入7L种子培养基进行发酵菌种的扩大培养。培养条件为：搅拌转速为100rpm，通气量为0.2VVM，培养温度为32℃，培养pH为6.0。当菌体细胞浓度达到15g/L时，结束培养。

（3）将发酵罐与种子循环罐连通，进行发酵菌种的扩大培养，发酵罐中加入56L发酵培养基。具体过程为：将发酵罐与种子循环罐连接，开启阀6-1、阀6-2、阀6-4、泵7-1，关闭阀6-3、泵7-2；运行15min后，关闭阀6-4、泵7-1，开启阀6-1、阀6-2、阀6-3、泵7-2；每隔15min进行一次切换，泵的流速为15L/h。培养条件为：搅拌转速为500rpm，通气量为0.8VVM，培养温度为32℃，培养pH为4。

（4）当发酵罐内菌体细胞浓度达到8g/L，将发酵罐与种子循环罐断开，发酵罐内补加15L十二碳正构烷烃，发酵体系pH值调至6.8，进行单独发酵。单独发酵条件为：搅拌转速为500rpm，通气量为1.0VVM，发酵温度为32℃，发酵时间为120小时。然后每间隔24小时将pH提高0.2，并补加一定体积烷烃，使发酵液中烷烃体积比达到10%，直至发酵结束。

（5）将种子循环罐与培养基储罐连通，开启阀6-5、阀6-6、泵7-5，泵的流速为0.56L/h，进行发酵菌种二次培养。二次培养条件为：pH值为7，搅拌转速为50rpm，通气量为0.4VVM。以200g/L蔗糖流加的形式对蔗糖浓度进行控制，使体系蔗糖浓度维持在25g/L。

（6）当种子循环罐内生物量累积到菌体细胞浓度达到20g/L，将种子循环罐与培养基储罐断开，完成发酵菌种二次培养。将种子循环罐与新的发酵罐连接，重复（2）-（5）过程，从而实现连续发酵。

一个连续发酵周期内（408h），共实现7个发酵罐的连续运转，终止发酵时各个发酵罐内十二碳二元酸浓度为149g/L、150g/L、145g/L、148g/L、142g/L、139g/L、138g/L，经破乳、超滤、酸析、干燥处理，共收集粗酸精制产品64.7Kg。

比较例1

按照实施例1中的方法和步骤进行批次发酵，具体过程如下：

（3）将种子循环罐中种子液直接转入发酵罐中，与发酵罐内56L发酵培养基混合均匀。培养条件为：搅拌转速为500rpm，通气量为0.8VVM，培养温度为32℃，培养pH为4。

（4）当发酵罐内菌体细胞浓度达到8g/L，发酵罐内补加12L十二碳正构烷烃，进行产酸发酵。工艺条件为：搅拌转速为100rpm，通气量为0.6VVM，发酵温度为32℃，发酵时间为120小时。发酵体系pH值调至6.8，然后每间隔24小时将pH提高0.2，并补加一定体积烷烃，使发酵液中烷烃体积比达到10%，直至发酵结束。

按照步骤（1）-（4）共进行4个批次的发酵，耗时600h，终止发酵时各个发酵罐内十二碳二元酸浓度为140g/L、154g/L、150g/L、138g/L，经破乳、超滤、酸析、干燥处理，共收集粗酸精制产品32.59Kg。从该试验效果来看，本发明的连续发酵试验周期显著缩短，发酵稳定性更好。

比较例2

处理工艺及操作条件同实施例1。不同之处在于：不设置金属过滤膜。

一个连续发酵周期内（360h），共实现4个发酵罐的连续运转，终止发酵时各个发酵罐内十二碳二元酸浓度为150g/L、135g/L、122g/L、110g/L，经破乳、超滤、酸析、干燥处理，共收集粗酸精制产品30.08Kg。

从试验效果来看，由于没有金属过滤膜的选择性截留作用，使种子循环罐中菌体留存量降低，二次培养时间延长。从连续发酵周期来看，虽然总发酵时间延长，但是有效发酵时间降低，严重影响了发酵水平。

比较例3

处理工艺及操作条件同实施例1。不同之处在于步骤（5）二次培养条件为：pH值为4，搅拌转速为500rpm，通气量为0.8VVM。并且不进行蔗糖流加。

一个连续发酵周期内（360h），共实现4个发酵罐的连续运转，终止发酵时各个发酵罐内十二碳二元酸浓度为148g/L、140g/L、131g/L、119g/L，经破乳、超滤、酸析、干燥处理，共收集粗酸精制产品34.43Kg。

从试验效果来看，由于在二次培养过程中没有进行蔗糖浓度控制及低溶氧调节，从而使种子二次培养时间延长。从连续发酵周期来看，虽然总发酵时间延长，但是有效发酵时间降低，发酵产酸水平偏低。

Claims

1.一种连续发酵生产长链二元酸的方法，其特征在于包括如下内容：

（1）将发酵菌种进行活化培养获得发酵菌液，加入到种子循环罐中；所述的发酵菌种为热带假丝酵母（Candida tropicalis）突变株PF-UV-56，保藏编号为CGMCC NO.0356；

（2）在种子循环罐中加入种子培养基对发酵菌种进行扩大培养，培养至菌体细胞浓度达到10-20g/L时结束；

（3）将种子循环罐与发酵罐通过泵、阀和管道连接成双向闭合循环回路，双向回路交替运行，进行发酵菌种的扩大培养，在种子循环罐的顶部和底部分别设有金属过滤膜，在循环运行过程中以滤膜形式对菌体进行选择性截留；所述发酵罐的发酵培养基组成为：蔗糖10-20g/L、玉米浆1-3g/L、酵母膏1-2g/L、氯化钠0.5-1.5g/L、磷酸二氢钾3-8g/L、硫酸镁1-2g/L、尿素1-5g/L、醋酸钠1-5g/L；发酵培养基的初始装液体积为罐体积的50%-60%；发酵初期控制体系pH值为4-6，搅拌转速为500-800rpm，通气量为0.8-1.2VVM，培养温度为29-32℃；金属过滤膜的膜孔直径为30-100μm；

（4）步骤（3）中当发酵罐内菌体细胞培养至5-10g/L时，与种子循环罐断开，在发酵罐内补加正构烷烃，进行单独发酵；

（5）将种子循环罐与培养基储罐通过泵、阀和管道连接成单向闭合循环回路，进行发酵菌种二次培养；二次培养条件为：pH值为6-8，搅拌转速为50-100rpm，通气量为0.2-0.4VVM，泵的流速为每小时0.02-0.1倍于培养基储罐的体积；以流加蔗糖的形式对蔗糖浓度进行控制，使体系蔗糖浓度为20-50g/L；

（6）当种子循环罐内菌体细胞浓度达到10-20g/L时，将种子循环罐与培养基储罐断开，与新的发酵罐连接，重复上述操作，从而实现连续发酵过程。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述的活化培养温度为29-32℃，摇床转数为100-200rpm；当菌体细胞浓度达到10-20g/L时，转入种子循环罐中。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）所述的种子培养基组成为：蔗糖20-50g/L、玉米浆1-3g/L、酵母膏1-2g/L、氯化钠0.5-1.5g/L、磷酸二氢钾3-8g/L、硫酸镁1-2g/L、尿素1-5g/L。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）按照5-15倍进行扩大培养，培养条件为：搅拌转速为100-200rpm，通气量为0.1-0.4VVM，培养温度为29-33℃，培养pH为5-7。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）将发酵罐与种子循环罐连通，顺时针循环运行15-30min后，切换至逆时针循环运行15-30min，直至进入单独发酵阶段，泵的流速为每小时1-3倍于种子循环罐体积。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（4）单独发酵开始时，将体系pH值调至6.8-7，并一次加入发酵培养基体积20%-30%的正构烷烃。

7.根据权利要求1或6所述的方法，其特征在于：步骤（4）单独发酵过程中，通过逐级调节pH值的方式进行调控，每间隔24小时提高一次pH值，每次提高0.1-0.5，同时补加一定体积的正构烷烃，以维持发酵液中烷烃体积比为10%-15%，直至发酵结束。

8.根据权利要求1或6所述的方法，其特征在于：步骤（4）单独发酵条件为：搅拌转速为100-700rpm，通气量为0.6-1.0VVM，发酵温度为29-32℃，发酵时间为96-120小时。

9.用于权利要求1所述连续发酵生产长链二元酸方法的装置，其特征在于：包括发酵罐、种子循环罐和培养基储罐，在种子循环罐顶部和底部设有金属过滤膜，膜孔直径为30-100μm，将种子循环罐与发酵罐通过泵、阀和管道连接成双向闭合循环回路，双向回路交替运行，在循环运行过程中以滤膜形式对菌体进行选择性截留；当发酵罐内菌体细胞培养到5-10g/L时，与种子循环罐断开，在发酵罐内补加正构烷烃，进行单独发酵；种子循环罐与培养基储罐通过泵、阀和管道连接成单向闭合循环回路，进行发酵菌种二次培养；当种子循环罐内菌体细胞浓度达到10-20g/L时，将种子循环罐与培养基储罐断开，与新的发酵罐连接，重复上述操作，从而实现连续发酵过程。