CN109295118B - 一种丙酸杆菌的循环发酵方法 - Google Patents

一种丙酸杆菌的循环发酵方法 Download PDF

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Abstract

本发明提出了一种丙酸杆菌的循环发酵方法，包括以下步骤：(1)培养好的丙酸杆菌菌体进入含有培养基的发酵罐中进行发酵，获得发酵液；(2)将步骤(1)中的发酵液进行陶瓷膜循环过滤，过滤获得含有丙酸的发酵液清液，将含有丙酸杆菌的菌体浓缩液送至发酵罐中，添加新鲜培养基进行发酵；(3)循环步骤(2)，直至产酸速度明显下降时，停止循环；(4)重复步骤(1)‑(3)，开始新一轮的丙酸杆菌的循环发酵。本发明采用陶瓷膜过滤，实现了丙酸杆菌菌体的循环利用，缩短了丙酸杆菌菌体的培养周期，降低了生产成本，提高了生产效率。

Description

一种丙酸杆菌的循环发酵方法
技术领域
本发明涉及菌体发酵技术领域，特别是指一种丙酸杆菌的循环发酵方法。
背景技术
采用丙酸杆菌进行发酵获得丙酸，可用于食品、石料、医药等多个领域。而丙酸杆菌在发酵过程中需要先培养种子才能进入发酵阶段，按照生长情况，种子罐培养需要经过多级扩大，浓度才能达到进入发酵罐的要求。当种子罐长好移种到发酵罐后，发酵罐也需要一段时间的培养，菌体经历适应期、对数生长期之后，菌体浓度才能趋于稳定，大量生长产生所需产物。丙酸杆菌发酵过程中，真正产生产物的时间是在发酵罐培养到稳定期之后的三到五天，而菌体培养都已经超过15天，因此菌体培养大大的延长了丙酸杆菌发酵的周期、增加了成本而且因为多级发酵，染菌率一直居高不下。
如何在菌体活力充足的情况下，尽可能的使菌体生产出所需产品成了现阶段生物发酵研究的主要方向。目前发酵培养的主要方式有单批发酵、补料分批发酵、循环发酵。其中单批发酵使用较少，主要是菌种生长时间短，成本低的产业。循环发酵因为各种限制，目前只在污水处理中得以实现。运用最多的是补料分批发酵，比如抗生素、维生素、氨基酸等均使用补料分批发酵。补料分批发酵(Fed-Batch Culture，FBC)又称“半连续发酵”或者“流加发酵”，是指在微生物分批发酵过程中，以某种方式向发酵系统中补加某种营养物质或者全培养基，但并不连续地向外放出发酵液的发酵技术。但是在放出发酵液的时候依然存在菌体流失的情况。
发明内容
本发明提出一种丙酸杆菌的循环发酵方法，采用陶瓷膜过滤，实现菌体循环利用，减少菌体流失，缩短了菌体培养周期，降低了生产成本，提高了生产效率。
本发明的技术方案是这样实现的：一种丙酸杆菌的循环发酵方法，包括以下步骤：
(1)培养好的丙酸杆菌菌体进入含有培养基的发酵罐中进行发酵，获得发酵液；
(2)将步骤(1)中的发酵液进行陶瓷膜循环过滤，过滤获得含有丙酸的发酵液清液，将含有丙酸杆菌的菌体浓缩液送至发酵罐中，添加新鲜培养基进行发酵；
(3)循环步骤(2)，直至产酸速度明显下降时，停止循环；
(4)重复步骤(1)-(3)，开始新一轮的丙酸杆菌的循环发酵。
进一步地，步骤(2)中，发酵液进行陶瓷膜循环过滤获得初级菌体浓缩液，初级菌体浓缩液的体积为发酵液总体积的24-26％，向初级菌体浓缩液中加入等体积的无菌纯水，然后继续进行陶瓷膜循环过滤获得二级菌体浓缩液，二级菌体浓缩液的体积与初级菌体浓缩液的体积相同，将二级菌体浓缩液送至发酵罐中，补入新鲜培养基，二级菌体浓缩液与新鲜培养基的体积比为1:2.5-3.5。初级菌体浓缩液的体积为发酵液总体积的比例过高时，不能实现产品丙酸的充分过滤，最终导致二级菌体浓缩液中丙酸含量过高，丙酸含量过高时，对丙酸杆菌的生长和产酸都有抑制左右，会影响后续丙酸杆菌循环发酵；初级菌体浓缩液的体积为发酵液总体积的比例过低时，容易导致陶瓷膜组件阻塞，提高了陶瓷膜组件的清洗成本，而且降低了陶瓷膜组件的使用寿命。
进一步地，步骤(3)中，当产酸速度低于5g/L/天时，停止循环。
进一步地，步骤(2)中，陶瓷膜循环过滤包括以下步骤：发酵液先由发酵罐进入暂存罐，然后通过供料泵送至陶瓷膜，最后启动循环泵，使发酵液在暂存罐和陶瓷膜之间循环。
进一步地，暂存罐的罐压控制在0.03-0.05MPa，供料泵频率控制在45Hz，循环泵频率控制在35Hz。
进一步地，步骤(1)中发酵罐的培养基：碳酸钙10-20g/L，酵母浸粉10-20g/L，葡萄糖30-50g/L，pH值自然；随着发酵罐中发酵的进行，根据发酵液pH值的变化流加浓度为20％的氢氧化钙水溶液，保持发酵液pH值维持在5.0-6.5之间，发酵罐罐温控制在29～33℃，压力0.02～0.05Mpa，搅拌速度50～80rpm。
进一步地，步骤(1)丙酸杆菌菌体进入发酵罐前，先由孢子培养成菌种，菌种经种子罐扩大培养；菌种的培养基：乳酸钙5-10g/L，酵母浸粉8-15g/L，葡萄糖50-80g/L，pH值自然，温度控制在29～33℃；种子罐的培养基：碳酸钙10-20g/L，酵母浸粉10-20g/L，葡萄糖30-50g/L，PH自然，温度控制在29～33℃，压力0.02～0.05Mpa，搅拌速度50～80rpm。
本发明的有益效果：
1、提高设备利用率。因菌体回收，再次得以利用，菌体不用经过漫长的发酵周期进行种子培养，所以发酵设备得以充分运用。而且菌体回收后，菌体浓度直接较大，减少了适应期和对数生长期的时间，发酵罐利用率更高。
2、降低种子培养成本。种子罐培养需要大量原材料，而且为了使菌体能快速生长，大多使用优质碳源氮源，价格较高。菌体回收再次利用后，不需要多次种子培养，所以菌种培养的费用降低。
3、自动化程度高。原始的发酵过程多采用板框过滤，人工要求较多，更换滤布频繁、跑冒滴漏现象频出。采用本发明的发酵方法，发酵液清液直接通过封闭管道输送至下一工序，整个发酵过程仅两人就可以实现，全程电脑控制出液速度，监控发酵罐参数，有利于精细化管理。
4、提高产品产量、降低产品成本。菌体循环发酵，发酵浓缩液中含有上一批培养好的菌体，使得发酵罐中起始菌体浓度较高，生产效率大大提高，菌体代谢产物明显增强，同等培养基量的情况下，产物更多，从而减低了产品成本，在杆菌培养过程中，采用循环发酵后，生产周期从以前的七天，缩短为3～5天，生产效率提高50％。由于减少每批种子培养，发酵罐的原材料成本能降低15％。
5、降低染菌率。菌体种子培养需要多级培养放大，才达到发酵罐使用量。培养过程中逐步放大，培养级数越多，染菌风险越大，菌体循环发酵培养，不需要多次种子罐培养，只需要严格控制发酵罐的循环即可，减低了染菌风险。
6、节能减排降低污染。单批发酵或者半连续补料分批发酵结束后，都需要处理菌体，菌体作为菌渣需要烘干等，一些菌体还不能作为肥料或者饲料，只能作为废渣处理。所以利用菌体循环后，减少了废渣的产生。同时陶瓷膜循环出清液，减少了板框清液的能耗，降低了电能的使用，达到节能减排降低污染的效果。
7、提高陶瓷膜通透性。发酵罐培养基采用碳酸钙作为平衡pH和提供钙离子，碳酸钙会影响陶瓷膜通透性，为配合陶瓷膜循环发酵，使用氢氧化钙流加补入发酵罐替换碳酸钙，pH控制到5.0～6.5，即平衡了PH提供钙离子，也避免了陶瓷膜的影响。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明循环过滤装置的流程示意图。
发酵罐1，暂存罐2，供料泵3，循环泵4，陶瓷膜5，清液输送管6。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一
一种丙酸杆菌的循环发酵方法，包括以下步骤：
(1)培养好的丙酸杆菌菌体进入含有培养基的发酵罐中进行发酵，获得发酵液；
(2)将步骤(1)中的发酵液进行陶瓷膜循环过滤获得初级菌体浓缩液，初级菌体浓缩液的体积为发酵液总体积的25％，向初级菌体浓缩液中加入等体积的无菌纯水，然后继续进行陶瓷膜循环过滤获得二级菌体浓缩液，二级菌体浓缩液的体积与初级菌体浓缩液的体积相同，将二级菌体浓缩液送至发酵罐中，补入新鲜培养基进行发酵，二级菌体浓缩液与新鲜培养基的体积比为1:3，过滤获得含有丙酸的发酵液清液送至下一工序，如进行喷雾干燥，获得产品粉末。
(3)循环步骤(2)，直至产酸速度低于5g/L/天时，停止循环；
(4)重复步骤(1)-(3)，开始新一轮的丙酸杆菌的循环发酵。
步骤(1)中，丙酸杆菌为厌氧菌，通过气体加压系统向发酵罐中通入惰性气体，满足丙酸杆菌发酵所需的厌氧环境以及压强。
步骤(2)中，发酵液进行陶瓷膜循环过滤获得初级菌体浓缩液，初级菌体浓缩液的体积为发酵液总体积的25％，向初级菌体浓缩液中加入等体积的无菌纯水，然后继续进行陶瓷膜循环过滤获得二级菌体浓缩液，二级菌体浓缩液的体积与初级菌体浓缩液的体积相同，将二级菌体浓缩液送至发酵罐中，补入新培养基，二级菌体浓缩液与新鲜培养基的体积比为1:3。
步骤(2)中，如图1所示，陶瓷膜循环过滤包括以下步骤：发酵液先由发酵罐1进入暂存罐2，暂存罐2和陶瓷膜5之间依次设置有供料泵3和循环泵4，然后发酵液通过供料泵3送至陶瓷膜5，带陶瓷膜5完全充满发酵液后，启动循环泵4，通过循环泵4的快速提压，将发酵液在陶瓷膜5的柱芯中过滤，过滤获得含有丙酸的发酵液清液经清液输送管6送至下一工序，而菌体浓缩液返回暂存罐中再次进入陶瓷膜过滤。暂存罐的罐压控制在0.03-0.05MPa，供料泵频率控制在45Hz，循环泵频率控制在35Hz。
步骤(1)中发酵罐的培养基：碳酸钙10g/L，酵母浸粉20g/L，葡萄糖30g/L，pH值自然；随着发酵罐中发酵的进行，根据发酵液pH值的变化，当发酵液pH值低于5.0时，流加浓度为20％的氢氧化钙水溶液，保持发酵液pH值维持在5.0-6.5之间，发酵罐罐温控制在29℃，压力0.02～0.05Mpa，搅拌速度50rpm。
步骤(1)丙酸杆菌菌体进入发酵罐前，先由孢子培养成菌种，菌种经种子罐扩大培养；菌种的培养基：乳酸钙5g/L，酵母浸粉10g/L，葡萄糖50g/L，pH值自然，温度控制在29℃；种子罐的培养基：碳酸钙10g/L，酵母浸粉12g/L，葡萄糖30g/L，PH自然，温度控制在30℃，压力0.02～0.05Mpa，搅拌速度60rpm。
实施例二
本实施例与实施例一基本相同，不同之处在于：步骤(2)中，发酵液进行陶瓷膜循环过滤获得初级菌体浓缩液，初级菌体浓缩液的体积为发酵液总体积的24％，向初级菌体浓缩液中加入等体积的无菌纯水，然后继续进行陶瓷膜循环过滤获得二级菌体浓缩液，二级菌体浓缩液的体积与初级菌体浓缩液的体积相同，将二级菌体浓缩液送至发酵罐中，补入新培养基，二级菌体浓缩液与新鲜培养基的体积比为1:2.5。
步骤(1)中发酵罐的培养基：碳酸钙12g/L，酵母浸粉10g/L，葡萄糖35g/L，pH值自然；随着发酵罐中发酵的进行，根据发酵液pH值的变化，当发酵液pH值低于5.0时，流加浓度为20％的氢氧化钙水溶液，保持发酵液pH值维持在5.0-6.5之间，发酵罐罐温控制在30℃，压力0.02～0.05Mpa，搅拌速度60rpm。
步骤(1)丙酸杆菌菌体进入发酵罐前，先由孢子培养成菌种，菌种经种子罐扩大培养；菌种的培养基：乳酸钙7g/L，酵母浸粉9g/L，葡萄糖60g/L，pH值自然，温度控制在31℃；种子罐的培养基：碳酸钙13g/L，酵母浸粉10g/L，葡萄糖35g/L，PH自然，温度控制在29℃，压力0.02～0.05Mpa，搅拌速度50rpm。
实施例三
本实施例与实施例一基本相同，不同之处在于：步骤(2)中，发酵液进行陶瓷膜循环过滤获得初级菌体浓缩液，初级菌体浓缩液的体积为发酵液总体积的26％，向初级菌体浓缩液中加入等体积的无菌纯水，然后继续进行陶瓷膜循环过滤获得二级菌体浓缩液，二级菌体浓缩液的体积与初级菌体浓缩液的体积相同，将二级菌体浓缩液送至发酵罐中，补入新培养基，二级菌体浓缩液与新鲜培养基的体积比为1:3.5。
步骤(1)中发酵罐的培养基：碳酸钙15g/L，酵母浸粉18g/L，葡萄糖40g/L，pH值自然；随着发酵罐中发酵的进行，根据发酵液pH值的变化，当发酵液pH值低于5.0时，流加浓度为20％的氢氧化钙水溶液，保持发酵液pH值维持在5.0-6.5之间，发酵罐罐温控制在31℃，压力0.02～0.05Mpa，搅拌速度70rpm。
步骤(1)丙酸杆菌菌体进入发酵罐前，先由孢子培养成菌种，菌种经种子罐扩大培养；菌种的培养基：乳酸钙8g/L，酵母浸粉8g/L，葡萄糖70g/L，pH值自然，温度控制在30℃；种子罐的培养基：碳酸钙15g/L，酵母浸粉16g/L，葡萄糖40g/L，PH自然，温度控制在32℃，压力0.02～0.05Mpa，搅拌速度75rpm。
实施例四
本实施例与实施例一基本相同，不同之处在于：步骤(1)中发酵罐的培养基：碳酸钙18g/L，酵母浸粉10g/L，葡萄糖45g/L，pH值自然；随着发酵罐中发酵的进行，根据发酵液pH值的变化，当发酵液pH值低于5.0时，流加浓度为20％的氢氧化钙水溶液，保持发酵液pH值维持在5.0-6.5之间，发酵罐罐温控制在32℃，压力0.02～0.05Mpa，搅拌速度75rpm。
步骤(1)丙酸杆菌菌体进入发酵罐前，先由孢子培养成菌种，菌种经种子罐扩大培养；菌种的培养基：乳酸钙9g/L，酵母浸粉12g/L，葡萄糖75g/L，pH值自然，温度控制在33℃；种子罐的培养基：碳酸钙17g/L，酵母浸粉18g/L，葡萄糖45g/L，PH自然，温度控制在33℃，压力0.02～0.05Mpa，搅拌速度80rpm。
实施例五
本实施例与实施例一基本相同，不同之处在于：步骤(1)中发酵罐的培养基：碳酸钙20g/L，酵母浸粉15g/L，葡萄糖50g/L，pH值自然；随着发酵罐中发酵的进行，根据发酵液pH值的变化，当发酵液pH值低于5.0时，流加浓度为20％的氢氧化钙水溶液，保持发酵液pH值维持在5.0-6.5之间，发酵罐罐温控制在33℃，压力0.02～0.05Mpa，搅拌速度80rpm。
步骤(1)丙酸杆菌菌体进入发酵罐前，先由孢子培养成菌种，菌种经种子罐扩大培养；菌种的培养基：乳酸钙10g/L，酵母浸粉15g/L，葡萄糖80g/L，pH值自然，温度控制在31℃；种子罐的培养基：碳酸钙20g/L，酵母浸粉20g/L，葡萄糖50g/L，PH自然，温度控制在31℃，压力0.02～0.05Mpa，搅拌速度70rpm。
采用实施例一至实施例五的丙酸杆菌的循环发酵方法，供料泵3频率控制在45Hz，循环泵4频率控制在35Hz，利用陶瓷膜过滤50m3发酵液，可以在240分钟之内得到约40m3的清液用于下一工序，大大提高了生产效率。
在同等的培养条件下，循环后第二批丙酸杆菌菌体的发酵培养时间比第一批发酵培养时间缩短了30％，循环后第三批丙酸杆菌菌体的发酵培养时间比第一批发酵培养时间缩短了50％，一轮的丙酸杆菌的发酵可以循环一个月以上。
对比例一
本实施例与实施例一基本相同，不同之处在于：步骤(1)中，随着发酵罐中发酵的进行，根据发酵液pH值的变化，当发酵液pH值低于5.0时，流加浓度为20％的碳酸钙水溶液，保持发酵液pH值维持在5.0-6.5之间。
采用对比例一的丙酸杆菌的循环发酵方法，与实施例一相比，陶瓷膜的通透性变差，发酵液的循环过滤效率降低。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种丙酸杆菌的循环发酵方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）培养好的丙酸杆菌菌体进入含有培养基的发酵罐中进行发酵，获得发酵液；
（2）将步骤（1）中的发酵液进行陶瓷膜循环过滤，过滤获得含有丙酸的发酵液清液，将含有丙酸杆菌的菌体浓缩液送至发酵罐中，添加新鲜培养基进行发酵；
（3）循环步骤（2），直至菌体的产酸速度明显下降时，停止循环；
（4）重复步骤（1）-（3），开始新一轮的丙酸杆菌的循环发酵；
步骤（2）中，陶瓷膜循环过滤包括以下步骤：发酵液先由发酵罐进入暂存罐，然后通过供料泵送至陶瓷膜，最后启动循环泵，使发酵液在暂存罐和陶瓷膜之间循环；
步骤（2）中，发酵液进行陶瓷膜循环过滤获得初级菌体浓缩液，初级菌体浓缩液的体积为发酵液总体积的24-26%，向初级菌体浓缩液中加入等体积的无菌纯水，然后继续进行陶瓷膜循环过滤获得二级菌体浓缩液，二级菌体浓缩液的体积与初级菌体浓缩液的体积相同，将二级菌体浓缩液送至发酵罐中，补入新鲜培养基，二级菌体浓缩液与新鲜培养基的体积比为1:2.5-3.5；
步骤（1）中发酵罐的培养基：碳酸钙10-20g/L，酵母浸粉10-20g/L，葡萄糖30-50g/L，pH值自然；随着发酵罐中发酵的进行，根据发酵液pH值的变化流加浓度为20%的氢氧化钙水溶液，保持发酵液pH值维持在5.0-6.5之间，发酵罐罐温控制在29~33℃，压力0.02~0.05Mpa，搅拌速度50~80rpm。
2.根据权利要求1所述的一种丙酸杆菌的循环发酵方法，其特征在于：步骤（3）中，当产酸速度低于5g/L/天时，停止循环。
3.根据权利要求1所述的一种丙酸杆菌的循环发酵方法，其特征在于：暂存罐的罐压控制在0.03-0.05MPa，供料泵频率控制在45Hz，循环泵频率控制在35Hz。
4.根据权利要求1所述的一种丙酸杆菌的循环发酵方法，其特征在于：步骤（1）丙酸杆菌菌体进入发酵罐前，先由孢子培养成菌种，菌种经种子罐扩大培养；菌种的培养基：乳酸钙5-10g/L，酵母浸粉8-15g/L，葡萄糖50-80g/L，pH值自然，温度控制在29~33℃；种子罐的培养基：碳酸钙10-20g/L，酵母浸粉10-20g/L，葡萄糖30-50g/L，PH自然，温度控制在29~33℃，压力0.02~0.05Mpa，搅拌速度50~80rpm。
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