CN105385713A - 一种菌体循环利用的葡萄糖酸钠发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明具体涉及一种菌体循环利用的葡萄糖酸钠发酵方法。该菌体循环利用的葡萄糖酸钠发酵方法，包括以下步骤：发酵结束所得的发酵液通过陶瓷膜过滤，过滤清液进入提取工序，菌体浓缩液部分回流至发酵罐，然后加入新鲜培养基进行发酵，按此方法进行菌体循环利用发酵，当发酵速度明显下降时停止循环，再进行新一轮发酵。本发明采用陶瓷膜过滤在无菌条件下进行发酵液的菌体回收，并再用于发酵，减少了菌种培养工序，使生产过程中种子液培养量降低75%，废弃菌体排放量减少50%，减少了灭菌蒸汽消耗和菌体生长的原料消耗，提高了设备利用率和生产效率，降低了生产成本。
Description
（一）技术领域
本发明属于生物化工领域，具体涉及一种菌体循环利用的葡萄糖酸钠发酵方法。
（二）背景技术
葡萄糖酸钠是一种多羟基羧酸钠，又名：五羟基已酸钠，分子式为C6H11O7Na，分子量为218.14，是一种白色或淡黄色结晶粉末，易溶于水，微溶于醇，不溶于醚。葡萄糖酸钠是一种应用极为广泛的多羟基有机酸盐，在食品、医药、轻工、化工等行业具有广泛的应用：在食品行业可用作营养增补剂、食品保鲜剂、品质改良剂、缓冲剂和低盐（无盐）食品；在医药行业可用作酸碱平衡剂；葡萄糖酸钠具有良好的螯合性和缓蚀阻垢作用，被广泛应用于表面清洗剂和水质稳定剂；葡萄糖酸钠能增加混凝土的可塑性、强度和耐久性，作为减水剂、缓凝剂广泛应用于建筑行业；另外葡萄糖酸钠也是制备葡萄糖酸内酯、葡萄糖酸盐（锌、铜、亚铁盐）等的基础原料。
葡萄糖酸钠的生产方法主要有催化氧化法和微生物发酵法。催化氧化法是以葡萄糖为原料，以贵金属作为催化剂（如：Pd-C、Pt-C、Pd-AL2O3等），催化氧化葡萄糖产生葡萄糖酸，加入NaOH中和生成葡萄糖酸钠，存在生产成本高、反应条件苛刻、存有副反应、环境污染等缺点；微生物发酵法生产葡萄糖酸钠是以糖质为原料，经微生物转化生成葡萄糖酸，发酵过程中流加NaOH溶液中和得到葡萄糖酸钠，该方法具有条件温和、工艺路线简洁环保、产品成本低等优势，是目前葡萄糖酸钠的主要生产方法。
发酵法生产葡萄糖酸钠的原理是在微生物体内葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的催化作用下，葡萄糖经一步反应转化生成葡萄糖酸，发酵速度快、周期较短，一般为28-32小时。在工业化生产过程中发酵法生产葡萄糖酸钠普遍采用的是三级批次发酵技术：首先是在一级种子罐内将生产菌种黑曲霉孢子培养成为成熟的菌丝体（培养18-22小时），作为一级种子液，再将成熟的一级种子液转入二级种子罐进行二次扩大培养（8-12小时），成熟后的二级种子液接入发酵罐进行三级发酵，每级接种量均为10-20%，发酵结束后发酵液经板框过滤除菌、浓缩、结晶获得葡萄糖酸钠产品。因此在实际生产过程中，种子液的扩大培养占据了大量生产时间和工作量，每生产一批需要进行一批两级菌种扩培（需要培养种子液约0.6m3/吨产品），同时发酵结束后产生一批菌丝体固体废弃物（约100㎏/吨产品），存在着菌种培养工作量大、灭菌蒸汽消耗量大、生产效率低、固体废渣排量大等不足，另外，废弃菌丝体含水量50-60%、粗蛋白含量10-20%，易腐败变质、污染环境，给生产带来染菌隐患，其存放和有效处理是一个难点。随着葡萄糖酸钠发酵生产的发展，如何解决以上问题已成为生产企业节能减排、降低生产成本、提高市场竞争力的瓶颈问题。近年来有关发酵法生产葡萄糖酸钠的研究主要集中于高产菌株选育、发酵条件优化和废弃菌体资源化利用方面，针对葡萄糖酸钠发酵生产工艺改进的研究较少。发明专利CN102517347B、CN104152499A公开了一种葡萄糖酸钠发酵方法，其方法为：（1）向种子罐（发酵罐）内接入黑曲霉孢子液，培养成为成熟的种子液。（2）将培养液20-50%放出，同时补充相同体积的新鲜培养基，保温培养4.5-6小时。（3）循环进行步骤（2），可循环6-9次。该方法是在种子液培养成熟后放出部分培养液作为种子液（或是用发酵前期的发酵液作为种子液）接入发酵罐进行发酵，同时向罐内补充相同体积的新鲜培养基进行再培养，培养成熟后再转入其他发酵罐进行发酵，按此方法循环多次可实现种子液的半连续培养，可降低种子罐灭菌次数，但并没有消减种子液培养环节和减少菌体生长所需能源消耗、菌体废弃物的排放量。本发明人在研究过程中发现，葡萄糖酸钠发酵结束后菌体仍具有较高发酵活力，经与产品分离后能直接回用于发酵罐进行发酵，既能显著减少菌体培养环节和降低菌体生长所需能源消耗、废弃菌体排放量，又能有效缩短发酵周期。
（三）发明内容
本发明的目的是提供一种菌体循环利用的葡萄糖酸钠发酵方法，该方法在无菌条件下进行发酵液的菌体回收，并再用于发酵，减少了菌种培养工序，大大降低了废弃菌体排放量，缩短了发酵周期。
本发明是通过如下技术方案实现的：
一种菌体循环利用的葡萄糖酸钠发酵方法，其特殊之处在于：包括以下步骤：
发酵结束所得的发酵液通过陶瓷膜过滤，过滤清液进入提取工序，菌体浓缩液部分回流至发酵罐，然后加入新鲜培养基进行发酵，按此方法进行菌体循环利用发酵，当发酵速度明显下降时停止循环，再进行新一轮发酵。
本发明的菌体循环利用的葡萄糖酸钠发酵方法，包括以下步骤：
（1）菌种扩大培养：一级种子罐培养基灭菌后接入黑曲霉麸曲孢子菌种，培养至成熟，按10-20%接入灭菌后的二级种子罐进行二级扩大培养；
（2）发酵：发酵罐（Ⅰ）装入灭菌后培养基，并按10-20%接种量接入步骤（1）中培养成熟的种子液进行发酵，直至葡萄糖耗尽发酵结束；
（3）菌体浓缩回收：采用孔径为100-200nm的陶瓷膜对发酵液进行过滤，含葡萄糖酸钠的过滤清液进入提取工序，当菌体浓缩液体积至总发酵液体积的10-20%时停止过滤，将40-60%的菌体浓缩液泵送至含有新鲜培养基的发酵罐（Ⅱ）内进行葡萄糖酸钠发酵，剩余的菌体浓缩液经板框过滤除菌后进入提取工序；
（4）菌体循环利用发酵：循环步骤（3），当发酵速度下降10-15%时，中止循环，菌体浓缩液全部经板框过滤除菌后进入提取工序；
（5）重复步骤（1）-（4）：开始新一轮菌体循环利用葡萄糖酸钠发酵。
上述步骤（1）中，种子培养基：葡萄糖150-180g/L，硫酸铵0.2-0.6g/L，磷酸氢二钾0.1-0.5g/L，硝酸铵0.1-0.3g/L，硫酸镁0.1-0.3g/L，种子培养控制条件：培养温度36.0-37.0℃，溶解氧浓度10-20%，pH值=6.0-6.5，种子罐压力0.05-0.15MPa。
优选：
上述步骤（1）的种子培养基：葡萄糖160g/L，硫酸铵0.4g/L，磷酸氢二钾0.3g/L，硝酸铵0.2g/L，硫酸镁0.2g/L。
上述步骤（1）的种子培养控制条件：培养温度36.5℃，溶解氧浓度15%，pH值=6.3，种子罐压力0.1MPa。
上述步骤（2）中，发酵培养基：葡萄糖270-300g/L，硫酸铵0.2-0.6g/L，磷酸氢二钾0.1-0.5g/L，硝酸铵0.1-0.3g/L，硫酸镁0.1-0.3g/L，发酵过程控制条件：发酵温度37.0-37.5℃，溶解氧浓度20-30%，pH值=5.5-6.0，发酵罐压力0.05-0.15MPa。
优选：
上述步骤（2）的发酵培养基：葡萄糖280g/L，硫酸铵0.4g/L，磷酸氢二钾0.3g/L，硝酸铵0.2g/L，硫酸镁0.2g/L。
上述步骤（2）的发酵过程控制条件：发酵温度37.3℃，溶解氧浓度25%，pH值=5.7，发酵罐压力0.1MPa。
本发明的有益效果：本发明采用陶瓷膜过滤代替传统工艺的板框过滤除菌，在无菌条件下进行发酵液的菌体回收，含葡萄糖酸钠的过滤清液直接进入提取工序，与传统工艺相比减少板框过滤除菌负荷70-80%。回收的菌体接入新鲜培养基直接进行发酵，减少了菌体培养环节，缩短发酵周期4-6小时，与传统工艺相比显著消减了菌种培养量和减少了废弃菌体排放量，每吨成品的种子液培养量由0.6m3下降至0.15m3吨，相应地每吨成品的废弃菌体排放量由100㎏减少为50㎏，有效减少了灭菌蒸汽消耗、菌体生长原料消耗和废弃菌体排放量，显著提高了设备利用率和生产效率，降低了生产成本。
（四）具体实施方式
实施例1
一级种子罐装料2L，灭菌后接入2g黑曲霉麸曲孢子菌种，培养成熟后转入装有20L培养基的二级种子罐进行二级扩大培养（接种量为10%），培养成熟后转入装有110L培养基的发酵罐内进行发酵（接种量为20%）。发酵过程中流加碱液中和产生的葡萄糖酸生产葡萄糖酸钠，发酵结束发酵液体积为160L，发酵周期28小时。采用孔径为200nm的陶瓷膜进行过滤回收菌丝体，过滤清液进入提取工序，当菌丝体浓缩液浓缩至16L（占总发酵液体积的10%）时，停止过滤，将6.4L菌体浓缩液（占总量的40%）泵送至另一台装有125L新鲜培养基的发酵罐内进行发酵，整个菌体回收利用过程在密闭、无菌条件下完成。剩余的9.6L菌体浓缩液经板框过滤除菌后进入提取工序。按照该方法进行菌体循环利用发酵共计7罐次，发酵周期分别为：22.5小时、22小时、23小时、25小时、26.5小时、27小时、28.5小时，第7批发酵速度较前6批平均发酵速度下降了15%，中止循环，菌体浓缩液全部经板框过滤除菌后进入提取工序。
上述步骤（1）的种子培养基：葡萄糖150g/L，硫酸铵0.4g/L，磷酸氢二钾0.3g/L，硝酸铵0.2g/L，硫酸镁0.2g/L。
上述步骤（1）的种子培养控制条件：培养温度36.5℃，溶解氧浓度10-20%，pH值=6.0-6.5，种子罐压力0.1MPa。
上述步骤（2）的发酵培养基：葡萄糖280g/L，硫酸铵0.4g/L，磷酸氢二钾0.3g/L，硝酸铵0.2g/L，硫酸镁0.2g/L。
上述步骤（2）的发酵过程控制条件：发酵温度37.2℃，溶解氧浓度20-30%，pH值=5.5-6.0，发酵罐压力0.1MPa。
实施例2
一级种子罐装料2L，灭菌后接入2g黑曲霉麸曲孢子菌种，培养成熟后转入装有10L培养基的二级种子罐进行二级扩大培养（接种量为20%），培养成熟后转入装有120L培养基的发酵罐内进行发酵（接种量为10%）。发酵过程中流加碱液中和产生的葡萄糖酸生产葡萄糖酸钠，发酵结束发酵液体积160L，发酵周期27小时，采用孔径为100nm的陶瓷膜进行过滤回收菌丝体，过滤清液进入提取工序，当菌丝体浓缩液浓缩至32L（占总发酵液体积的20%）时，停止过滤，将19L菌体浓缩液（占总量的60%）泵送至另一台装有110L新鲜培养基的发酵罐内进行发酵，整个菌体回收利用过程在密闭、无菌条件下完成。剩余的13L菌体浓缩液经板框过滤除菌后进入提取工序。按照该方法进行菌体循环利用发酵共计8罐次，发酵周期分别为：22.5小时、21.5小时、24小时、24.5小时、24小时、25.5小时、26小时、27小时，第8批发酵速度较前7批平均发酵速度下降了11%，中止循环，菌体浓缩液全部经板框过滤除菌后进入提取工序。
上述步骤（1）的种子培养基：葡萄糖150g/L，硫酸铵0.4g/L，磷酸氢二钾0.3g/L，硝酸铵0.2g/L，硫酸镁0.2g/L。
上述步骤（1）的种子培养控制条件：培养温度36.6℃，溶解氧浓度10-20%，pH值=6.0-6.5，种子罐压力0.1MPa。
上述步骤（2）的发酵培养基：葡萄糖300g/L，硫酸铵0.4g/L，磷酸氢二钾0.3g/L，硝酸铵0.2g/L，硫酸镁0.2g/L。
上述步骤（2）的发酵过程控制条件：发酵温度37.3℃，溶解氧浓度20-30%，pH值=5.5-6.0，发酵罐压力0.1MPa。
实施例3
一级种子罐装料3L，灭菌后接入3g黑曲霉麸曲孢子菌种，培养成熟后转入装有20L培养基的二级种子罐进行二级扩大培养（接种量为15%），培养成熟后转入装有150L培养基的发酵罐内进行发酵（接种量为15%）。发酵结束放罐体积188L，发酵周期27小时，采用孔径为150nm的陶瓷膜进行过滤回收菌丝体，当菌丝体浓缩液浓缩至28L（占总发酵液体积的15%）时，停止过滤，将14L菌体浓缩液（占总量的50%）泵送至另一台装有160L新鲜培养基的发酵罐内进行发酵，整个菌体回收利用过程在密闭、无菌条件下完成。剩余的11L菌体浓缩液经板框过滤除菌后进入提取工序。按照该方法进行菌体循环利用发酵共计7罐次，发酵周期分别为：24小时、23小时、24小时、25小时、25.5小时、27小时、30小时，第7批发酵速度较前6批平均发酵速度下降了15%，中止循环，菌体浓缩液全部经板框过滤除菌后进入提取工序。
上述步骤（1）的种子培养基：葡萄糖150g/L，硫酸铵0.4g/L，磷酸氢二钾0.3g/L，硝酸铵0.2g/L，硫酸镁0.2g/L。
上述步骤（1）的种子培养控制条件：培养温度36.5℃，溶解氧浓度10-15%，pH值=6.0-6.5，种子罐压力0.1MPa。
上述步骤（2）的发酵培养基：葡萄糖300g/L，硫酸铵0.4g/L，磷酸氢二钾0.3g/L，硝酸铵0.2g/L，硫酸镁0.2g/L。
上述步骤（2）的发酵过程控制条件：发酵温度37.3℃，溶解氧浓度20-25%，pH值=5.5-6.0，发酵罐压力0.1MPa。
实施例4
一级种子罐装料3L，灭菌后接入2.5g黑曲霉麸曲孢子菌种，培养成熟后转入装有15L培养基的二级种子罐进行二级扩大培养（接种量为20%），培养成熟后转入装有120L培养基的发酵罐内进行发酵（接种量为15%）。发酵过程中流加碱液中和产生的葡萄糖酸生产葡萄糖酸钠，发酵结束发酵液体积168L，发酵周期28.5小时，采用孔径为100nm的陶瓷膜进行过滤回收菌丝体，过滤清液进入提取工序，当菌丝体浓缩液浓缩至33L（占总发酵液体积的20%）时，停止过滤，将20L菌体浓缩液（占总量的60%）泵送至另一台装有120L新鲜培养基的发酵罐内进行发酵，整个菌体回收利用过程在密闭、无菌条件下完成。剩余的13L菌体浓缩液经板框过滤除菌后进入提取工序。按照该方法进行菌体循环利用发酵共计8罐次，发酵周期分别为：21小时、23小时、21小时、22小时、23小时、21.5小时、24小时、26小时，第8批发酵速度较前7批平均发酵速度下降了15%，中止循环，菌体浓缩液全部经板框过滤除菌后进入提取工序。
上述步骤（1）中，种子培养基：葡萄糖150/L，硫酸铵0.2g/L，磷酸氢二钾0.4g/L，硝酸铵0.3g/L，硫酸镁0.1g/L，种子培养控制条件：培养温度36.5℃，溶解氧浓度15-20%，pH值=6.0-6.5，种子罐压力0.05MPa。
上述步骤（2）中，发酵培养基：葡萄糖270g/L，硫酸铵0.2g/L，磷酸氢二钾0.4g/L，硝酸铵0.3g/L，硫酸镁0.1g/L，发酵过程控制条件：发酵温度37.5℃，溶解氧浓度20-25%，pH值=5.5-6.0，发酵罐压力0.05MPa。
实施例5
一级种子罐装料3L，灭菌后接入3g黑曲霉麸曲孢子菌种，培养成熟后转入装有15L培养基的二级种子罐进行二级扩大培养（接种量为20%），培养成熟后转入装有120L培养基的发酵罐内进行发酵（接种量为15%）。发酵过程中流加碱液中和产生的葡萄糖酸生产葡萄糖酸钠，发酵结束发酵液体积168L，发酵周期26小时，采用孔径为100nm的陶瓷膜进行过滤回收菌丝体，过滤清液进入提取工序，当菌丝体浓缩液浓缩至33L（占总发酵液体积的20%）时，停止过滤，将20L菌体浓缩液（占总量的60%）泵送至另一台装有120L新鲜培养基的发酵罐内进行发酵，整个菌体回收利用过程在密闭、无菌条件下完成。剩余的13L菌体浓缩液经板框过滤除菌后进入提取工序。按照该方法进行菌体循环利用发酵共计8罐次，发酵周期分别为：20小时、22小时、23小时、21小时、24小时、25.5小时、25小时、27小时，第8批发酵速度较前7批平均发酵速度下降了15%，中止循环，菌体浓缩液全部经板框过滤除菌后进入提取工序。
上述步骤（1）中，种子培养基：葡萄糖180g/L，硫酸铵0.6g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硝酸铵0.1g/L，硫酸镁0.3g/L，种子培养控制条件：培养温度36.6℃，溶解氧浓度20%，pH值=6.0-6.5，种子罐压力0.15MPa。
上述步骤（2）中，发酵培养基：葡萄糖300g/L，硫酸铵0.6g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硝酸铵0.1g/L，硫酸镁0.3g/L，发酵过程控制条件：发酵温度37.0℃，溶解氧浓度30%，pH值=5.5-6.0，发酵罐压力0.15MPa。
实施例6
一级种子罐装料0.6m3，灭菌后接入55g黑曲霉麸曲孢子菌种，培养成熟后转入装有3m3培养基的二级种子罐进行二级扩大培养（接种量为20%），培养成熟后转入装有20m3培养基的发酵罐内进行发酵（接种量为15%）。发酵过程中流加碱液中和产生的葡萄糖酸生产葡萄糖酸钠，发酵结束发酵液体积30m3，发酵周期27小时，采用孔径为100nm的陶瓷膜进行过滤回收菌丝体，过滤清液进入提取工序，当菌丝体浓缩液浓缩至6m3（占总发酵液体积的20%）时，停止过滤，将3.6m3菌体浓缩液（占总量的60%）泵送至另一台装有20m3新鲜培养基的发酵罐内进行发酵，整个菌体回收利用过程在密闭、无菌条件下完成。剩余的2.4m3菌体浓缩液经板框过滤除菌后进入提取工序。按照该方法进行菌体循环利用发酵共计6罐次，发酵周期分别为：20小时、21.5小时、24小时、24.5小时、24小时、26小时，第6批发酵速度较前5批平均发酵速度下降了12%，中止循环，菌体浓缩液全部经板框过滤除菌后进入提取工序。
上述步骤（1）中，种子培养基：葡萄糖165g/L，硫酸铵0.4g/L，磷酸氢二钾0.2g/L，硝酸铵0.3g/L，硫酸镁0.3g/L，种子培养控制条件：培养温度36.5-37.0℃，溶解氧浓度10-15%，pH值=6.5，种子罐压力0.1MPa。
上述步骤（2）中，发酵培养基：葡萄糖285g/L，硫酸铵0.4g/L，磷酸氢二钾0.2g/L，硝酸铵0.3g/L，硫酸镁0.3g/L，发酵过程控制条件：发酵温度37.5℃，溶解氧浓度20-25%，pH值=5.7，发酵罐压力0.08MPa。
实施例7
一级种子罐装料0.4m3，灭菌后接入50g黑曲霉麸曲孢子菌种，培养成熟后转入装有4.0m3培养基的二级种子罐进行二级扩大培养（接种量为10%），培养成熟后转入装有20m3培养基的发酵罐内进行发酵（接种量为20%）。发酵过程中流加碱液中和产生的葡萄糖酸生产葡萄糖酸钠，发酵结束发酵液体积为30m3，发酵周期26.5小时。采用孔径为200nm的陶瓷膜进行过滤回收菌丝体，过滤清液进入提取工序，当菌丝体浓缩液浓缩至3m3（占总发酵液体积的10%）时，停止过滤，将1.5m3菌体浓缩液（占总量的50%）泵送至另一台装有23m3新鲜培养基的发酵罐内进行发酵，整个菌体回收利用过程在密闭、无菌条件下完成。剩余的1.5m3菌体浓缩液经板框过滤除菌后进入提取工序。按照该方法进行菌体循环利用发酵共计7罐次，发酵周期分别为：21小时、22.5小时、23小时、22小时、24小时、25小时、27小时，第7批发酵速度较前6批平均发酵速度下降了15%，中止循环，菌体浓缩液全部经板框过滤除菌后进入提取工序。
上述步骤（1）的种子培养基：葡萄糖150g/L，硫酸铵0.4g/L，磷酸氢二钾0.3g/L，硝酸铵0.2g/L，硫酸镁0.2g/L。
上述步骤（1）的种子培养控制条件：培养温度36.0-37.0℃，溶解氧浓度10-20%，pH值=6.0-6.5，种子罐压力0.1MPa。
上述步骤（2）的发酵培养基：葡萄糖270g/L，硫酸铵0.4g/L，磷酸氢二钾0.3g/L，硝酸铵0.2g/L，硫酸镁0.2g/L。
上述步骤（2）的发酵过程控制条件：发酵温度37.0-37.5℃，溶解氧浓度20-30%，pH值=5.5-6.0，发酵罐压力0.1MPa。
实施例8
一级种子罐装料4.0m3，灭菌后接入580g黑曲霉麸曲孢子菌种，培养成熟后转入装有30m3培养基的二级种子罐进行二级扩大培养（接种量为13%），培养成熟后转入装有220m3培养基的发酵罐内进行发酵（接种量为15%）。发酵过程中流加碱液中和产生的葡萄糖酸生产葡萄糖酸钠，发酵结束发酵液体积为315m3，发酵周期28小时。采用孔径为100nm的陶瓷膜进行过滤回收菌丝体，过滤清液进入提取工序，当菌丝体浓缩液浓缩至31.5m3（占总发酵液体积的10%）时，停止过滤，将14.5m3菌体浓缩液（占总量的46%）泵送至另一台装有240m3新鲜培养基的发酵罐内进行发酵，整个菌体回收利用过程在密闭、无菌条件下完成。剩余的17m3菌体浓缩液经板框过滤除菌后进入提取工序。按照该方法进行菌体循环利用发酵共计7罐次，发酵周期分别为：23小时、22小时、23小时、25小时、26.5小时、26小时、28小时，第7批发酵速度较前6批平均发酵速度下降了13%，中止循环，菌体浓缩液全部经板框过滤除菌后进入提取工序。
上述步骤（1）的种子培养基：葡萄糖180g/L，硫酸铵0.4g/L，磷酸氢二钾0.3g/L，硝酸铵0.2g/L，硫酸镁0.2g/L。
上述步骤（1）的种子培养控制条件：培养温度36.0-37.0℃，溶解氧浓度10-20%，pH值=6.0-6.5，种子罐压力0.1MPa。
上述步骤（2）的发酵培养基：葡萄糖300g/L，硫酸铵0.4g/L，磷酸氢二钾0.3g/L，硝酸铵0.2g/L，硫酸镁0.2g/L。
上述步骤（2）的发酵过程控制条件：发酵温度37.0-37.5℃，溶解氧浓度20-30%，pH值=5.5-6.0，发酵罐压力0.1MPa。
实施例9
一级种子罐装料3.0m3，灭菌后接入570g黑曲霉麸曲孢子菌种，培养成熟后转入装有30m3培养基的二级种子罐进行二级扩大培养（接种量为10%），培养成熟后转入装有220m3培养基的发酵罐内进行发酵（接种量为15%）。发酵过程中流加碱液中和产生的葡萄糖酸生产葡萄糖酸钠，发酵结束发酵液体积为315m3，发酵周期28小时。采用孔径为200nm的陶瓷膜进行过滤回收菌丝体，过滤清液进入提取工序，当菌丝体浓缩液浓缩至31.5m3（占总发酵液体积的10%）时，停止过滤，将12.5m3菌体浓缩液（占总量的40%）泵送至另一台装有240m3新鲜培养基的发酵罐内进行发酵，整个菌体回收利用过程在密闭、无菌条件下完成。剩余的19m3菌体浓缩液经板框过滤除菌后进入提取工序。按照该方法进行菌体循环利用发酵共计7罐次，发酵周期分别为：22.5小时、22小时、23小时、26.5小时、25小时、27小时、28.5小时，第7批发酵速度较前6批平均发酵速度下降了15%，中止循环，菌体浓缩液全部经板框过滤除菌后进入提取工序。
上述步骤（1）的种子培养基：葡萄糖165g/L，硫酸铵0.4g/L，磷酸氢二钾0.3g/L，硝酸铵0.2g/L，硫酸镁0.2g/L。
上述步骤（1）的种子培养控制条件：培养温度36.0-37.0℃，溶解氧浓度10-20%，pH值=6.0-6.5，种子罐压力0.1MPa。
上述步骤（2）的发酵培养基：葡萄糖285g/L，硫酸铵0.4g/L，磷酸氢二钾0.3g/L，硝酸铵0.2g/L，硫酸镁0.2g/L。
上述步骤（2）的发酵过程控制条件：发酵温度37.0-37.5℃，溶解氧浓度20-30%，pH值=5.5-6.0，发酵罐压力0.1MPa。
实施例10
一级种子罐装料5.0m3，灭菌后接入650g黑曲霉麸曲孢子菌种，培养成熟后转入装有30m3培养基的二级种子罐进行二级扩大培养（接种量为17%），培养成熟后转入装有220m3培养基的发酵罐内进行发酵（接种量为15%），并加入L-半胱氨酸和硫酸锌，使发酵培养基中L-半胱氨酸和硫酸锌的浓度分别为0.03g/L和0.3g/L。发酵结束放料体积为312m3，发酵周期23小时，采用孔径为200nm的陶瓷膜进行过滤回收菌丝体，过滤清液进入提取工序，当菌丝体浓缩液浓缩至40m3（占总发酵液体积的13%）时，停止过滤，将20m3菌体浓缩液（占总量的50%）泵送至另一台装有230m3新鲜培养基的发酵罐内进行发酵，同时加入L-半胱氨酸和硫酸锌，使发酵培养基中L-半胱氨酸和硫酸锌的浓度分别为0.02g/L和0.2g/L。整个菌体回收利用过程在密闭、无菌条件下完成。剩余的20m3菌体浓缩液经板框过滤除菌后进入提取工序。按照该方法进行菌体循环利用发酵共计9罐次，发酵周期分别为：18小时、20小时、19小时、21小时、22小时、21小时、20.5小时、22小时、23.5小时，第9批发酵速度较前8批平均发酵速度下降了13%，中止循环，菌体浓缩液全部经板框过滤除菌后进入提取工序。
上述步骤（1）的种子培养基：葡萄糖150-180g/L，硫酸铵0.4g/L，磷酸氢二钾0.3g/L，硝酸铵0.2g/L，硫酸镁0.2g/L。
上述步骤（1）的种子培养控制条件：培养温度36.0-37.0℃，溶解氧浓度10-20%，pH值=6.0-6.5，种子罐压力0.1MPa。
上述步骤（2）的发酵培养基：葡萄糖270-300g/L，硫酸铵0.4g/L，磷酸氢二钾0.3g/L，硝酸铵0.2g/L，硫酸镁0.2g/L。
上述步骤（2）的发酵过程控制条件：发酵温度37.0-37.5℃，溶解氧浓度20-30%，pH值=5.5-6.0，发酵罐压力0.1MPa。
本发明采用陶瓷膜过滤在无菌条件下进行发酵液的菌体回收，并再用于发酵，减少了菌种培养工序，使生产过程中种子液培养量降低75%，废弃菌体排放量减少50%，减少了灭菌蒸汽消耗和菌体生长的原料消耗，提高了设备利用率和生产效率，降低了生产成本。
Claims (5)
1.一种菌体循环利用的葡萄糖酸钠发酵方法，其特征在于：包括以下步骤：
发酵结束所得的发酵液通过陶瓷膜过滤，过滤清液进入提取工序，菌体浓缩液部分回流至发酵罐，然后加入新鲜培养基进行发酵，按此方法进行菌体循环利用发酵，当发酵速度明显下降时停止循环，再进行新一轮发酵。
2.根据权利要求1所述的菌体循环利用的葡萄糖酸钠发酵方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）发酵：发酵罐（Ⅰ）装入灭菌后培养基，接入培养成熟的种子液进行发酵，直至葡萄糖耗尽发酵结束；
（2）菌体浓缩：采用孔径为100-200nm的陶瓷膜对发酵液进行过滤，过滤清液进入提取工序，当菌体浓缩液体积至总发酵液体积的10-20%时停止过滤，将40-60%的菌体浓缩液泵送至含有新鲜培养基的发酵罐（Ⅱ）内进行葡萄糖酸钠发酵，剩余的菌体浓缩液经板框过滤除菌后进入提取工序；
（3）菌体循环利用发酵：循环步骤（2），当发酵速度下降10-15%时，中止循环，菌体浓缩液全部经板框过滤除菌后进入提取工序；
（4）重复步骤（1）-（3）：开始新一轮菌体循环利用葡萄糖酸钠发酵。
3.根据权利要求2所述的菌体循环利用的葡萄糖酸钠发酵方法，其特征在于：步骤（1）发酵之前，先经菌种扩大培养，所述菌种扩大培养为：一级种子罐培养基灭菌后接入黑曲霉麸曲孢子菌种，培养至成熟，按10-20%接入灭菌后的二级种子罐进行二级扩大培养。
4.根据权利要求2所述的菌体循环利用的葡萄糖酸钠的发酵方法，其特征在于：上述步骤（1）中，种子培养基：葡萄糖150-180g/L，硫酸铵0.2-0.6g/L，磷酸氢二钾0.1-0.5g/L，硝酸铵0.1-0.3g/L，硫酸镁0.1-0.3g/L，种子培养控制条件：培养温度36.0-37.0℃，溶解氧浓度10-20%，pH值=6.0-6.5，种子罐压力0.05-0.15MPa。
5.根据权利要求2所述的菌体循环利用的葡萄糖酸钠的发酵方法，其特征在于：上述步骤（2）中，发酵培养基：葡萄糖270-300g/L，硫酸铵0.2-0.6g/L，磷酸氢二钾0.1-0.5g/L，硝酸铵0.1-0.3g/L，硫酸镁0.1-0.3g/L，发酵过程控制条件：发酵温度37.0-37.5℃，溶解氧浓度20-30%，pH值=5.5-6.0，发酵罐压力0.05-0.15MPa。
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