CN114891835B - 一种高产葡萄糖酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高产葡萄糖酸的方法，以葡萄糖为底物，采用持续补充底物方式进行好氧发酵生产葡萄糖酸，其中以氧化葡萄糖酸杆菌为发酵菌株，控制pH在4.5‑5.5之间，并在发酵开始之后定时添加过碳酸钠，定时回收菌体循环进入发酵体系，发酵24h后葡萄酸累积浓度不低于400g/L，单位体积产率不低于15g/L/h。本发明利用氧化酸杆菌生物转化制备葡萄糖酸，单位体积生产效率高，终产量高，且菌体可重复利用实现了葡萄糖酸连续化生产。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种高产葡萄糖酸的方法。
背景技术
葡萄糖酸是一种目前已广泛应用于建筑、食品、医药等领域的多羟基一元羧酸。目前，葡萄糖酸工业生产方法主要生物酶法以及微生物发酵法。酶法虽然选择性高，但酶的成本高且不能回收再利用。微生物法采用可回收的菌种，相对成本更低，且更容易控制。因此，目前工业上葡萄糖酸生产主要以微生物发酵法为主。目前，葡萄糖酸发酵法主要采用黑曲霉为生产菌株，但产率一般不超过20g/L/h，产量不超过200g/L。因此，需要进一步提高葡萄糖酸及其盐的生产效率及产量，并降低生产与纯化成本。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种高产葡萄糖酸的方法，进一步提高葡萄糖酸的生产效率与最终产量。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种高产葡萄糖酸的方法，以葡萄糖为底物，采用持续补充底物方式进行好氧发酵生产葡萄糖酸；以氧化葡萄糖酸杆菌为发酵菌株，控制pH在4.5-5.5之间，并在发酵开始之后定时添加过碳酸钠，定时回收菌体循环进入发酵体系，发酵24h后葡萄酸累积浓度不低于500g/L。
所述的高产葡萄糖酸的方法，初始底物葡萄糖浓度100～600g/L。
所述的高产葡萄糖酸的方法，通入纯氧气并调节发酵罐出气口控制罐压在0.01-0.1MPa。
所述的高产葡萄糖酸的方法，搅拌转速250～550r/min，调节温度并控制恒定在25～30℃。
所述的高产葡萄糖酸的方法，初始菌体的浓度为0.5～2.5g/L。
所述的高产葡萄糖酸的方法，经发酵12～24h，菌体生长进入稳定期停止发酵。
所述的高产葡萄糖酸的方法，待发酵过程中pH自然下降并低于5.5后通过自动添加碱液控制反应体系pH在4.5-5.5。
所述的高产葡萄糖酸的方法，发酵菌体生长进入稳定期后停止反应，回收菌体再发酵，并控制在发酵的初始菌体的浓度(干重)为1～4g/L。
有益效果：与现有技术相比，本发明的优势在于：本发明利用氧化酸杆菌生物转化制备葡萄糖酸，经发酵12～24h，菌体生长进入稳定期停止发酵，葡萄酸累积浓度不低于500g/L以上，终产量高达2600g/L，且菌体可重复利用实现了葡萄糖酸连续化生产，具有很好的工业化前景。
附图说明
图1是氧化葡萄糖酸杆菌发酵连续化生产葡萄糖酸的工艺简图；
图2是实施例5的发酵生产葡萄糖酸历程图；
图3是实施例6的发酵生产葡萄糖酸历程图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
以下实施例中采用高效阴离子交换色谱分析样品中葡萄糖和葡萄糖酸的含量，色谱条件：美国赛默飞ICS5000型离子色谱，配置CarboPacTM PA 10(2mm×250mm)色谱柱，PAD积分安培检测器，柱温30℃，进样体积10μL；以18mmol/L氢氧化钠与200mmol/L的氢氧化钠为流动相进行二元梯度淋洗，流速0.3mL/min。
实施例1
如图1所示，在3L的生物反应罐中，加入1.5L葡萄糖液，初始葡萄糖浓度为100g/L，维持反应体系温度30℃、搅拌转速500r/min、通入空气(通气量3vvm)，接入氧化葡萄糖酸杆菌细胞2.5g(干重)进行全细胞催化，使用50％的氢氧化钠维持反应体系pH在5.5。发酵过程中采用半连续添料操作方式，每次添加100g葡萄糖(基于反应液体积)，控制反应体系葡萄糖浓度不低于15g/L。反应过程中每小时从发酵罐取样2mL，所取样品通过高效阴离子交换色谱分析其中葡萄糖和葡萄糖酸的含量。发酵24h，葡萄糖酸浓度约为230g/L，单位体积生产速率9.6g/L/h。
实施例2
如图1所示，在3L的生物反应罐中，加入1.5L葡萄糖液，初始葡萄糖浓度为100g/L，维持反应体系温度30℃、搅拌转速500r/min、通入纯氧并封闭罐体控制罐压在0.03MPa，接入氧化葡萄糖酸杆菌细胞2g(干重)进行全细胞催化，使用50％的氢氧化钠维持反应体系pH在5.5。发酵过程中采用半连续添料操作方式，每次添加100g葡萄糖(基于反应液体积)，控制反应体系葡萄糖浓度不低于15g/L。反应过程中每小时从发酵罐取样2mL，所取样品通过高效阴离子交换色谱分析其中葡萄糖和葡萄糖酸的含量。发酵12h，葡萄糖酸浓度约为280g/L，单位体积生产速率23.3g/L/h。
实施例3
如图1所示，在3L的生物反应罐中，加入1.5L葡萄糖液，初始葡萄糖浓度为100g/L，维持反应体系温度30℃、搅拌转速500r/min、通入纯氧并封闭罐体控制罐压在0.025MPa，接入氧化葡萄糖酸杆菌细胞1.5g(干重)进行全细胞催化，使用50％的氢氧化钠维持反应体系pH在5.5。发酵过程中采用半连续添料操作方式，每次添加100g葡萄糖(基于反应液体积)，控制反应体系葡萄糖浓度不低于15g/L。反应过程中每小时从发酵罐取样2mL，所取样品通过高效阴离子交换色谱分析其中葡萄糖和葡萄糖酸的含量。发酵24h，葡萄糖酸浓度约为400g/L，单位体积生产速率16.6g/L/h。
实施例4
如图1所示，在3L的生物反应罐中，加入1.5L葡萄糖液，初始葡萄糖浓度为100g/L，维持反应体系温度30℃、搅拌转速500r/min、通入纯氧并封闭罐体控制罐压在0.03MPa，接入氧化葡萄糖酸杆菌细胞2g(干重)进行全细胞催化，使用50％的氢氧化钠维持反应体系pH在5.5。发酵过程中采用半连续添料操作方式，每次添加100g葡萄糖(基于反应液体积)，控制反应体系葡萄糖浓度不低于15g/L。反应过程中每小时从发酵罐取样2mL，所取样品通过高效阴离子交换色谱分析其中葡萄糖和葡萄糖酸的含量。发酵48h，葡萄糖酸浓度约为480g/L，单位体积生产速率10.0g/L/h。
实施例5
如图1所示，在3L的生物反应罐中，加入1.5L葡萄糖液，初始葡萄糖浓度为100g/L，维持反应体系温度30℃、搅拌转速500r/min、通入纯氧并封闭罐体控制罐压在0.025MPa，接入氧化葡萄糖酸杆菌细胞1.5g(干重)进行全细胞催化，使用50％的氢氧化钠维持反应体系pH在5.5。发酵过程中采用半连续添料操作方式，每次添加100g葡萄糖(基于反应液体积)，控制反应体系葡萄糖浓度不低于15g/L。发酵12h后每小时加入5g/L过碳酸钠，累积发酵24h。反应过程中每小时从发酵罐取样2mL，所取样品通过高效阴离子交换色谱分析其中葡萄糖和葡萄糖酸的含量。发酵24h，葡萄糖酸浓度约为550g/L(图2)，单位体积生产速率22.9g/L/h。
实施例6
如图1所示，在3L的生物反应罐中，加入1.0L葡萄糖液，初始葡萄糖浓度为100g/L，维持反应体系温度30℃、搅拌转速500r/min、通入纯氧并封闭罐体控制罐压在0.02MPa，接入氧化葡萄糖酸杆菌细胞2.0g(干重)进行全细胞催化，使用50％的氢氧化钠维持反应体系pH在5.0。发酵过程中采用半连续添料操作方式，每次添加100g葡萄糖(基于反应液体积)，控制反应体系葡萄糖浓度不低于10g/L。发酵12h后每小时加入5g/L过碳酸钠，发酵24h后停止反应，采用离心(在5000g条件下，离心10min)分离菌体与葡萄糖酸发酵液，将菌体接入新的葡萄糖液，在相同条件下培养，共回收四次菌体，完成总计五次发酵，反应时间总计120h。当反应过程中每小时从发酵罐取样2mL，所取样品通过高效阴离子交换色谱分析其中葡萄糖和葡萄糖酸的含量。
基于1L发酵体系，经过四轮回收五次发酵实现葡萄糖酸累积浓度约为2600g/L(图3)。
本发明采用氧化葡萄酸杆菌为催化菌种，通过溶解氧调控措施，以实现葡萄糖的高效生物氧化为葡萄糖酸；并通过连续或半连续补加葡萄糖，催化反应24h产品葡萄糖酸最高浓度可以超过500g/L，达到本领域最高水平。
Claims (6)
1.一种高产葡萄糖酸的方法，以葡萄糖为底物，采用持续补充底物方式进行好氧发酵生产葡萄糖酸，其特征在于，以氧化葡萄糖酸杆菌为发酵菌株，控制pH在4.5-5.5之间，并在发酵12h后每小时加入5g/L过碳酸钠，发酵24h后停止反应，回收菌体循环进入新的发酵体系使用，发酵24h后葡萄酸累积浓度不低于500g/L；初始底物葡萄糖浓度100～600g/L。
2.根据权利要求1所述的高产葡萄糖酸的方法，其特征在于，通入纯氧气并调节发酵罐出气口控制罐压在0.01-0.1MPa。
3.根据权利要求1所述的高产葡萄糖酸的方法，其特征在于，搅拌转速250～550r/min，调节温度并控制恒定在25～30℃。
4.根据权利要求1所述的高产葡萄糖酸的方法，其特征在于，初始菌体的浓度为0.5～2.5g/L。
5.根据权利要求1所述的高产葡萄糖酸的方法，其特征在于，待发酵过程中pH自然下降并低于5.5后通过自动添加碱液控制反应体系pH在4.5-5.5。
6.根据权利要求1所述的高产葡萄糖酸的方法，其特征在于，发酵菌体生长进入稳定期后停止反应，回收菌体再发酵，并控制在发酵初始菌体的浓度为1～4g/L。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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