CN102021214A - 基于氧消耗速率的维生素b12发酵生产控制工艺 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于氧消耗速率的维生素B12发酵生产控制工艺。具体地，本发明提供了一种生产维生素B12的发酵方法，包括步骤：(a)在发酵过程前期维持发酵体系的高水平的氧消耗速率，从而促进菌体生长和维生素B12合成的启动；(b)在发酵过程的中后期降低并维持发酵体系的低水平的氧消耗速度；和(c)从发酵液中分离纯化出维生素B12。本发明方法可明显提高维生素B12产率，降低底物消耗，同时降低单位能耗，可大幅降低生产成本，具有工艺控制简单、可操作性强、节约能源等特点。

Description

基于氧消耗速率的维生素B12发酵生产控制工艺

技术领域

本发明涉及发酵领域，更具体地涉及一种优化的脱氮假单胞菌发酵生产维生素B12方法以及相关的操作控制工艺。

背景技术

维生素B₁₂是一种结构非常复杂的分子，根据与其中心钴离子结合配基基团的不同可形成羟钴胺素、甲基钴胺素、脱氧腺苷钴胺素和氰钴胺素^[1]。

维生素B₁₂的化学结构如图5所示。

维生素B12是一种生物催化活性物质，是哺乳动物不可缺少的维生素，能够预防和治疗恶性贫血症，维护神经系统的健康，促进碳水化合物、脂肪和蛋白质的代谢^[2]。

现在国内和国外商品化的维生素B₁₂几乎都是通过微生物发酵来生产的。能够合成维生素B₁₂的微生物根据其耗氧情况分为两类：(1)厌氧菌或间性厌氧菌如：费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)^[3]、谢氏丙酸杆菌(Propionibacterium shermanii)^[4]和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)等。(2)好氧菌：比如脱氮假单胞杆菌(Pseudomonas denitrificans)^[5]，钴胺素根瘤菌^[6](Rhizobium cobalaminogenum FERM BP-4429)等。

供氧对微生物的生长和产物形成有着重要的影响。对于耗氧微生物发酵过程中，必须供给适量的无菌空气，菌体才能繁殖和积累所需代谢产物。不同菌种及不同发酵阶段的菌体的需氧量是不同的，发酵液的供氧能力的大小直接影响微生物的酶的活性、代谢途径及产物产量。因此研究供氧大小对发酵的影响及控制对提高生产效率，改善产品质量等都有重要意义。一般的耗氧发酵过程均控制较高的供氧以避免氧限制的发生，在这种情况下可以以溶解氧浓度(Dissolved Oxygen，简称DO)来表征供氧水平^[7]，通过控制搅拌转速和空气流量可以有效的控制DO，但对于某些特殊的高耗氧菌种来说，溶氧可能不能成为有效的控制指标，这就需要寻找另外的能有效表征供氧水平的参数。

目前，维生素B12需求量较大，因此优化生产工艺、提高维生素B12的生产水平成为当务之急。本领域迫切需要开发高效的生产维生素B12的方法，不仅要提高维生素B12的产量，而且尽可能的节约能耗、降低成本，提高生产效率，以满足市场的需求。

发明内容

本发明的目的就是提供一种高效的生产维生素B12的方法。

在本发明的第一方面，提供了一种生产维生素B12的发酵方法，它包括步骤：

(a)在适合发酵的条件下，培养维生素B12的生产菌株，并且在发酵过程前期维持发酵体系的高水平的氧消耗速率，从而促进菌体生长和维生素B12合成的启动，其中所述的发酵过程前期是指从发酵开始起至菌株进入生长稳定期；

(b)在发酵过程的中后期降低并维持发酵体系的低水平的氧消耗速度，从而维持高水平的维生素B12的产物合成速率，从而产生维生素B12，其中所述的发酵过程中后期是指从发酵过程前期结束起至发酵结束；和

(c)从发酵液中分离纯化出维生素B12。

在另一优选例中，一旦菌体的生长进入生长稳定期，就可视为发酵过程前期结束。

在另一优选例中，在步骤(b)中，氧消耗速度的降低是间歇式降低、连续下降或逐步降低。

在另一优选例中，在步骤(a)中高水平的氧消耗速率是控制氧消耗速率为35-45mmol·L^-1·h^-1。

在另一优选例中，在步骤(b)中低水平的氧消耗速率是控制氧消耗速率为12-25mmol·L^-1·h^-1，更佳地15-20mmol·L^-1·h^-1范围。

在另一优选例中，所述的氧消耗速率按以下公式计算：

式中，F_in为进气流量L/min；V发酵液体积L；C_惰in\C_O2in\C_CO2in：分别为进气中惰性气体、氧气及二氧化碳的质量分率；C_O2out\C_CO2out：分别为排气中氧及二氧化碳的质量分率；

$f=\frac{273}{273+t_{\mathrm{in}}}\·P_{\mathrm{in}}\·\frac{1}{1+h}\×{10}^{-5}$

式中，P_in是进气的绝对压强Pa；t_in是进气的温度℃；h是进气的相对湿度％。

在另一优选例中，所述的高水平的维生素B12的产物合成速率是≥1.5mg-L^-1·h^-1，通常在1.5-5.0mg·L^-1·h^-1范围，更佳地为在1.6-4.0mg·L^{- 1}·h^-1范围。

在另一优选例中，所述方法还包括：通过控制检测发酵体系的尾气计算出所述的氧消耗速率，从而调节供氧实现所需的氧消耗速率。

在另一优选例中，所述的方法还包括：在发酵过程的中后期，降低发酵体系中的搅拌速度。

在另一优选例中，所述方法还包括：控制以下参数：罐温32±0.5℃，和/或罐压0.05～0.06Mpa。

在另一优选例中，所述的发酵体系的体积为5L至200立方米，较佳地为50L至150立方米。

在另一优选例中，所述的工程菌是费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)、谢氏丙酸杆菌(Propionibacterium shermanii)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、脱氮假单胞杆菌(Pseudomonas denitrificans)或钴胺素根瘤菌。

在另一优选例中，优选的工程菌是脱氮假单胞杆菌(Pseudomonas denitrifieans)。

在另一优选例中，所述方法还包括：在培养基中添加可溶性无机钾盐(包括氯化钾、磷酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、乙酸钾、硫酸钾)，这些无机钾盐被用作发酵生产维生素B12的促进剂。

在本发明的第二方面，提供了一种维生素B12发酵生产方法，其中在发酵过程中，当生产维生素B12的工程菌菌体生长进入生长稳定期时或之后(通常为从发酵开始的40-72小时后)，控制发酵体系的氧消耗速率，使得氧消耗速率小于或等于25mmol·L^-1·h^-1，从而维持维生素B12的生产速率大于或等于1.5mg·L^-1·h^-1。

在另一优选例中，在当生产维生素B12的工程菌菌体生长进入生长稳定期时，开始控制控制发酵体系的氧消耗速率，使得氧消耗速率处于为12-25mmol·L^-1·h^-1，更佳地15-20mmol·L^-1·h^-1范围。

在另一优选例中，所述的工程菌是费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)、谢氏丙酸杆菌(Propionibacterium shermanii)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、脱氮假单胞杆菌(Pseudomonas denitrificans)或钴胺素根瘤菌。

在另一优选例中，优选的工程菌是脱氮假单胞杆菌(Pseudomonas denitrificans)。

在另一优选例中，所述方法还包括：在培养基中添加可溶性无机钾盐(包括氯化钾、磷酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、乙酸钾、硫酸钾)，这些无机钾盐被用作发酵生产维生素B12的促进剂。

在本发明的第三方面，提供了一种提高维生素B12生产速率和/或降低糖消耗的方法，所述方法包括步骤：在维生素B12的生产菌株发酵产生维生素B12的期间，控制发酵体系的氧消耗速率，使得氧消耗速率小于或等于25mmol·L^-1·h^-1(较佳地，12-25mmol·L^-1·h^-1，更佳地15-20mmol·L^-1·h^-1范围)。

在另一优选例中，在所述的受控的氧消耗速率下，所述的维生素B12生产菌株的维生素B12的生产速率大于或等于1.5mg·L^-1·h^-1，通常在1.5-5.0mg·L^-1·h^-1范围，更佳地为在1.6-4.0mg·L^-1·h^-1范围。

应理解，上述的以及本文下文中所详述的任二个或多个技术特征都可相互组合，以构成新的技术方案。在此申请中，为了节省篇幅，不再一一列出。

附图说明

图1显示了维生素B12发酵过程中OUR、CER、DO、菌浓(■)、搅拌转速、空气流量随时间的变化。

图2显示了不同搅拌转速下，OUR、菌浓、VB12浓度、产率、残糖浓度及补糖速率随时间的变化。

图3显示了利用优化的阶段供氧控制策略发酵生产维生素B12过程中各参数的变化。

图4显示了利用优化的阶段供氧控制策略在工业规模发酵生产维生素B12过程中各参数的变化。

图5显示了维生素B12结构式。

具体实施方式

本发明人通过深入而广泛的研究，意外地发现在维生素B12的发酵生产过程中，通过控制氧消耗速率，可以大幅提高维生素B12的产量，同时降低底物消耗和单位能耗。在此基础上完成了本发明。

具体地，本发明提供了一种以OUR为控制变量、利用脱氮假单胞菌发酵生产维生素B12的控制工艺。以OUR为控制参数，采用了分阶段的供氧控制策略，发酵过程前期维持高供氧以促进菌体生长和VB12合成的启动，中后期间歇式降低、连续下降或逐步降低供氧以维持高的产物合成速率，该控制工艺可明显提高维生素B12产率，同时降低单位能耗，极大的降低了生产成本，具有工艺控制简单、可操作性强、节约能源等特点，有利于进一步工业化放大及推广应用。

氧消耗速率的控制

本发明人首次提出了以氧消耗速率OUR为控制变量进行分阶段供氧的控制策略。本发明的试验表明，在发酵过程的前期维持较高的供氧以促进菌体的快速增长和VB12合成的快速启动，发酵过程的中后期通过降低转速来降低供氧以控制菌体的呼吸代谢，可以维持较高的比生产速率和底物转化率。

具体地，本发明提供了一种生产维生素B12的发酵方法，它包括步骤：

(a)在发酵过程前期维持发酵体系的高水平的氧消耗速率，从而促进菌体生长和维生素B12合成的启动，其中所述的发酵过程前期是指从发酵开始起至菌株进入生长稳定期；

(b)在发酵过程的中后期降低并维持发酵体系的低水平的氧消耗速度，从而维持高水平的维生素B12的产物合成速率，从而产生维生素B12，其中所述的发酵过程中后期是指从发酵过程前期结束起至发酵结束；

(c)从发酵液中分离纯化出维生素B12。

如本文所用，术语“发酵初期”、“发酵过程前期”和“发酵前期”可互换使用，都指从发酵开始起至菌株进入生长稳定期为止的一段发酵期间。通常，菌体进入生长稳定期的时间在36-72小时之间，故所述的发酵过程前期是从发酵开始起至菌体进入生长稳定期为止，换言之，如果进入生长稳定期为40小时，则所述的发酵过程前期为自发酵起的0-40小时；如果如果进入生长稳定期为40小时，则所述的发酵过程前期为自发酵起的0-72小时。应理解，受发酵条件、生产菌株等因素的影响，菌体进入生长稳定期的时间会略有不同。

如本文所用，术语“稳定期”和“生长稳定期”可互换使用。在发酵过程前期，随着菌体的生长，其OD值会上升(处于上升期)，当进入生长稳定期时，其OD值基本保持不变(处于平台期)。一旦进入生长稳定期，就可视为发酵过程前期结束。

确定进入生长稳定期的方法是本领域中已知的。一种常规的方法是测定发酵液的OD值。例如，每2-4小时测定一次OD值(如每3小时测定一次)，如果连续三个时间点OD值不变或基本不变(例如，各OD值≤(100％±5％)×OD平均值)，则可视为菌体生长进入生长稳定期。

如本文所用，术语“发酵过程中后期”是指从发酵过程前期结束起至发酵结束的一段时间。换言之，发酵过程中后期是从菌体生长进入生长稳定期开始至发酵结束。

就维生素B12的发酵而言，整个发酵过程通常为约6-8天。因菌体进入生长稳定期的时间在36-72小时之间，故发酵过程前期为0至36-72小时，之后为发酵过程中后期。

在本发明中，就氧消耗速率的控制而言，应在发酵中后期的全部或部分时间内(通常至少50％以上，较佳地60％以上，较佳地70％以上，较佳地80％以上，最佳地90％以上的中后期时间内)，控制氧消耗速率小于或等于25mmol·L^{- 1}·h^-1(较佳地，12-25mmol·L^-1·h^-1，更佳地15-20mmol·L^-1·h^-1范围)。

在本发明中，虽然对于发酵前期的氧消耗速率可以不加控制，然而为了促进菌体生长和维生素B12合成的启动，宜提供高水平的氧消耗速率，即控制氧消耗速率为35-50mmol·L^-1·h^-1，较佳地为35-45mmol·L^-1·h^-1。

生产菌株

适用于本发明方法的表达维生素B12的菌株没有特别限制，可以是现有的生产维生素B12的工程菌，也可用常规方法改造或诱变的工程菌。代表性的工程菌包括(但并不限于)：厌氧菌或间性厌氧菌如：费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)、谢氏丙酸杆菌(Propionibacterium shermanii)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)；以及好氧的脱氮假单胞杆菌(Pseudomonas denitrificans)，钴胺素根瘤菌^[6](Rhizobium cobalaminogenum FERM BP-4429)等。一种优选的工程菌是脱氮假单胞杆菌(Pseudomonas denitrificans)。

在获得了表达维生素B12的工程菌后，便可在常规的适合表达维生素B12的条件下培养，以表达维生素B12。

培养基

用于本发明的培养基没有特别限制，可以是各种常规的培养基。例如对于脱氮假单胞菌而已，可以选用(但并不限于)：培养基1(g/L)：蔗糖80，玉米浆45，甜菜碱14，(NH₄)₂SO₄ 1，CoCl₂·6H₂O 0.075，MgO 0.5，DMBI0.05，ZnSO₄·7H₂O 0.08，CaCO₃ 1，pH 7.2-7.4；培养基2(g/L)：葡萄糖55g，玉米浆35g(干物)，硫酸铵5g，磷酸二氢钠8g，氯化钻0.01g，调pH 6.8-7.0；或低盐发酵培养基等。

当然，为了用于有利于维生素B12的发酵，可以在培养基中添加一定浓度的钾盐，以便使得使用时钾离子的浓度处于合适的范围。当然，也可使用一般的培养基，然后在发酵过程中添加或补加钾离子源，从而将发酵体系中的氧消耗速率控制在合适的范围。

另外，还在培养基中添加一定浓度的葡萄糖和/或磷酸氢二铵，以便使得使用时葡萄糖和/或磷酸氢二铵的浓度处于合适的范围。当然，也可使用一般的培养基，然后在发酵过程中补加或添加葡萄糖和/或磷酸氢二铵，从而将发酵体系中的葡萄糖和/或磷酸氢二铵浓度控制在合适的范围。

分离纯化

在本发明中，对于发酵生产的维生素B12，可以用常规方法进行纯化，随后制成药剂。一种优选方法是对发酵样品用常规方法酸化后进行离心、过滤等方式去除菌体，获得含维生素B12的发酵清液。然后，对发酵清液通过盐析、超滤等方法进行初步纯化后再进行层析纯化，也可直接进行离子层析纯化。

在本发明的一个实施例中，在50L规模发酵罐上采用优化后的阶段供氧控制策略，其144小时VB12的浓度为162mg·L^-1，比恒转速(350rpm、300rpm和250rpm)的三种情况下的产量分别提高了65％、28％和11％，整个过程中维持了较高的产率；VB12生成对葡萄糖的得率系数为3.20mg·g^-1，明显高于未控制氧消耗速率的恒转速时的转化率。在120吨的发酵罐也获得了类似的结果。

本发明的主要优点在于：

(a)通过简单有效的控制方法(控制氧消耗速率)，可以极其有效地提高维生素B12的产量。

(b)本发明方法可有效降低单位能耗，极大的降低了生产成本，具有工艺控制简单、可操作性强、节约能源等特点，有利于进一步工业化放大及推广应用。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非特别说明，所有的百分比和份数按重量计算。

实施例1

1材料与方法

1.1菌种和培养基

菌种：脱氮假单胞菌(购自石家庄华荣制药集团)

种子培养基(g/L)：蔗糖 40，玉米浆 20，甜菜碱 5，(NH₄)₂SO₄ 1，(NH₄)₂HPO₄ 2，MnSO₄·H₂O 0.8，CoCl₂·6H₂O 0.02，MgO 0.3，DMBI 0.01，ZnSO₄·7H₂O 0.01，pH 7.2-7.4

发酵培养基(g/L)：蔗糖 80，玉米浆 45，甜菜碱 14，(NH₄)₂SO₄ 1，KH₂PO₄ 0.75，CoCl₂·6H₂O 0.075，MgO 0.5，DMBI 0.05，ZnSO₄·7H₂O0.08，CaCO₃ 1，pH 7.2-7.4

补料培养基1(g/L)：葡萄糖 500，DMBI 0.15，CoCl₂·6H₂O 0.15，pH自然

补料培养基2(g/L)：甜菜碱 30，DMBI 0.4，CoCl₂·6H₂O 0.3，pH6.2-6.5。

1.2试剂和仪器

试剂：玉米浆(华北制药康欣有限公司)，甜菜碱(华荣制药有限公司)，蔗糖(上海糖业有限公司)，其他试剂均为国产分析纯。

仪器：722型紫外一可见分光光度计；HPLC 1100(Agilent公司)；尾气质谱分析仪：美国Extrel过程质谱MAX300-LG；50L发酵罐：上海国强生化装备有限责任公司；发酵控制系统：国佳生化工程中心NCBbiostar发酵控制系统。

1.3培养方法

菌悬液制备：用无菌水洗涤培养好的斜面，制成菌浓为10⁸个细胞每毫升的菌悬液。

母瓶种子培养：将制好的菌悬液接种2ml到母瓶培养基中，装量100ml/500ml，32℃，转速260rpm，培养20-22小时。

50L发酵罐培养：将培养好后镜检无菌的母瓶种子液1250ml并瓶到无菌的2L三角瓶中，火焰保护接种到装有25培养基的发酵罐中，培养条件为二级搅拌浆，32℃，通气量20L/min，发酵过程中根据菌体生长情况开始连续补加葡萄糖和甜菜碱料液培养基。

120吨发酵罐培养：采用三级发酵：8支斜面的菌体悬浮液接种于装量为80L/100L一级种子罐的一级种子培养基中，在罐温32±0.5℃，罐压0.05～0.06MPa，空气流量2～2.5m³/hr，搅拌转速100rpm下，培养至菌体吸光值(OD700)为9～10左右，再将一级种子接入装量为5m³/9m³二级种子罐的二级种子培养基中，在罐温32±0.5℃，罐压0.05～0.06MPa，空气流量90～100m³/hr，搅拌转速130rpm下，培养至菌体吸光值(OD700)为9～10左右；最后将二级种子罐中的种子液移入装量为75m³/120m³发酵罐的发酵培养基中，在罐温32±0.5℃，罐压0.05～0.06MPa，空气流量800～1600m³/hr，搅拌转速60-78rpm下培养168h左右。发酵过程中根据菌体生长情况开始连续补加葡萄糖和甜菜碱料液培养基。

1.4测定方法

总糖和还原糖测定：采用改进了的DNS法。

生物量测定：①光密度测定：将发酵液稀释100倍后于波长700nm处、以去离子水为对照进行比色测定，OD值为吸光度×100。②菌体干重(DCW)测定，取发酵液25ml，4000rpm离心15分钟，将菌体沉淀用超纯水洗涤并加稀盐酸除去沉淀的碳酸钙，离心后将菌体洗涤2次后，于115度烘箱内烤干称重，计算菌体含量。

铵离子测定：利用苯酚一次氯酸盐反应测定^[8]

维生素B12含量测定：样品制备：取10mL发酵液，加入8％亚硝酸钠溶液和冰醋酸各2.5mL，摇匀，于95-100℃水浴30min；水浴后冷却至室温，稀释过滤后用高压液相谱进行含量分析，高效液相色谱条件：流动相为250mmol/L醋酸钠水溶液和乙腈进行梯度洗脱；色谱柱为backman C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；检测波长为361nm；进样量是20μL；流速为1.0mL/min，保留时间为9.2分钟。

pH在线测定：采用Mettler Toledo耐高温电极进行在线测定。

溶氧测定：采用Mettler Toledo耐高温电极进行在线测定。

进气和尾气中氧和二氧化碳的测定：采用Extrel过程质谱MAX300-LG对发酵过程中的进气和尾气进行实时在线采集分析。

氧消耗速率OUR和二氧化碳生成速率CER测定：

OUR和CER的计算通过对发酵尾气的分析数据计算得到。以进气和尾气中惰性气体N₂维持恒定建立平衡方程，求得OUR和CER的计算公式如下：

$f=\frac{273}{273+t_{\mathrm{in}}}\·P_{\mathrm{in}}\·\frac{1}{1+h}\×{10}^{-5}$

F_in进气流量L/min；V发酵液体积L；C_惰in\C_O2in\C_CO2in：分别为进气中惰性气体、氧气及二氧化碳的质量分率C_O2out\C_CO2out：分别为排气中氧及二氧化碳的质量分率；P_in：进气的绝对压强Pa，t_in：进气的温度℃，h：进气的相对湿度％。

比耗氧速率

比二氧化碳释放率

$Q_{O_2}=\frac{\mathrm{OUR}}{X}$ $Q_{{\mathrm{CO}}_2}=\frac{\mathrm{CER}}{X}$

式中X——菌体干重，g/L。

呼吸商(RQ)的计算：

$\mathrm{RQ}=\frac{\mathrm{CER}}{\mathrm{OUR}}=\frac{Q_{{\mathrm{CO}}_2}}{Q_{O_2}}$

2结果与讨论

2.1维生素B12发酵生产过程分析

在现行维生素B12的补料批次培养工艺中，往往采用的发酵控制策略是通过补加葡萄糖控制残糖浓度在3-4％，在该浓度下菌体生长不受底物限制。图1反映了发酵过程中搅拌转速和流量的调整对应于OUR、CER和DO的变化情况。发酵前期随着菌体的增长，OUR、CER缓慢增加，表示菌体耗氧量逐渐增加；溶氧16小时左右降到2-6％左右，OUR和CER的增长进入稳定阶段，但菌体还处在指数生长期，菌体量还在增长，说明菌体已经达到了其最大的呼吸强度，供氧已成为限制性因素。

一般的耗氧发酵过程均控制较高的供氧以避免氧限制的发生，在这种情况下可以以溶解氧浓度(Dissolved Oxygen，简称DO)来表征供氧水平，通过提高搅拌转速和空气流量可以有效的提高DO。但脱氮假单胞菌发酵生产维生素B12的过程中，在菌体生长期的18、24、28、36和53小时转速的升高和降低调整，并没有引起溶氧的改变，而OUR和CER随着供氧的增加和降低出现了急剧的增加和降落，响应时间小于1分钟；在菌体进入生长稳定期后，发酵开始大量合成维生素B12，在合成期的72、94和112小时的转速和流量的调整也同样引起了OUR和CER的迅速改变，而溶氧几乎不受影响，一直维持在2％的水平，这种现象说明菌体可能处于极度的氧限制状态。在这种氧处于限制条件下的发酵过程中，供氧能力的变化，对菌体的呼吸代谢特性有着显著的影响。

发酵过程中溶解氧浓度的变化是供氧速率(Oxygen Transfer Rate，简称OTR)和氧消耗速率(Oxygen Uptake Rate，简称OUR)之间的一个动态平衡，根据溶解氧的物质守恒原理，该VB12发酵系统的供氧和耗氧模型为：

$\frac{\mathrm{dC}}{\mathrm{dt}}=\mathrm{OTR}-\mathrm{OUR}=K_{L}a(C^{*}-C)-\mathrm{OUR}=K_{L}a(C^{*}-C)-\mathrm{Qo}2*X$

式中C为液相主流中氧的液相浓度；C^*为与气相氧分压平衡的液相溶解氧浓度，kLa为以(C^*-C)为推动力的体积氧传递系数。

由于发酵过程中碳源充足，菌体耗氧能量较大，而且该菌又有很强的呼吸特性，因此虽然提高了供氧速率，但耗氧速率也迅速同步增加，这样发酵过程中溶氧浓度几乎没有变化。若溶氧DO值没有较大幅度的波动，可作出拟稳态的假设，此时dC/dt≈0。根据拟稳态的假设有：OTR≈OUR^{[9，10，11]}。

OTR是最直接的表示供氧水平的参数，但目前已报道的OTR测定方法均存在较大的误差，且无法在线检测。那么根据拟稳态假设，可以以OUR的值表示OTR水平，通过控制OUR来控制供氧水平。

2.250L发酵罐中不同供氧程度对发酵代谢的影响

表1  不同搅拌转速下的发酵情况

*即菌体生长进入生长稳定期的时间

本发明人在50升的发酵罐中考察了不同氧传递速率对维生素B12发酵的影响。图2反映了不同搅拌转速下，维生素B12发酵过程中OUR、菌浓、VB12浓度以及产率、残糖浓度以及补糖速率的变化情况。

在发酵过程的菌体生长期，溶氧水平都在16-19小时左右降到最低，从图2a可以看出，OUR随着菌体生长和溶氧的降低而上升，在搅拌转速为350rpm情况下OUR在25小时快速升高到39.04mmol·L^-1·h^-1，在搅拌转速为300rpm情况下在25小时升高到26.58mmol·L^-1·h^-1，在搅拌转速为250rpm情况下要到27小时进入OUR增长稳定期，为18.74mmol·L^-1·h^-1。OUR的增长保持稳定后菌体的生长才刚刚进入对数生长期。

从图2b可以看出，在不同的供氧条件下菌体的生长速率存在明显差别，在供氧较高(350rpm)情况下菌体的最大比生长速率为0.101h^-1，46小时进入生长稳定期菌体浓度达到了30.5g·L^-1，同时，随着发酵过程的进行菌体浓度不断增加；而在较低供氧(250rpm)情况下菌体的最大比生长速率为0.075h^{- 1}，65小时进入生长稳定期菌体浓度达到了30.15g·L^-1，随着发酵过程的进行菌体浓度几乎维持稳定，最大比生长速率比高供氧时的最大比生长速率低了25％，可以看出较高的供氧能明显促进菌体的生长；从图2c可以看出，糖的消耗随着菌体的快速增长而迅速下降，从统计得到的生长阶段菌体得率系数来看，随着供氧速率的增加，菌体对底物的得率系数有所降低。

从图2d可以看出，搅拌转速为250、300和350rpm情况下，发酵144小时VB12的产量分别为146、127和98mg·L^-1，由过程的产率变化图2e可以明显看出，在合成的前期，高供氧情况下产率较高，但随着发酵过程的进行，低供氧的产物合成速率明显增加，并明显高于高供氧的产物合成速率，当转速为250rpm时的供氧情况下，其最大合成速率能达到300rpm时的最高水平，同时能够维持较高的合成速率，明显有利于VB12的合成。

从图2f可以看出，高供氧条件下补糖时间明显提前，耗糖速率随着供氧的增加而显著增加，350rpm时的合成阶段耗糖量比250rpm时高出了84％，但VB12的合成并没有随着耗糖量的增加而增加，由表1统计的结果可以看出，低供氧情况下VB12生成对葡萄糖的得率系数为2.87mg·g^-1，比高供氧的1.13mg·g^-1的得率系数高出154％，产物合成阶段随着供氧的增加消耗葡萄糖生成二氧化碳的量也逐渐增加，说明高供氧使得更大比例的底物葡萄糖通过能量代谢生成了二氧化碳。而且在高供氧情况下菌体生长速率明显增加，从而使得单位菌体合成VB12的速率也明显降低。

结论：高供氧能明显促进菌体生长很快和维生素B12合成的启动，但会同时增大糖耗速率，也会导致产物合成速率的下降；在供氧较低的情况下，菌体的摄氧率和二氧化碳的生成速率也比较低，发酵合成中后期的能维持较高的产率，转化率明显高于高供氧条件下的转化率。

2.3以OUR为控制变量的分阶段供氧策略

根据上面不同供氧状况下的维生素B12的发酵过程参数的变化情况，因此在VB12的发酵过程中，应该采取分阶段的供氧控制策略来调控发酵过程，转速的改变对供氧有着显著的影响，尤其是在产物合成期，影响着菌体的摄氧率OUR和二氧化碳生成速率，菌体的形态和VB12的合成速率，因此发酵过程的菌体生长阶段和前期的合成阶段采取高供氧，促进菌体的快速生长和VB12合成的快速启动，当菌体生长进入生长稳定期后，分阶段降低供氧以维持较高的VB12比生产速率，降低对底物葡萄糖的消耗；这种分阶段的供氧模式改变必将得到最佳的生产菌生理特性状态，降低VB12生产的成本。

图3a和3b显示了利用优化的阶段供氧控制策略发酵生产维生素B12过程中采集到的DO，OUR和CER等的实时过程变化曲线，发酵过程前期随着菌体量的不断增加，OUR和CER迅速增加，18小时溶氧水平降到2.1％，OUR和CER迅速增加到28.1mmol·L^-1·h^-1和27.6mmol·L^-1·h^-1，菌体量只有7.6g·L^-1，发酵过程已经进入了氧限制阶段，44小时菌体生长进入生长稳定期，溶氧又继续降到1.3％，OUR和CER却缓慢增长到40.68mmol·L^-1·h^-1和39.2mmol·L^-1·h^-1，底物糖浓度也随着菌体的增长而迅速从80g·L^-1降到22g·L^-1，菌体对底物的得率系数为0.516gDCW/g葡萄糖，整个过程进行了两次降速调整，62小时将转速从350rpm降到300rpm，OUR和CER迅速降到30.76mmol·L^-1·h^-1和28.73mmol·L^-1·h^-1，分别下降了24.3％和26.7％，90小时将转速进一步从300rpm降到250rpm，OUR和CER同时迅速从24.6mmol·L^-1·h^-1和22.2mmol·L^-1·h^-1降低到17.1mmol·L^-1·h^-1和14.2mmol·L^-1·h^-1分别下降了44.4％和50％，发酵周期186小时的维生素B12的产量为192mg·L^-1，发酵162小时后产率有所下降这可能与发酵培养基中营养物质的缺乏和产物对合成的抑制有关。

由图3d与不同转速的恒定发酵过程情况相比，采用优化后的阶段供氧控制策略，其144小时VB12的浓度为162mg·L^-1，比恒转速(350rpm、300rpm和250rpm)的三种情况下的产量分别增加了65％、28％和11％，整个过程中维持了较高的产率；VB12生成对葡萄糖的得率系数为3.20mg·g^-1，明显高于恒转速时的转化率；从胞内VB12合成前体5-氨基乙酰丙酸(ALA)的含量变化可以看出(见图3c)，在优化的供氧策略(OOS)情况下，菌体内的ALA的含量明显高于其它各组，整个过程中维持着较高的ALA含量，说明在整个过程中保持着较高的VB12合成速率。

综合以上分析，本发明人认为采用分阶段的供氧调控策略，能明显促进菌体的生长速率，缩短生长周期，使得维生素B12的合成提前启动，整个过程中不仅维持较高的合成速率，而且降低了糖耗速率，缩减了生产成本。

3结论

维生素B12发酵是一个耗氧生产过程，供氧的变化对菌体的呼吸代谢和产物的合成有着重要影响。本发明人在50L发酵罐中考察了高、中、低三种不同的供氧水平对发酵的影响，实验表明，高供氧条件能促进菌体的快速增长和VB12的起始合成，低供氧情况能明显促进和维持中后期VB12的合成速率和转化率，同时，由于整个发酵过程中溶氧一直处于限制状态，可以认为OUR＝OTR，OUR的实时变化可以表征OTR水平。

因此本发明人提出以OUR为控制变量进行分阶段供氧的控制策略，前期维持较高的供氧以促进菌体的快速增长和VB12合成的快速启动，过程的中后期通过降低转速来降低供氧以控制菌体的呼吸代谢，来维持较高的比生产速率和底物转化率。

在50L规模发酵罐上采用优化后的阶段供氧控制策略，其144小时VB12的浓度为162mg·L^-1，比恒转速(350rpm、300rpm和250rpm)的三种情况下的产量分别提高了65％、28％和11％，整个过程中维持了较高的产率；VB12生成对葡萄糖的得率系数为3.20mg·g^-1，明显高于恒转速时的转化率。

综上所述，应用优化的控制策略，不仅提高了VB12产率，而且降低了生产成本，同时，搅拌转速和空气流量的降低有效的降低了能耗，节约了能源。因此，该控制策略有着提高生产效益和节能减排的双方面意义，值得进一步工业化放大和推广应用。

表2  50L规模发酵罐上实验情况

^****：维生素B12的产物合成速率是约1.7mg·L^-1·h^-1

实施例2  优化的控制策略在工业化规模的放大

现行120m³发酵规模生产工艺中，在初始的15小时内，由于菌体生长缓慢，无需太大的供氧，故维持搅拌转速为78rpm，空气流量为900m³/h，如图4a所示；随着菌体生长，需氧量的增大，在16小时左右，将搅拌转速和空气流量分别提高到82rpm和1100m³/h，在随后的整个发酵过程中维持该搅拌转速和空气流量不变，直到放罐，相应的OUR维持在40mmol/L/h左右，可以认为在此过程中OTR维持在该水平。

根据优化后的控制策略，本发明人对现行生产工艺进行了一定的调整。在初始的6小时内，维持搅拌转速为78rpm，到第8小时，搅拌转速提高到82rpm，在之后的发酵过程中，进行两次降低搅拌转速的调整，及在38小时和82小时分别将搅拌转速从82rpm降到78rpm，再从78rpm降到75rpm；同样对于空气流量，在初始15小时维持空气流量为850m³/h，到16小时将空气流量提高到1100，之后分别在58小时和94小时进行降低空气流量的调整，从1100m³/h降到900m³/h，再从900m³/h降到750m³/h。在搅拌转速和空气流量维持较高水平的阶段，OUR维持在37mmol/L/h，之后随着搅拌转速和空气流量的降低，OUR逐步降低，到发酵后期94小时之后，即VB12的快速合成期，OUR维持在16-18mmol/L/h。OUR的数值表示了该点的OTR水平。

图4b显示了工艺调整前后菌体生长、底物消耗和产物合成的变化情况。从图中菌体生长曲线可以看出，工艺的调整并没有影响到菌体的生长，菌体的最大比生长速率相近，菌体生长均在70小时左右进入生长稳定期。工艺调整后，菌体达到更高的菌体浓度，为38.5g/L，比工艺调整前的36.4g/L提高了5.8％。从图中Vb12合成曲线可以看出，原生产工艺条件下，在发酵168小时，发酵液VB12浓度为171.4mg/L，采取优化后的阶段供氧控制策略，VB12的合成速率较原工艺有了很明显的提高，在168小时达到208.4±6.5mg/l，比原工艺提高了近17.3％。从图4c可以看出，随着OUR的逐步降低，菌体底物的消耗速率随之降低，从而使得在维持相近残糖浓度的条件下，降低了底物补加量，糖耗降低近20.3％。

以优化后的控制策略对120m³工业化规模生产工艺进行调整，在168小时VB12浓度为208.4±6.5mg/l，比原工艺产量提高了17.3％，整个过程糖耗降低了近20.3％，同时，搅拌转速和空气流量的降低有效的降低了能耗，节约了能源，极大地降低了发酵成本。

表3  120m³工业规模发酵罐生产情况

实施例3  优化的控制策略验证

同实施例1，在120m³规模反应器上，以现有的生产工艺条件，运用优化的控制策略，在给定范围内对控制工艺进行调整，即在不同时期控制不同范围的OUR，进行若干批次实验，结果如下：

表4  120m³反应器基于OUR优化的试验结果

编号	0*	1	2	3	4	5	6	7
									发酵前期OUR水平(mmol/L/h)	35-45	37-42	35-38	35-40	36-40	38-43	37-40	35-37
发酵中后期OUR水平(mmol/L/h)	35-45	15-17	18-20	15-18	16-18	19-20	17-19	15-19
									172h维生素B12产量(mg/L)	173	201.5	198.3	193.5	205	201.7	195.9	197
总糖耗(kg/m3)	208.1	171.7	172	170	173	170.3	170.3	175.2

*编号0为优化前工艺(对照工艺)

由以上结果可以看出，利用优化的控制策略，172小时维生素B12产量均比优化前至少提高了10％以上，糖耗降低了15％以上。因此，运用本发明所述的优化策略所得实验结果具有较高的可信度，在实际生产中具有重要的指导意义。

实施例4  优化的控制策略在15L小规模反应器上的应用

实验室中，为了便于对维生素B12的发酵生产工艺进行研究，经常在5L-15L的小规模反应器中进行模拟研究。本发明人在15L反应器上，运用优化的控制策略进行了研究，在发酵前期，及菌体生长进入生长稳定期之前，控制OUR在35-45mmolL^-1·h^-1，之后在20小时之内逐步降低降低OUR到15-20mmol·L^-1·h^-1。整个过程的培养工艺同实施例1。

结果表明，研究过程中，菌体均在发酵开始后的45小时左右进入生长稳定期并启动了维生素B12的合成，在发酵过程的168-172小时内的平均产率为合成速率为17.9mgL^-1·h^-1，在发酵开始后的172小时维生素B12的平均产量为198.5mgL^-1，比优化前的15L规模平均产量171.3mgL^-1提高了16％；整个过程总糖耗为平均1740g，比优化前的2139g降低了18.7％。

这表明，本发明优化方法得到的实验结果可信度是很高的，建立的优化的控制策略能够很好地用于维生素B12发酵生产的相关研究。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

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Claims (10)

1.一种生产维生素B12的发酵方法，其特征在于，它包括步骤：

(a)在适合发酵的条件下，培养维生素B12的生产菌株，并且在发酵过程前期维持发酵体系的高水平的氧消耗速率，从而促进菌体生长和维生素B12合成的启动，其中所述的发酵过程前期是指从发酵开始起至菌株进入生长稳定期；

(b)在发酵过程的中后期降低并维持发酵体系的低水平的氧消耗速度，从而维持高水平的维生素B12的产物合成速率，从而产生维生素B12，其中所述的发酵过程中后期是指从发酵过程前期结束起至发酵结束；和

(c)从发酵液中分离纯化出维生素B12。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中，氧消耗速度的降低是间歇式降低、连续下降或逐步降低。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中高水平的氧消耗速率是控制氧消耗速率为35-45mmol·L^-1·h^-1；和/或

在步骤(b)中低水平的氧消耗速率是控制氧消耗速率为12-25mmol·L^-1·h^-1。

4.如权利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述的氧消耗速率按以下公式计算：

式中，F_in为进气流量L/min；V发酵液体积L；C_惰in\C_O2in\C_CO2in；分别为进气中惰性气体、氧气及二氧化碳的质量分率；C_O2out\C_CO2out：分别为排气中氧及二氧化碳的质量分率；

$f=\frac{273}{273+t_{\mathrm{in}}}\·P_{\mathrm{in}}\·\frac{1}{1+h}\×{10}^{-5}$

式中，P_in是进气的绝对压强Pa；t_in是进气的温度℃；h是进气的相对湿度％。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的高水平的维生素B12的产物合成速率是≥1.5mg·L^-1·h^-1。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的发酵体系的体积为5L至200立方米，较佳地为50L至150立方米。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的工程菌是费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)、谢氏丙酸杆菌(Propionibacterium shermanii)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、脱氮假单胞杆菌(Pseudomonas denitrificans)或钴胺素根瘤菌。

8.一种维生素B12发酵生产方法，其特征在于，在发酵过程中，当生产维生素B12的工程菌菌体生长进入生长稳定期时或之后，控制发酵体系的氧消耗速率，使得氧消耗速率小于或等于25mmol·L^-1·h^-1(较佳地，12-25mmol·L^{- 1}·h^-1，更佳地15-20mmol·L^-1·h^-1范围)，从而维持维生素B12的生产速率大于或等于1.5mg·L^-1·h^-1。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的工程菌是费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)、谢氏丙酸杆菌(Propionibacterium shermanii)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、脱氮假单胞杆菌(Pseudomonas denitrificans)或钴胺素根瘤菌。

10.一种提高维生素B12生产速率和/或降低糖消耗的方法，所述方法包括步骤：在维生素B12的生产菌株发酵产生维生素B12的期间，控制发酵体系的氧消耗速率，使得氧消耗速率小于或等于25mmol·L^-1·h^-1(较佳地，12-25mmol·L^-1·h^-1，更佳地15-20mmol·L^-1·h^-1范围)。

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