CN111549079B - 一种采用微生物发酵法制备维生素k2的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于维生素K2制备领域，具体涉及一种采用微生物发酵法制备维生素K2的方法，该方法包括分阶段将OUR、发酵液中ORP及乳酸浓度中的至少一者控制在预定范围内；和/或，在发酵培养5～20h后，往发酵液中加入辅料，所述辅料选自烟酰胺、维生素B12和甲硫氨酸中的至少一种。采用本发明提供的方法制备维生素K2，能够很好地满足维生素K2发酵在生长及合成等各阶段对培养条件的不同需求，促进菌体生长及产物合成，能够非常有效地提高维生素K2的发酵水平，所得发酵产物中维生素K2含量较高。
Description
技术领域
本发明属于维生素K2制备领域，涉及一种采用微生物发酵法制备维生素K2的方法。
背景技术
维生素K2是一种必不可少的脂溶性维生素，也称为甲萘醌，它可以通过促进肝脏合成凝血酶原，调节多种凝血因子的合成，也是骨钙素羧化的必要辅因子，在骨骼发育中起到重要作用，并有助于将钙离子转移到骨骼中，在凝血和预防骨质疏松症中能够起到关键的作用。另外，作为呼吸代谢中的电子传递载体，维生素K2也参与了生物体内许多重要的代谢反应。近年来的研究发现，维生素K2在临床应用上还有许多不同的功能，例如可用来预防治疗心脑血管疾病、帕金森症及II型糖尿病，促进肝脏功能的恢复等，具有广阔的应用前景。
维生素K2具有多个异构体，根据其分子结构上C3位异戊二烯单位的个数，以MK-n表示，其中以MK-7生物活性最高，半衰期最长。目前研究和开发维生素K2的方法主要包括天然提取法、化学合成法和微生物发酵法。其中，天然提取法产量低；化学合成法步骤复杂并且也存在收率低的问题，这也导致了维生素K2生产成本居高不下。另外，化学合成法易产生低活性的不同顺式异构体及大量的副产物，并造成环境污染，较难形成大规模的生产。而微生物发酵法具有污染小、成本低、产品活性高、生产规模易于放大等特点，逐渐成为研究的热点领域。通过筛选、诱变和改造等方式，国内外的研究机构已构建出许多生产维生素K2的潜力菌种，其中包括纳豆枯草芽孢杆菌、黄杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、乳酸菌等，但发酵水平仍普遍偏低。例如，CN104328064B中诱变筛选出一株高效利用大豆蛋白的维生素K2生产菌，维生素K2产量为60.54mg/L；CN108410775B公开了一株产维生素K2的纳豆芽孢杆菌，维生素产量约为70mg/L；CN107475312A公开了一种改善细胞膜通透性提高维生素K2的方法，经该法改良后黄杆菌产维生素K2的水平为48.8mg/L；汤贵详等人对一株解淀粉芽孢杆菌的发酵条件进行优化后维生素K2产量约为70mg/L(汤贵祥，陈朋友等；维生素K2高产菌株的筛选与发酵条件优化[J].，食品工业科技，2019，24(40):68-73.)。较低的发酵水平限制了维生素K2工业化生产的进程。
发明内容
本发明的目的是为了克服采用现有的微生物发酵法制备维生素K2存在发酵水平普遍偏低、所得发酵产物中维生素K2含量较低的缺陷，而提供一种能够有效提高发酵水平、所得发酵产物中维生素K2含量较高的方法。
本发明的发明人经过深入研究之后发现，发酵过程中氧消耗速率(Oxygen UptakeRate，以下采用缩写OUR)、发酵液中氧化还原电位(Oxidation Reduction Potential，以下采用缩写ORP)及乳酸浓度能够很好地反馈发酵过程，通过分阶段控制OUR、发酵液中ORP和乳酸浓度的范围，能够为菌体发酵过程的各个阶段提供最适宜的发酵培养条件，满足维生素K2发酵在生长及合成等各阶段对培养条件的不同需求，促进菌体生长及维生素K2合成，缩短发酵周期并降低设备能耗。此外，本发明的发明人经过深入研究之后还发现，在发酵培养5～20h后，补加烟酰胺、维生素B12和甲硫氨酸中的至少一种能够有效促进维生素K2的合成。基于此，完成了本发明。
具体地，本发明提供了一种采用微生物发酵法制备维生素K2的方法，其中，该方法包括在发酵培养阶段，分阶段将OUR、发酵液中ORP及乳酸浓度中的至少一者控制在预定范围内；和/或，在发酵培养5～20h后，往发酵液中加入辅料，所述辅料选自烟酰胺、维生素B12和甲硫氨酸中的至少一种；
分阶段控制OUR的方式如下：发酵0～4h OUR控制在20～80mmol/L·h，4～12h OUR控制在80～160mmol/L·h，12～24h OUR控制在60～140mmol/L·h，24～60h OUR控制在40～100mmol/L·h，60～140h OUR控制在20～90mmol/L·h；
分阶段控制发酵液中ORP的方式如下：发酵0～4h发酵液中ORP控制在60～150mV，4～12h发酵液中ORP控制在-80～100mV，12～24h发酵液中ORP控制在-50～120mV，24～60h发酵液中ORP控制在-20～160mV，60～140h发酵液中ORP控制在20～220mV；
分阶段控制发酵液中乳酸浓度的方式如下：发酵0～4h发酵液中乳酸浓度控制在1～20mg/L，4～12h发酵液中乳酸浓度控制在5～50mg/L，12～24h发酵液中乳酸浓度控制在10～100mg/L，24～60h发酵液中乳酸浓度控制在30～150mg/L，60～140h发酵液中乳酸浓度控制在50～100mg/L。
优选地，在发酵培养阶段，在线监测OUR、发酵液中ORP及乳酸浓度中的至少一者，并在发酵的不同阶段通过调整空气流量、转速及罐压中的至少一者而实现对OUR、发酵液中ORP及乳酸浓度中的至少一者进行分阶段调控。
优选地，所述烟酰胺的添加比例为0.01～0.1wt％。
优选地，所述维生素B12的添加比例为0.03～0.15wt％。
优选地，所述甲硫氨酸的添加比例为0.03～0.1wt％。
优选地，所述发酵所采用的菌种选自纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilisnatto)、黄杆菌(Flavobacterium)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)和地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)中的至少一种。
优选地，所述发酵培养的温度为28～40℃，pH值为6.0～7.5，种子液接种量为1～5％。
优选地，所述发酵培养所用发酵罐的容积为0.5L至500m3。
优选地，本发明提供的采用微生物发酵法制备维生素K2的方法还包括在发酵过程中补加甘油以将发酵体系中甘油浓度控制在1～10g/L。
采用本发明提供的方法制备维生素K2，能够很好地满足维生素K2在生长及合成等各阶段对培养条件的不同需求，促进菌体生长及产物合成，能够非常有效地提高维生素K2的发酵水平，所得发酵产物中维生素K2含量较高。再则，根据发酵过程中OUR、ORP和乳酸浓度的波动情况并以此为基础进行工艺的微调，也可以缩减由于种子质量的波动所带来的发酵差异，有利于各批次间发酵水平的稳定。
具体实施方式
本发明采用在线监测发酵过程OUR、发酵液中ORP及乳酸浓度中的至少一者来反馈调控发酵过程工艺参数，在发酵的不同阶段通过调整空气流量、转速及罐压中的至少一者，分阶段将OUR、发酵液中ORP及乳酸浓度中的至少一者控制在预定范围内，并结合发酵过程补加辅料促进维生素K2生产菌株的生长和产物合成，从而有效提高维生素K2的发酵水平。其中，OUR可以通过尾气质谱分析仪检测；发酵液中ORP可以通过氧化还原电极检测；发酵液中乳酸浓度可以通过乳酸测量仪检测。
在本发明的一些实施方式中，分五个阶段(即0～4h、4～12h、12～24h、24～60h、60～140h)对OUR、ORP及乳酸浓度进行调控。需要说明的是，0～4h包括第1h、第2h、第3h、第4h共4h，4～12h包括第5h、第6h……第12h共8h，12～24h包括第13h、第14h……第24h共12h，24～60h包括第25h、第26h……第60h共26h，60～140h包括第61h、第62h……第140h共80h。
在本发明的一些实施方式中，对于发酵过程中OUR的控制来说，增加空气流量可提高OUR水平，减少空气流量可降低OUR水平；增加发酵罐转速可增加OUR水平，减少发酵罐转速可减少OUR水平；增加发酵罐压力可增加OUR水平，减少发酵罐压力可减少OUR水平。维生素K2的发酵可以通过调整空气流量、转速及罐压中的至少一者保证发酵0～4hOUR数值范围控制在20～80mmol/L·h，如20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80mmol/L·h等；4～12h OUR数值范围控制在80～160mmol/L·h，如80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160mmol/L·h等；12～24h OUR数值范围控制在60～140mmol/L·h，如60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140mmol/L·h等；24～60h OUR数值范围控制在40～100mmol/L·h，如40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100mmol/L·h等；60～140h OUR数值范围控制在20～90mmol/L·h，如20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90mmol/L·h等。
在本发明的一些实施方式中，对于发酵过程中ORP的控制来说，增加空气流量可提高发酵液中ORP水平，减少空气流量可降低发酵液中ORP水平；增加发酵罐转速可增加发酵液中ORP水平，减少发酵罐转速可减少发酵液中ORP水平；增加发酵罐压力可增加发酵液中ORP水平，减少发酵罐压力可减少发酵液中ORP水平。维生素K2的发酵可以通过调整通气量、转速及罐压中的至少一者保证发酵0～4h发酵液中ORP数值范围控制在60～150mV，如60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150mV等；4～12h发酵液中ORP数值范围控制在-80～100mV、如-80、-75、-70、-65、-60、-55、-50、-45、-40、-35、-30、-25、-20、-15、-10、-5、0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100mV等；12～24h发酵液中ORP数值范围控制在-50～120mV、如-50、-45、-40、-35、-30、-25、-20、-15、-10、-5、0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120mV等；24～60h发酵液中ORP数值范围控制在-20～160mV，如-20、-15、-10、-5、0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160mV等；60～140h发酵液中ORP数值范围控制在20～220mV，如20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220mV等。
在本发明的一些实施方式中，对发酵过程中乳酸浓度的控制来说，增加空气流量可减少发酵液中乳酸的浓度，减少空气流量可增加发酵液中乳酸的浓度；增加发酵罐转速可减少发酵液中乳酸的浓度，减少发酵罐转速可增加发酵液中乳酸的浓度；增加发酵罐压力可减少发酵液中乳酸的浓度，减少发酵罐压力可增加发酵液中乳酸的浓度。维生素K2的发酵可以通过调整通气量、转速及罐压中的至少一者保证发酵0～4h发酵液中乳酸浓度数值范围控制在1～20mg/L，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20mg/L等；4～12h发酵液中乳酸浓度数值范围控制在5～50mg/L，如5、10、15、20、25、30、35、40、45、50mg/L等；12～24h发酵液中乳酸浓度数值范围控制在10～100mg/L，如10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100mg/L等；24～60h发酵液中乳酸浓度数值范围控制在30～150mg/L，如30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150mg/L等；60～140h发酵液中乳酸浓度数值范围控制在50～100mg/L，如50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100mg/L等。
在本发明的一些实施方式中，所述辅料包括烟酰胺、维生素B12及甲硫氨酸中的至少一种，具体可以为烟酰胺、维生素B12、甲硫氨酸、烟酰胺和维生素B12的混合物、烟酰胺和甲硫氨酸的混合物、维生素B12和甲硫氨酸的混合物、烟酰胺和维生素B12及甲硫氨酸的混合物，特别优选为烟酰胺和维生素B12及甲硫氨酸的混合物。此外，以培养基的总重量为基准，烟酰胺、维生素B12及甲硫氨酸的添加比例优选分别为0.01～0.1wt％、0.03～0.15wt％和0.03～0.1wt％。当辅料为烟酰胺和维生素B12及甲硫氨酸的混合物，和/或，辅料的用量控制在上述优选范围内时，能够进一步提高维生素K2的发酵水平。
在本发明的一些实施方式中，所用的菌种为可产维生素K2的常规菌株，具体包括纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)、黄杆菌(Flavobacterium)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)等，优选为纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)。此外，用于本发明的种子及发酵培养基没有特定的限制，可以是各种常规的培养基，根据不同的菌种选用适合菌体生长的培养基即可，对此为本领域技术人员均能知悉，在此不作赘述。
本发明对发酵培养的条件没有特别的限定，例如，包括温度可以为28～40℃，pH值可以为6.5～7.5，种子液接种量可以为1～5％。其中，调节pH值的试剂包括但不限于：氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、氨水等。此外，所述发酵培养所用的发酵罐容积可以为0.5L至500m3。
此外，本发明的一些实施方式中，提供的采用微生物发酵法制备维生素K2的方法还包括在发酵过程中补加甘油以将发酵体系中甘油浓度控制在1～10g/L，目的是为了保证菌体培养过程中摄取适量的碳源以进行生长及产物合成。
根据本发明的一种具体实施方式，所述采用微生物发酵法制备维生素K2的方法包括以下步骤：
(1)菌种活化：在无菌条件下，将菌种种子冻存液按照梯度稀释方法接入牛肉膏蛋白胨琼脂培养基内，在28～40℃下培养15～25h；
(2)种子培养：从培养好的平板种子挑取单菌落，接入含0.5～2％葡萄糖的牛肉膏蛋白胨培养基的摇瓶内，之后放置于摇床中，于28～40℃、200～240rpm条件下培养10～20h；
(3)发酵培养：将培养好的种子液以1～5％接种量接入发酵罐中，培养温度为28～40℃，培养pH值为6.5～7.5，发酵全程监测OUR、发酵液中ORP及乳酸浓度中的至少一者，发酵罐空气流量、转速及罐压根据OUR、发酵液中ORP及乳酸浓度变化而进行调整；发酵过程补加40～60％甘油控制甘油浓度在1～10g/L，发酵培养至5～20h时，于发酵液中加入烟酰胺、维生素B12及甲硫氨酸中的至少一种，继续培养至140h后放罐。
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
以下实施例和对比例中：
OUR通过尾气质谱分析仪检测；发酵液中ORP通过氧化还原电极检测；发酵液中乳酸浓度通过在线乳酸测量仪检测。
发酵液中维生素K2含量通过高效液相色谱法检测，具体方法如下：
样品处理：量取适量体积发酵液，加入4倍体积的萃取液(正己烷和异丙醇体积比为2:1)，避光震荡40min，静置分层后吸取上清液经0.22μm有机滤膜过滤后上机检测。其中，检测条件：色谱柱使用C18柱，柱温30℃，流动相甲醇，流速1.0mL/min，检测波长254nm(实施例13中使用248nm，其他均为该波长检测)，进样量20uL，检测时长35min。检测结果通过外标法进行计算后获得发酵液中维生素K2含量。
实施例1：一种发酵制备维生素K2的方法，发酵培养使用100L发酵罐，包括如下步骤：(1)菌种活化；(2)种子培养；(3)发酵培养。
(1)菌种活化：在无菌条件下，将纳豆枯草芽孢杆菌(菌种编号：ATCC 15245)种子冻存液按照梯度稀释方法接入牛肉膏蛋白胨琼脂培养基内，在30℃下培养20h。
(2)种子培养：从培养好的平板种子挑取单菌落，接入含1％葡萄糖的牛肉膏蛋白胨培养基的1L摇瓶内，之后放置于摇床中，30℃，220rpm培养14h。
(3)发酵培养：将培养好的种子罐种子液以4％接种量接入100L发酵罐中，培养温度为30℃，发酵过程使用氢氧化钠溶液或氨水控制pH值在7.0，发酵全程监测OUR的数值，转速、通气量和罐压根据OUR的数值变化而进行调整，发酵0～4h控制OUR水平在30～60mmol/L·h，发酵4～12h控制OUR水平在90～140mmol/L·h，发酵12～24h控制OUR水平在70～110mmol/L·h，发酵24～60h控制OUR水平在50～80mmol/L·h，发酵60～140h控制OUR水平在35～75mmol/L·h，发酵过程中转速控制在200～400rpm，通气比控制在0.3～1.0vvm，罐压控制在0.03～0.07MPa。发酵过程中补加50％甘油控制甘油浓度在1～10g/L。发酵培养至16h时，于发酵液中加入0.02wt％烟酰胺、0.03wt％维生素B12和0.03wt％甲硫氨酸，继续培养至140h后放罐。
每升发酵培养基中含有如下组分：豆饼粉40g、玉米浆10g、氯化钠0.4g、硫酸镁1.2g、磷酸氢二钠0.5g、氯化锌0.2g、硫酸亚铁0.15g、甘油20g、泡敌0.5g，消前使用氢氧化钠溶液调节pH至7.0。
收集发酵液获得菌体，检测菌体干重18.4g/L，高效液相色谱法检测发酵液中维生素K2含量117mg/L。
实施例2：一种发酵制备维生素K2的方法，发酵培养使用100L发酵罐，包括如下步骤：(1)菌种活化；(2)种子培养；(3)发酵培养。
(1)菌种活化：在无菌条件下，将纳豆枯草芽孢杆菌(菌种编号：ATCC 15245)种子冻存液按照梯度稀释方法接入牛肉膏蛋白胨琼脂培养基内，在30℃下培养20h。
(2)种子培养：从培养好的平板种子挑取单菌落，接入含1％葡萄糖的牛肉膏蛋白胨培养基的1L摇瓶内，之后放置于摇床中，30℃，220rpm培养14h。
(3)发酵培养：将培养好的种子罐种子液以4％接种量接入100L发酵罐中，培养温度为30℃，发酵过程使用氢氧化钠溶液或氨水控制pH值在7.0，发酵全程监测发酵液中ORP的数值，转速、通气量和罐压根据发酵液中ORP的数值变化而进行调整，发酵0～4h控制发酵液中ORP水平在90～120mV，发酵4～12h控制发酵液中ORP水平在-50～60mV，发酵12～24h控制发酵液中ORP水平在-30～70mV，发酵24～60h控制发酵液中ORP水平在-10～100mV，发酵60～140h控制发酵液中ORP水平在20～160mV，发酵过程中转速控制在200～400rpm，通气比控制在0.3～1.0vvm，罐压控制在0.03～0.07MPa。发酵过程中补加50％甘油控制甘油浓度在1～10g/L。发酵培养至16h时，于发酵液中加入0.02wt％烟酰胺、0.03wt％维生素B12和0.03wt％甲硫氨酸，继续培养至140h后放罐。
每升发酵培养基中含有如下组分：豆饼粉40g、玉米浆10g、氯化钠0.4g、硫酸镁1.2g、磷酸氢二钠0.5g、氯化锌0.2g、硫酸亚铁0.15g、甘油20g、泡敌0.5g，消前使用氢氧化钠溶液调节pH至7.0。
收集发酵液获得菌体，检测菌体干重19.9g/L，高效液相色谱法检测发酵液中维生素K2含量113mg/L。
实施例3：一种发酵制备维生素K2的方法，发酵培养使用100L发酵罐，包括如下步骤：(1)菌种活化；(2)种子培养；(3)发酵培养。
(1)菌种活化：在无菌条件下，将纳豆枯草芽孢杆菌(菌种编号：ATCC 15245)种子冻存液按照梯度稀释方法接入牛肉膏蛋白胨琼脂培养基内，在30℃下培养20h。
(2)种子培养：从培养好的平板种子挑取单菌落，接入含1％葡萄糖的牛肉膏蛋白胨培养基的1L摇瓶内，之后放置于摇床中，30℃，220rpm培养14h。
(3)发酵培养：将培养好的种子罐种子液以4％接种量接入100L发酵罐中，培养温度为30℃，发酵过程使用氢氧化钠溶液或氨水控制pH值在7.0，发酵全程监测发酵液中乳酸浓度的数值，转速、通气量和罐压根据发酵液中乳酸浓度的数值变化而进行调整，发酵0～4h控制发酵液中乳酸浓度在2～10mg/L，发酵4～12h控制发酵液中乳酸浓度在5～30mg/L，发酵12～24h控制发酵液中乳酸浓度在15～60mg/L，发酵24～60h控制发酵液中乳酸浓度在35～100mg/L，发酵60～140h控制发酵液中乳酸浓度在50～80mg/L，发酵过程中转速控制在200～400rpm，通气比控制在0.3～1.0vvm，罐压控制在0.03～0.07MPa。发酵过程中补加50％甘油控制甘油浓度在1～10g/L。发酵培养至16h时，于发酵液中加入0.02wt％烟酰胺、0.03wt％维生素B12和0.03wt％甲硫氨酸，继续培养至140h后放罐。
每升发酵培养基中含有如下组分：豆饼粉40g、玉米浆10g、氯化钠0.4g、硫酸镁1.2g、磷酸氢二钠0.5g、氯化锌0.2g、硫酸亚铁0.15g、甘油20g、泡敌0.5g，消前使用氢氧化钠溶液调节pH至7.0。
收集发酵液获得菌体，检测菌体干重19.9g/L，高效液相色谱法检测发酵液中维生素K2含量119mg/L。
实施例4：一种发酵制备维生素K2的方法，发酵培养使用100L发酵罐，包括如下步骤：(1)菌种活化；(2)种子培养；(3)发酵培养。
(1)菌种活化：在无菌条件下，将纳豆枯草芽孢杆菌(菌种编号：ATCC 15245)种子冻存液按照梯度稀释方法接入牛肉膏蛋白胨琼脂培养基内，在30℃下培养20h。
(2)种子培养：从培养好的平板种子挑取单菌落，接入含1％葡萄糖的牛肉膏蛋白胨培养基的1L摇瓶内，之后放置于摇床中，30℃，220rpm培养14h。
(3)发酵培养：将培养好的种子罐种子液以4％接种量接入100L发酵罐中，培养温度为30℃，发酵过程使用氢氧化钠溶液或氨水控制pH值在7.0，发酵全程监测OUR的数值，转速、通气量和罐压根据OUR的数值变化而进行调整，发酵0～4h控制OUR水平在30～60mmol/L·h，发酵4～12h控制OUR水平在90～140mmol/L·h，发酵12～24h控制OUR水平在70～110mmol/L·h，发酵24～60h控制OUR水平在50～80mmol/L·h，发酵60～140h控制OUR水平在35～75mmol/L·h，发酵过程中转速控制在200～400rpm，通气比控制在0.3～1.0vvm，罐压控制在0.03～0.07MPa。发酵过程中补加50％甘油控制甘油浓度在1～10g/L。发酵培养至16h时，于发酵液中加入0.04wt％烟酰胺、0.07wt％维生素B12和0.06wt％甲硫氨酸，继续培养至140h后放罐。
每升发酵培养基中含有如下组分：豆饼粉40g、玉米浆10g、氯化钠0.4g、硫酸镁1.2g、磷酸氢二钠0.5g、氯化锌0.2g、硫酸亚铁0.15g、甘油20g、泡敌0.5g，消前使用氢氧化钠溶液调节pH至7.0。
收集发酵液获得菌体，检测菌体干重18.7g/L，高效液相色谱法检测发酵液中维生素K2含量136mg/L。
实施例5：一种发酵制备维生素K2的方法，发酵培养使用100L发酵罐，包括如下步骤：(1)菌种活化；(2)种子培养；(3)发酵培养。
(1)菌种活化：在无菌条件下，将纳豆枯草芽孢杆菌(菌种编号：ATCC 15245)种子冻存液按照梯度稀释方法接入牛肉膏蛋白胨琼脂培养基内，在30℃下培养20h。
(2)种子培养：从培养好的平板种子挑取单菌落，接入含1％葡萄糖的牛肉膏蛋白胨培养基的1L摇瓶内，之后放置于摇床中，30℃，220rpm培养14h。
(3)发酵培养：将培养好的种子罐种子液以4％接种量接入100L发酵罐中，培养温度为30℃，发酵过程使用氢氧化钠溶液或氨水控制pH值在7.0，发酵全程监测OUR和ORP的数值，转速、通气量和罐压根据OUR和ORP数值变化而进行调整，发酵0～4h控制OUR和ORP水平分别在30～60mmol/L·h和80～120mV，发酵4～12h控制OUR和ORP水平分别在90～140mmol/L·h和-80～70mV，发酵12～24h控制OUR和ORP水平分别在70～110mmol/L·h和-30～60mV，发酵24～60h控制OUR和ORP水平分别在50～80mmol/L·h和-20～110mV，发酵60～140h控制OUR和ORP水平分别在35～75mmol/L·h和60～150mV，发酵过程中转速控制在200～400rpm，通气比控制在0.3～1.0vvm，罐压控制在0.03～0.07MPa。发酵过程中补加50％甘油控制甘油浓度在1～10g/L。发酵培养至16h时，于发酵液中加入0.04wt％烟酰胺、0.07wt％维生素B12和0.06wt％甲硫氨酸，继续培养至140h后放罐。
每升发酵培养基中含有如下组分：豆饼粉40g、玉米浆10g、氯化钠0.4g、硫酸镁1.2g、磷酸氢二钠0.5g、氯化锌0.2g、硫酸亚铁0.15g、甘油20g、泡敌0.5g，消前使用氢氧化钠溶液调节pH至7.0。
收集发酵液获得菌体，检测菌体干重19.1g/L，高效液相色谱法检测发酵液中维生素K2含量139mg/L。
实施例6：一种发酵制备维生素K2的方法，发酵培养使用100L发酵罐，包括如下步骤：(1)菌种活化；(2)种子培养；(3)发酵培养。
(1)菌种活化：在无菌条件下，将纳豆枯草芽孢杆菌(菌种编号：ATCC 15245)种子冻存液按照梯度稀释方法接入牛肉膏蛋白胨琼脂培养基内，在30℃下培养20h。
(2)种子培养：从培养好的平板种子挑取单菌落，接入含1％葡萄糖的牛肉膏蛋白胨培养基的1L摇瓶内，之后放置于摇床中，30℃，220rpm培养14h。
(3)发酵培养：将培养好的种子罐种子液以4％接种量接入100L发酵罐中，培养温度为30℃，发酵过程使用氢氧化钠溶液或氨水控制pH值在7.0，发酵全程监测OUR和乳酸的数值，转速、通气量和罐压根据OUR和乳酸数值变化而进行调整，发酵0～4h控制OUR和乳酸水平分别在30～60mmol/L·h和1～10mg/L，发酵4～12h控制OUR和乳酸水平分别在90～140mmol/L·h和5～20mg/L，发酵12～24h控制OUR和乳酸水平分别在70～110mmol/L·h和20～50mg/L，发酵24～60h控制OUR和乳酸水平分别在50～80mmol/L·h和35～100mg/L，发酵60～140h控制OUR和乳酸水平分别在35～75mmol/L·h和50～70mg/L，发酵过程中转速控制在200～400rpm，通气比控制在0.3～1.0vvm，罐压控制在0.03～0.07MPa。发酵过程中补加50％甘油控制甘油浓度在1～10g/L。发酵培养至16h时，于发酵液中加入0.04wt％烟酰胺、0.07wt％维生素B12和0.06wt％甲硫氨酸，继续培养至140h后放罐。
每升发酵培养基中含有如下组分：豆饼粉40g、玉米浆10g、氯化钠0.4g、硫酸镁1.2g、磷酸氢二钠0.5g、氯化锌0.2g、硫酸亚铁0.15g、甘油20g、泡敌0.5g，消前使用氢氧化钠溶液调节pH至7.0。
收集发酵液获得菌体，检测菌体干重18.6g/L，高效液相色谱法检测发酵液中维生素K2含量134mg/L。
实施例7：一种发酵制备维生素K2的方法，发酵培养使用100L发酵罐，包括如下步骤：(1)菌种活化；(2)种子培养；(3)发酵培养。
(1)菌种活化：在无菌条件下，将纳豆枯草芽孢杆菌(菌种编号：ATCC 15245)种子冻存液按照梯度稀释方法接入牛肉膏蛋白胨琼脂培养基内，在30℃下培养20h。
(2)种子培养：从培养好的平板种子挑取单菌落，接入含1％葡萄糖的牛肉膏蛋白胨培养基的1L摇瓶内，之后放置于摇床中，30℃，220rpm培养14h。
(3)发酵培养：将培养好的种子罐种子液以4％接种量接入100L发酵罐中，培养温度为30℃，发酵过程使用氢氧化钠溶液或氨水控制pH值在7.0，发酵全程监测ORP和乳酸的数值，转速、通气量和罐压根据ORP和乳酸数值变化而进行调整，发酵0～4h控制ORP和乳酸水平分别在80～120mV和1～10mg/L，发酵4～12h控制ORP和乳酸水平分别在-80～70mV和5～20mg/L，发酵12～24h控制ORP和乳酸水平分别在-30～60mV和20～50mg/L，发酵24～60h控制ORP和乳酸水平分别在-20～110mV和35～100mg/L，发酵60～140h控制ORP和乳酸水平分别在60～150mV和50～70mg/L，发酵过程中转速控制在200～400rpm，通气比控制在0.3～1.0vvm，罐压控制在0.03～0.07MPa。发酵过程中补加50％甘油控制甘油浓度在1～10g/L。发酵培养至16h时，于发酵液中加入0.04wt％烟酰胺、0.07wt％维生素B12和0.06wt％甲硫氨酸，继续培养至140h后放罐。
每升发酵培养基中含有如下组分：豆饼粉40g、玉米浆10g、氯化钠0.4g、硫酸镁1.2g、磷酸氢二钠0.5g、氯化锌0.2g、硫酸亚铁0.15g、甘油20g、泡敌0.5g，消前使用氢氧化钠溶液调节pH至7.0。
收集发酵液获得菌体，检测菌体干重19.0g/L，高效液相色谱法检测发酵液中维生素K2含量135mg/L。
实施例8：一种发酵制备维生素K2的方法，发酵培养使用100L发酵罐，包括如下步骤：(1)菌种活化；(2)种子培养；(3)发酵培养。
(1)菌种活化：在无菌条件下，将纳豆枯草芽孢杆菌(菌种编号：ATCC 15245)种子冻存液按照梯度稀释方法接入牛肉膏蛋白胨琼脂培养基内，在30℃下培养20h。
(2)种子培养：从培养好的平板种子挑取单菌落，接入含1％葡萄糖的牛肉膏蛋白胨培养基的1L摇瓶内，之后放置于摇床中，30℃，220rpm培养14h。
(3)发酵培养：将培养好的种子罐种子液以4％接种量接入100L发酵罐中，培养温度为30℃，发酵过程使用氢氧化钠溶液或氨水控制pH值在7.0，发酵全程监测OUR、ORP和乳酸的数值，转速、通气量和罐压根据OUR、ORP和乳酸数值变化而进行调整，发酵0～4h控制OUR、ORP和乳酸水平分别在30～60mmol/L·h、80～120mV和1～10mg/L，发酵4～12h控制OUR、ORP和乳酸水平分别在90～140mmol/L·h、-80～70mV和5～20mg/L，发酵12～24h控制OUR、ORP和乳酸水平分别在70～110mmol/L·h、-30～60mV和20～50mg/L，发酵24～60h控制OUR、ORP和乳酸水平分别在50～80mmol/L·h、-20～110mV和35～100mg/L，发酵60～140h控制OUR、ORP和乳酸水平分别在35～75mmol/L·h、60～150mV和50～70mg/L，发酵过程中转速控制在200～400rpm，通气比控制在0.3～1.0vvm，罐压控制在0.03～0.07MPa。发酵过程中补加50％甘油控制甘油浓度在1～10g/L。发酵培养至16h时，于发酵液中加入0.04wt％烟酰胺、0.07wt％维生素B12和0.06wt％甲硫氨酸，继续培养至140h后放罐。
每升发酵培养基中含有如下组分：豆饼粉40g、玉米浆10g、氯化钠0.4g、硫酸镁1.2g、磷酸氢二钠0.5g、氯化锌0.2g、硫酸亚铁0.15g、甘油20g、泡敌0.5g，消前使用氢氧化钠溶液调节pH至7.0。
收集发酵液获得菌体，检测菌体干重19.4g/L，高效液相色谱法检测发酵液中维生素K2含量138mg/L。
实施例9：一种发酵制备维生素K2的方法，发酵培养使用100L发酵罐，包括如下步骤：(1)菌种活化；(2)种子培养；(3)发酵培养。
(1)菌种活化：在无菌条件下，将纳豆枯草芽孢杆菌(菌种编号：ATCC 15245)种子冻存液按照梯度稀释方法接入牛肉膏蛋白胨琼脂培养基内，在30℃下培养20h。
(2)种子培养：从培养好的平板种子挑取单菌落，接入含1％葡萄糖的牛肉膏蛋白胨培养基的1L摇瓶内，之后放置于摇床中，30℃，220rpm培养14h。
(3)发酵培养：将培养好的种子罐种子液以4％接种量接入100L发酵罐中，培养温度为30℃，发酵过程使用氢氧化钠溶液或氨水控制pH值在7.0，发酵全程不对OUR、发酵液中ORP及乳酸浓度进行检测和调控，转速控制在300rpm，通气比控制在0.6vvm，罐压控制在0.05MPa。发酵过程中补加50％甘油控制甘油浓度在1～10g/L。发酵培养至16h时，于发酵液中加入0.04wt％烟酰胺、0.07wt％维生素B12和0.06wt％甲硫氨酸，继续培养至140h后放罐。
每升发酵培养基中含有如下组分：豆饼粉40g、玉米浆10g、氯化钠0.4g、硫酸镁1.2g、磷酸氢二钠0.5g、氯化锌0.2g、硫酸亚铁0.15g、甘油20g、泡敌0.5g，消前使用氢氧化钠溶液调节pH至7.0。
收集发酵液获得菌体，检测菌体干重17.4g/L，高效液相色谱法检测发酵液中维生素K2含量91mg/L。
实施例10：一种发酵制备维生素K2的方法，发酵培养使用100L发酵罐，包括如下步骤：(1)菌种活化；(2)种子培养；(3)发酵培养。
(1)菌种活化：在无菌条件下，将纳豆枯草芽孢杆菌(菌种编号：ATCC 15245)种子冻存液按照梯度稀释方法接入牛肉膏蛋白胨琼脂培养基内，在30℃下培养20h。
(2)种子培养：从培养好的平板种子挑取单菌落，接入含1％葡萄糖的牛肉膏蛋白胨培养基的1L摇瓶内，之后放置于摇床中，30℃，220rpm培养14h。
(3)发酵培养：将培养好的种子罐种子液以4％接种量接入100L发酵罐中，培养温度为30℃，发酵过程使用氢氧化钠溶液或氨水控制pH值在7.0，发酵全程监测OUR的数值，转速、通气量和罐压根据OUR的数值变化而进行调整，发酵0～4h控制OUR水平在30～60mmol/L·h，发酵4～12h控制OUR水平在90～140mmol/L·h，发酵12～24h控制OUR水平在70～110mmol/L·h，发酵24～60h控制OUR水平在50～80mmol/L·h，发酵60～140h控制OUR水平在35～75mmol/L·h，发酵过程中转速控制在200～400rpm，通气比控制在0.3～1.0vvm，罐压控制在0.03～0.07MPa。发酵过程中补加50％甘油控制甘油浓度在1～10g/L。发酵培养至16h时，于发酵液中加入烟酰胺、维生素B12和甲硫氨酸中的至少一种(具体见表1)，继续培养至140h后放罐。
每升发酵培养基中含有如下组分：豆饼粉40g、玉米浆10g、氯化钠0.4g、硫酸镁1.2g、磷酸氢二钠0.5g、氯化锌0.2g、硫酸亚铁0.15g、甘油20g、泡敌0.5g，消前使用氢氧化钠溶液调节pH至7.0。
收集发酵液获得菌体，菌体干重及维生素K2含量的的结果如下表1所示。
表1添加不同辅料对维生素K2发酵的影响
| 所补加辅料 | 菌体干重 | 维生素K2含量 |
| 0.04％烟酰胺+0.04％维生素B12+0.03％甲硫氨酸 | 21.9g/L | 128mg/L |
| 0.04％烟酰胺+0.07％维生素B12 | 20.3g/L | 120mg/L |
| 0.11％烟酰胺 | 18.5g/L | 100mg/L |
| 0.11％维生素B12 | 21.7g/L | 90mg/L |
| 0.11％甲硫氨酸 | 18.8g/L | 94mg/L |
| 0.04％烟酰胺+0.06％甲硫氨酸 | 20.5g/L | 125mg/L |
| 0.07％维生素B12+0.06％甲硫氨酸 | 21.6g/L | 114mg/L |
| 0.04％烟酰胺 | 21.0g/L | 109mg/L |
| 0.07％维生素B12 | 21.7g/L | 96mg/L |
| 0.06％甲硫氨酸 | 21.0g/L | 104mg/L |
实施例11：一种发酵制备维生素K2的方法，发酵培养使用100L发酵罐，包括如下步骤：(1)菌种活化；(2)种子培养；(3)发酵培养。
(1)菌种活化：在无菌条件下，将黄杆菌(菌种编号：CICC10651)种子冻存液按照梯度稀释方法接入LB固体培养基内，在37℃下培养24h。
(2)种子培养：从培养好的平板种子挑取单菌落，接入含1％葡萄糖LB培养基的1L摇瓶内，之后放置于摇床中，37℃，200rpm培养12h。
(3)发酵培养：将培养好的种子罐种子液以2％接种量接入100L发酵罐中，培养温度为37℃，发酵过程使用氢氧化钠溶液或氨水控制pH值在7.4，发酵全程监测OUR、ORP和乳酸的数值，转速、通气量和罐压根据OUR、ORP和乳酸数值变化而进行调整，发酵0～4h控制OUR、ORP和乳酸水平分别在30～50mmol/L·h、80～120mV和1～10mg/L，发酵4～12h控制OUR、ORP和乳酸水平分别在80～100mmol/L·h、-80～70mV和15～40mg/L，发酵12～24h控制OUR、ORP和乳酸水平分别在60～90mmol/L·h、-30～60mV和30～60mg/L，发酵24～60h控制OUR、ORP和乳酸水平分别在40～60mmol/L·h、-20～110mV和45～90mg/L，发酵60～140h控制OUR、ORP和乳酸水平分别在30～50mmol/L·h、60～150mV和60～80mg/L，发酵过程中转速控制在200～400rpm，通气比控制在0.3～1.0vvm，罐压控制在0.03～0.07MPa。发酵过程中补加50％甘油控制甘油浓度在1～10g/L。发酵培养至16h时，于发酵液中加入0.04wt％烟酰胺、0.07wt％维生素B12和0.06wt％甲硫氨酸，继续培养至140h后放罐。
每升发酵培养基中含有如下组分：酵母粉30g、鱼粉10g、氯化钠2g、硫酸镁0.6g、磷酸氢二钠3.5g、甘油20g、泡敌0.5g，消前使用氢氧化钠溶液调节pH至7.4。
收集发酵液获得菌体，检测菌体干重9.4g/L，高效液相色谱法检测发酵液中维生素K2含量74mg/L。
实施例12：一种发酵制备维生素K2的方法，发酵培养使用100L发酵罐，包括如下步骤：(1)菌种活化；(2)种子培养；(3)发酵培养。
(1)菌种活化：在无菌条件下，将黄杆菌(菌种编号：CICC10651)种子冻存液按照梯度稀释方法接入LB固体培养基内，在37℃下培养24h。
(2)种子培养：从培养好的平板种子挑取单菌落，接入含1％葡萄糖LB培养基的1L摇瓶内，之后放置于摇床中，37℃，200rpm培养12h。
(3)发酵培养：将培养好的种子罐种子液以2％接种量接入100L发酵罐中，培养温度为37℃，发酵过程使用氢氧化钠溶液或氨水控制pH值在7.4，发酵全程不对OUR、发酵液中ORP及乳酸浓度进行检测和调控，转速控制在300rpm，通气比控制在0.6vvm，罐压控制在0.05MPa。发酵过程中补加50％甘油控制甘油浓度在1～10g/L。发酵培养至16h时，于发酵液中加入0.04wt％烟酰胺、0.07wt％维生素B12和0.06wt％甲硫氨酸，继续培养至140h后放罐。
每升发酵培养基中含有如下组分：酵母粉30g、鱼粉10g、氯化钠2g、硫酸镁0.6g、磷酸氢二钠3.5g、甘油20g、泡敌0.5g，消前使用氢氧化钠溶液调节pH至7.4。
收集发酵液获得菌体，检测菌体干重8.7g/L，高效液相色谱法检测发酵液中维生素K2含量32mg/L。
实施例13：一种发酵制备维生素K2的方法，发酵培养使用100L发酵罐，包括如下步骤：(1)菌种活化；(2)种子培养；(3)发酵培养。
(1)菌种活化：在无菌条件下，将枯草芽孢杆菌(菌种编号：CGMCC 1.8886)种子冻存液按照梯度稀释方法接入牛肉膏蛋白胨琼脂培养基内，在37℃下培养20h。
(2)种子培养：从培养好的平板种子挑取单菌落，接入含1％葡萄糖的牛肉膏蛋白胨培养基的1L摇瓶内，之后放置于摇床中，37℃，220rpm培养12h。
(3)发酵培养：将培养好的种子罐种子液以2％接种量接入100L发酵罐中，培养温度为37℃，发酵过程使用氢氧化钠溶液或氨水控制pH值在7.0，发酵全程监测OUR、ORP和乳酸的数值，转速、通气量和罐压根据OUR、ORP和乳酸数值变化而进行调整，发酵0～4h控制OUR、ORP和乳酸水平分别在20～70mmol/L·h、100～140mV和1～5mg/L，发酵4～12h控制OUR、ORP和乳酸水平分别在80～120mmol/L·h、-20～100mV和5～10mg/L，发酵12～24h控制OUR、ORP和乳酸水平分别在80～120mmol/L·h、10～80mV和15～30mg/L，发酵24～60h控制OUR、ORP和乳酸水平分别在60～80mmol/L·h、20～140mV和30～50mg/L，发酵60～140h控制OUR、ORP和乳酸水平分别在30～80mmol/L·h、70～200mV和50～70mg/L，发酵过程中转速控制在200～400rpm，通气比控制在0.3～1.0vvm，罐压控制在0.03～0.07MPa。发酵过程中补加50％甘油控制甘油浓度在1～10g/L。发酵培养至16h时，于发酵液中加入0.04wt％烟酰胺、0.07wt％维生素B12和0.06wt％甲硫氨酸，继续培养至140h后放罐。
每升发酵培养基中含有如下组分：豆饼粉30g、酵母粉10g、氯化钙0.5g、硫酸镁0.5g、磷酸氢二钠0.5g、甘油20g、泡敌0.5g，消前使用氢氧化钠溶液调节pH至7.0。
收集发酵液获得菌体，检测菌体干重15.7g/L，高效液相色谱法检测发酵液中维生素K2含量116mg/L。
实施例14：一种发酵制备维生素K2的方法，发酵培养使用100L发酵罐，包括如下步骤：(1)菌种活化；(2)种子培养；(3)发酵培养。
(1)菌种活化：在无菌条件下，将解淀粉芽孢杆菌(菌种编号CGMCC 1.921)种子冻存液按照梯度稀释方法接入牛肉膏蛋白胨琼脂培养基内，在32℃下培养24h。
(2)种子培养：从培养好的平板种子挑取单菌落，接入含1％葡萄糖的牛肉膏蛋白胨培养基的1L摇瓶内，之后放置于摇床中，32℃，200rpm培养16h。
(3)发酵培养：将培养好的种子罐种子液以1％接种量接入100L发酵罐中，培养温度为32℃，发酵过程使用氢氧化钠溶液或氨水控制pH值在7.2，发酵全程监测OUR、ORP和乳酸的数值，转速、通气量和罐压根据OUR、ORP和乳酸数值变化而进行调整，发酵0～4h控制OUR、ORP和乳酸水平分别在20～60mmol/L·h、90～150mV和1～10mg/L，发酵4～12h控制OUR、ORP和乳酸水平分别在80～100mmol/L·h、-60～80mV和10～25mg/L，发酵12～24h控制OUR、ORP和乳酸水平分别在70～100mmol/L·h、-40～60mV和25～60mg/L，发酵24～60h控制OUR、ORP和乳酸水平分别在55～75mmol/L·h、-10～120mV和30～110mg/L，发酵60～140h控制OUR、ORP和乳酸水平分别在25～40mmol/L·h、40～150mV和60～80mg/L，发酵过程中转速控制在200～400rpm，通气比控制在0.3～1.0vvm，罐压控制在0.03～0.07MPa。发酵过程中补加50％甘油控制甘油浓度在1～10g/L。发酵培养至16h时，于发酵液中加入0.04wt％烟酰胺、0.07wt％维生素B12和0.06wt％甲硫氨酸，继续培养至140h后放罐。
每升发酵培养基中含有如下组分：豆饼粉30g、淀粉10g、酵母粉15g、氯化钙0.3g、硫酸镁1.2g、磷酸氢二钾0.5g、甘油10g、泡敌0.5g，消前使用氢氧化钠溶液调节pH至7.2。
收集发酵液获得菌体，检测菌体干重23.3g/L，高效液相色谱法检测发酵液中维生素K2含量104mg/L。
实施例15：一种发酵制备维生素K2的方法，发酵培养使用100L发酵罐，包括如下步骤：(1)菌种活化；(2)种子培养；(3)发酵培养。
(1)菌种活化：在无菌条件下，将地衣芽孢杆菌(菌种编号CGMCC1.15832)种子冻存液按照梯度稀释方法接入牛肉膏蛋白胨琼脂培养基内，在37℃下培养24h。
(2)种子培养：从培养好的平板种子挑取单菌落，接入含1％葡萄糖的牛肉膏蛋白胨培养基的1L摇瓶内，之后放置于摇床中，37℃，220rpm培养16h。
(3)发酵培养：将培养好的种子罐种子液以4％接种量接入100L发酵罐中，培养温度为37℃，发酵过程使用氢氧化钠溶液或氨水控制pH值在7.0，发酵全程监测OUR、ORP和乳酸的数值，转速、通气量和罐压根据OUR、ORP和乳酸数值变化而进行调整，发酵0～4h控制OUR、ORP和乳酸水平分别在25～65mmol/L·h、60～100mV和1～10mg/L，发酵4～12h控制OUR、ORP和乳酸水平分别在90～130mmol/L·h、-50～70mV和5～30mg/L，发酵12～24h控制OUR、ORP和乳酸水平分别在60～100mmol/L·h、-40～90mV和15～50mg/L，发酵24～60h控制OUR、ORP和乳酸水平分别在55～80mmol/L·h、-10～140mV和30～65mg/L，发酵60～140h控制OUR、ORP和乳酸水平分别在30～70mmol/L·h、40～100mV和55～80mg/L，发酵过程中转速控制在200～400rpm，通气比控制在0.3～1.0vvm，罐压控制在0.03～0.07MPa。发酵过程中补加50％甘油控制甘油浓度在1～10g/L。发酵培养至16h时，于发酵液中加入0.04wt％烟酰胺、0.07wt％维生素B12和0.06wt％甲硫氨酸，继续培养至140h后放罐。
每升发酵培养基中含有如下组分：豆饼粉20g、玉米浆5g、氯化钠0.4g、硫酸镁0.8g、磷酸氢二钠0.5g、氯化锌0.2g、硫酸亚铁0.1g、甘油20g、泡敌0.5g，消前使用氢氧化钠溶液调节pH至7.0。
收集发酵液获得菌体，检测菌体干重16.4g/L，高效液相色谱法检测发酵液中维生素K2含量96mg/L。
实施例16：一种发酵制备维生素K2的方法，发酵培养使用100L发酵罐，包括如下步骤：(1)菌种活化；(2)种子培养；(3)发酵培养。
(1)菌种活化：在无菌条件下，将地衣芽孢杆菌(菌种编号CGMCC1.15832)种子冻存液按照梯度稀释方法接入牛肉膏蛋白胨琼脂培养基内，在37℃下培养24h。
(2)种子培养：从培养好的平板种子挑取单菌落，接入含1％葡萄糖的牛肉膏蛋白胨培养基的1L摇瓶内，之后放置于摇床中，37℃，220rpm培养16h。
(3)发酵培养：将培养好的种子罐种子液以4％接种量接入100L发酵罐中，培养温度为37℃，发酵过程使用氢氧化钠溶液或氨水控制pH值在7.0，发酵全程不对OUR、发酵液中ORP及乳酸浓度进行检测和调控，转速控制在300rpm，通气比控制在0.6vvm，罐压控制在0.05MPa。发酵过程中补加50％甘油控制甘油浓度在1～10g/L。发酵培养至16h时，于发酵液中加入0.04wt％烟酰胺、0.07wt％维生素B12和0.06wt％甲硫氨酸，继续培养至140h后放罐。
每升发酵培养基中含有如下组分：豆饼粉20g、玉米浆5g、氯化钠0.4g、硫酸镁0.8g、磷酸氢二钠0.5g、氯化锌0.2g、硫酸亚铁0.1g、甘油20g、泡敌0.5g，消前使用氢氧化钠溶液调节pH至7.0。
收集发酵液获得菌体，检测菌体干重17.1g/L，高效液相色谱法检测发酵液中维生素K2含量57mg/L。
实施例17：一种发酵制备维生素K2的方法，发酵培养使用160m3发酵罐，包括如下步骤：(1)菌种活化；(2)种子培养；(3)种子扩培；(4)发酵培养。
(1)菌种活化：在无菌条件下，将纳豆枯草芽孢杆菌(菌种编号：ATCC 15245)种子冻存液按照梯度稀释方法接入牛肉膏蛋白胨琼脂培养基内，在30℃下培养20h。
(2)种子培养：从培养好的平板种子挑取单菌落，接入含1％葡萄糖的牛肉膏蛋白胨培养基的2L摇瓶内，之后放置于摇床中，30℃，220rpm培养14h。
(3)种子扩培：将培养好的种子液以1％接种量接入100L种子罐中进行培养，培养温度30℃，通气比0.3vvm，转速250rpm，罐压0.03MPa，培养时间为10h。培养好之后以1％接种量接入5m3种子罐，培养温度30℃，通气比0.3vvm，转速150rpm，罐压0.03MPa，培养时间为8h。
每升种子扩培培养基中含有如下组分：豆饼粉20g、玉米浆10g、磷酸氢二钠0.4g、硫酸镁0.3g、甘油10g、泡敌0.5g，消前使用氢氧化钠溶液调节pH至7.0。
(4)发酵培养：将培养好的种子罐种子液以4％接种量接入160m3发酵罐中，培养温度为30℃，发酵过程使用氢氧化钠溶液或氨水控制pH值在7.0，发酵全程监测OUR的数值，转速、通气量和罐压根据OUR的数值变化而进行调整，发酵0～4h控制OUR水平在30～70mmol/L·h，发酵4～12h控制OUR水平在100～140mmol/L·h，发酵12～24h控制OUR水平在75～120mmol/L·h，发酵24～60h控制OUR水平在50～90mmol/L·h，发酵60～140h控制OUR水平在30～70mmol/L·h，发酵过程中转速控制在70～120rpm，通气比控制在0.3～1.0vvm，罐压控制在0.03～0.07MPa。发酵过程中补加50％甘油控制甘油浓度在1～10g/L。发酵培养至16h时，于发酵液中加入0.04wt％烟酰胺、0.07wt％维生素B12和0.06wt％甲硫氨酸，继续培养至140h后放罐。
每升发酵培养基中含有如下组分：豆饼粉40g、玉米浆10g、氯化钠0.4g、硫酸镁1.2g、磷酸氢二钠0.5g、氯化锌0.2g、硫酸亚铁0.15g、甘油20g、泡敌0.5g，消前使用氢氧化钠溶液调节pH至7.0。
收集发酵液获得菌体，检测菌体干重19.3g/L，高效液相色谱法检测发酵液中维生素K2含量141mg/L。
实施例18：一种发酵制备维生素K2的方法，发酵培养使用160m3发酵罐，包括如下步骤：(1)菌种活化；(2)种子培养；(3)种子扩培；(4)发酵培养。
(1)菌种活化：在无菌条件下，将纳豆枯草芽孢杆菌(菌种编号：ATCC 15245)种子冻存液按照梯度稀释方法接入牛肉膏蛋白胨琼脂培养基内，在30℃下培养20h。
(2)种子培养：从培养好的平板种子挑取单菌落，接入含1％葡萄糖的牛肉膏蛋白胨培养基的2L摇瓶内，之后放置于摇床中，30℃，220rpm培养14h。
(3)种子扩培：将培养好的种子液以1％接种量接入100L种子罐中进行培养，培养温度30℃，通气比0.3vvm，转速250rpm，罐压0.03MPa，培养时间为10h。培养好之后以1％接种量接入5m3种子罐，培养温度30℃，通气比0.3vvm，转速150rpm，罐压0.03MPa，培养时间为8h。
每升种子扩培培养基中含有如下组分：豆饼粉20g、玉米浆10g、磷酸氢二钠0.4g、硫酸镁0.3g、甘油10g、泡敌0.5g，消前使用氢氧化钠溶液调节pH至7.0。
(4)发酵培养：将培养好的种子罐种子液以4％接种量接入160m3发酵罐中，培养温度为30℃，发酵过程使用氢氧化钠溶液或氨水控制pH值在7.0，发酵全程监测发酵液中ORP的数值，转速、通气量和罐压根据发酵液中ORP的数值变化而进行调整，发酵0～4h控制发酵液中ORP水平在80～130mV，发酵4～12h控制发酵液中ORP水平在-60～50mV，发酵12～24h控制发酵液中ORP水平在-40～80mV，发酵24～60h控制发酵液中ORP水平在-20～100mV，发酵60～140h控制发酵液中ORP水平在20～150mV，发酵过程中转速控制在70～120rpm，通气比控制在0.3～1.0vvm，罐压控制在0.03～0.07MPa。发酵过程中补加50％甘油控制甘油浓度在1～10g/L。发酵培养至16h时，于发酵液中加入0.04wt％烟酰胺、0.07wt％维生素B12和0.06wt％甲硫氨酸，继续培养至140h后放罐。
每升发酵培养基中含有如下组分：豆饼粉40g、玉米浆10g、氯化钠0.4g、硫酸镁1.2g、磷酸氢二钠0.5g、氯化锌0.2g、硫酸亚铁0.15g、甘油20g、泡敌0.5g，消前使用氢氧化钠溶液调节pH至7.0。
收集发酵液获得菌体，检测菌体干重18.4g/L，高效液相色谱法检测发酵液中维生素K2含量135mg/L。
实施例19：一种发酵制备维生素K2的方法，发酵培养使用160m3发酵罐，包括如下步骤：(1)菌种活化；(2)种子培养；(3)种子扩培；(4)发酵培养。
(1)菌种活化：在无菌条件下，将纳豆枯草芽孢杆菌(菌种编号：ATCC 15245)种子冻存液按照梯度稀释方法接入牛肉膏蛋白胨琼脂培养基内，在30℃下培养20h。
(2)种子培养：从培养好的平板种子挑取单菌落，接入含1％葡萄糖的牛肉膏蛋白胨培养基的2L摇瓶内，之后放置于摇床中，30℃，220rpm培养14h。
(3)种子扩培：将培养好的种子液以1％接种量接入100L种子罐中进行培养，培养温度30℃，通气比0.3vvm，转速250rpm，罐压0.03MPa，培养时间为10h。培养好之后以1％接种量接入5m3种子罐，培养温度30℃，通气比0.3vvm，转速150rpm，罐压0.03MPa，培养时间为8h。
每升种子扩培培养基中含有如下组分：豆饼粉20g、玉米浆10g、磷酸氢二钠0.4g、硫酸镁0.3g、甘油10g、泡敌0.5g，消前使用氢氧化钠溶液调节pH至7.0。
(4)发酵培养：将培养好的种子罐种子液以4％接种量接入160m3发酵罐中，培养温度为30℃，发酵过程使用氢氧化钠溶液或氨水控制pH值在7.0，发酵全程监测发酵液中乳酸浓度的数值，转速、通气量和罐压根据发酵液中乳酸浓度的数值变化而进行调整，发酵0～4h控制发酵液中乳酸浓度在2～10mg/L，发酵4～12h控制发酵液中乳酸浓度在5～20mg/L，发酵12～24h控制发酵液中乳酸浓度在15～50mg/L，发酵24～60h控制发酵液中乳酸浓度在35～90mg/L，发酵60～140h控制发酵液中乳酸浓度在50～80mg/L，发酵过程中转速控制在70～120rpm，通气比控制在0.3～1.0vvm，罐压控制在0.03～0.07MPa。发酵过程中补加50％甘油控制甘油浓度在1～10g/L。发酵培养至16h时，于发酵液中加入0.04wt％烟酰胺、0.07wt％维生素B12和0.06wt％甲硫氨酸，继续培养至140h后放罐。
每升发酵培养基中含有如下组分：豆饼粉40g、玉米浆10g、氯化钠0.4g、硫酸镁1.2g、磷酸氢二钠0.5g、氯化锌0.2g、硫酸亚铁0.15g、甘油20g、泡敌0.5g，消前使用氢氧化钠溶液调节pH至7.0。
收集发酵液获得菌体，检测菌体干重17.9g/L，高效液相色谱法检测发酵液中维生素K2含量133mg/L。
实施例20：一种发酵制备维生素K2的方法，发酵培养使用120m3发酵罐，包括如下步骤：(1)菌种活化；(2)种子培养；(3)种子扩培；(4)发酵培养。
(1)菌种活化：在无菌条件下，将纳豆枯草芽孢杆菌(菌种编号：ATCC 15245)种子冻存液按照梯度稀释方法接入牛肉膏蛋白胨琼脂培养基内，在30℃下培养20h。
(2)种子培养：从培养好的平板种子挑取单菌落，接入含1％葡萄糖的牛肉膏蛋白胨培养基的2L摇瓶内，之后放置于摇床中，30℃，220rpm培养14h。
(3)种子扩培：将培养好的种子液以1％接种量接入100L种子罐中进行培养，培养温度30℃，通气比0.3vvm，转速250rpm，罐压0.03MPa，培养时间为10h。培养好之后以1％接种量接入5m3种子罐，培养温度30℃，通气比0.3vvm，转速150rpm，罐压0.03MPa，培养时间为8h。
每升种子扩培培养基中含有如下组分：豆饼粉20g、玉米浆10g、磷酸氢二钠0.4g、硫酸镁0.3g、甘油10g、泡敌0.5g，消前使用氢氧化钠溶液调节pH至7.0。
(4)发酵培养：将培养好的种子罐种子液以2％接种量接入120m3发酵罐中，培养温度为30℃，发酵过程使用氢氧化钠溶液或氨水控制pH值在7.0，发酵全程监测OUR的数值，转速、通气量和罐压根据OUR的数值变化而进行调整，发酵0～4h控制OUR水平在20～60mmol/L·h，发酵4～12h控制OUR水平在90～130mmol/L·h，发酵12～24h控制OUR水平在70～100mmol/L·h，发酵24～60h控制OUR水平在50～80mmol/L·h，发酵60～140h控制OUR水平在40～70mmol/L·h，发酵过程中转速控制在70～130rpm，通气比控制在0.3～1.0vvm，罐压控制在0.03～0.07MPa。发酵过程中补加50％甘油控制甘油浓度在1～10g/L。发酵培养至16h时，于发酵液中加入0.04wt％烟酰胺、0.07wt％维生素B12和0.06wt％甲硫氨酸，继续培养至140h后放罐。
每升发酵培养基中含有如下组分：豆饼粉40g、玉米浆10g、氯化钠0.4g、硫酸镁1.2g、磷酸氢二钠0.5g、氯化锌0.2g、硫酸亚铁0.15g、甘油20g、泡敌0.5g，消前使用氢氧化钠溶液调节pH至7.0。
收集发酵液获得菌体，检测菌体干重20.5g/L，高效液相色谱法检测发酵液中维生素K2含量137mg/L。
实施例21：一种发酵制备维生素K2的方法，发酵培养使用120m3发酵罐，包括如下步骤：(1)菌种活化；(2)种子培养；(3)种子扩培；(4)发酵培养。
(1)菌种活化：在无菌条件下，将纳豆枯草芽孢杆菌(菌种编号：ATCC 15245)种子冻存液按照梯度稀释方法接入牛肉膏蛋白胨琼脂培养基内，在30℃下培养20h。
(2)种子培养：从培养好的平板种子挑取单菌落，接入含1％葡萄糖的牛肉膏蛋白胨培养基的2L摇瓶内，之后放置于摇床中，30℃，220rpm培养14h。
(3)种子扩培：将培养好的种子液以1％接种量接入100L种子罐中进行培养，培养温度30℃，通气比0.3vvm，转速250rpm，罐压0.03MPa，培养时间为10h。培养好之后以1％接种量接入5m3种子罐，培养温度30℃，通气比0.3vvm，转速150rpm，罐压0.03MPa，培养时间为8h。
每升种子扩培培养基中含有如下组分：豆饼粉20g、玉米浆10g、磷酸氢二钠0.4g、硫酸镁0.3g、甘油10g、泡敌0.5g，消前使用氢氧化钠溶液调节pH至7.0。
(4)发酵培养：将培养好的种子罐种子液以2％接种量接入120m3发酵罐中，培养温度为30℃，发酵过程使用氢氧化钠溶液或氨水控制pH值在7.0，发酵全程监测发酵液中ORP的数值，转速、通气量和罐压根据发酵液中ORP的数值变化而进行调整，发酵0～4h控制发酵液中ORP水平在80～120mV，发酵4～12h控制发酵液中ORP水平在-60～60mV，发酵12～24h控制发酵液中ORP水平在-40～100mV，发酵24～60h控制发酵液中ORP水平在-10～120mV，发酵60～140h控制发酵液中ORP水平在20～150mV，发酵过程中转速控制在70～130rpm，通气比控制在0.3～1.0vvm，罐压控制在0.03～0.07MPa。发酵过程中补加50％甘油控制甘油浓度在1～10g/L。发酵培养至16h时，于发酵液中加入0.04wt％烟酰胺、0.07wt％维生素B12和0.06wt％甲硫氨酸，继续培养至140h后放罐。
每升发酵培养基中含有如下组分：豆饼粉40g、玉米浆10g、氯化钠0.4g、硫酸镁1.2g、磷酸氢二钠0.5g、氯化锌0.2g、硫酸亚铁0.15g、甘油20g、泡敌0.5g，消前使用氢氧化钠溶液调节pH至7.0。
收集发酵液获得菌体，检测菌体干重21.3g/L，高效液相色谱法检测发酵液中维生素K2含量139mg/L。
实施例22：一种发酵制备维生素K2的方法，发酵培养使用120m3发酵罐，包括如下步骤：(1)菌种活化；(2)种子培养；(3)种子扩培；(4)发酵培养。
(1)菌种活化：在无菌条件下，将纳豆枯草芽孢杆菌(菌种编号：ATCC 15245)种子冻存液按照梯度稀释方法接入牛肉膏蛋白胨琼脂培养基内，在30℃下培养20h。
(2)种子培养：从培养好的平板种子挑取单菌落，接入含1％葡萄糖的牛肉膏蛋白胨培养基的2L摇瓶内，之后放置于摇床中，30℃，220rpm培养14h。
(3)种子扩培：将培养好的种子液以1％接种量接入100L种子罐中进行培养，培养温度30℃，通气比0.3vvm，转速250rpm，罐压0.03MPa，培养时间为10h。培养好之后以1％接种量接入5m3种子罐，培养温度30℃，通气比0.3vvm，转速150rpm，罐压0.03MPa，培养时间为8h。
每升种子扩培培养基中含有如下组分：豆饼粉20g、玉米浆10g、磷酸氢二钠0.4g、硫酸镁0.3g、甘油10g、泡敌0.5g，消前使用氢氧化钠溶液调节pH至7.0。
(4)发酵培养：将培养好的种子罐种子液以2％接种量接入120m3发酵罐中，培养温度为30℃，发酵过程使用氢氧化钠溶液或氨水控制pH值在7.0，发酵全程监测发酵液中乳酸浓度的数值，转速、通气量和罐压根据发酵液中乳酸浓度的数值变化而进行调整，发酵0～4h控制发酵液中乳酸浓度在1～10mg/L，发酵4～12h控制发酵液中乳酸浓度在5～15mg/L，发酵12～24h控制发酵液中乳酸浓度在15～40mg/L，发酵24～60h控制发酵液中乳酸浓度在30～80mg/L，发酵60～140h控制发酵液中乳酸浓度在50～90mg/L，发酵过程中转速控制在70～130rpm，通气比控制在0.3～1.0vvm，罐压控制在0.03～0.07MPa。发酵过程中补加50％甘油控制甘油浓度在1～10g/L。发酵培养至16h时，于发酵液中加入0.04wt％烟酰胺、0.07wt％维生素B12和0.06wt％甲硫氨酸，继续培养至140h后放罐。
每升发酵培养基中含有如下组分：豆饼粉40g、玉米浆10g、氯化钠0.4g、硫酸镁1.2g、磷酸氢二钠0.5g、氯化锌0.2g、硫酸亚铁0.15g、甘油20g、泡敌0.5g，消前使用氢氧化钠溶液调节pH至7.0。
收集发酵液获得菌体，检测菌体干重20.6g/L，高效液相色谱法检测发酵液中维生素K2含量143mg/L。
实施例23～29和对比例1：一种发酵制备维生素K2的方法，与实施例1～3、实施例5～8以及实施例12的不同之处在于，发酵培养至16h，发酵液中不添加烟酰胺、维生素B12和甲硫氨酸，其他实验条件分别同实施例1～3、实施例5～8以及实施例12，放罐后收集发酵液获得菌体，检测菌体干重和维生素K2含量如下表2所示。
表2不同供氧调控方式对维生素K2发酵的影响
| 实施例 | 供氧调控方式 | 菌体干重 | 维生素K2含量 |
| 实施例23 | 同实施例1 | 20.7g/L | 102mg/L |
| 实施例24 | 同实施例2 | 21.2g/L | 105mg/L |
| 实施例25 | 同实施例3 | 20.4g/L | 97mg/L |
| 实施例26 | 同实施例5 | 19.7g/L | 104mg/L |
| 实施例27 | 同实施例6 | 20.1g/L | 99mg/L |
| 实施例28 | 同实施例7 | 21.4g/L | 102mg/L |
| 实施例29 | 同实施例8 | 20.6g/L | 105mg/L |
| 对比例1 | 同实施例12 | 7.9g/L | 24mg/L |
对比例2：一种发酵制备维生素K2的方法，与实施例23的不同之处在于，在发酵培养过程中，发酵全程监测OUR的数值，转速、通气量和罐压根据OUR的数值变化而进行调整，发酵0～4h控制OUR水平在30～60mmol/L·h，发酵4～12h控制OUR水平在40～70mmol/L·h，发酵12～24h控制OUR水平在40～55mmol/L·h，发酵24～60h控制OUR水平在30～50mmol/L·h，发酵60～140h控制OUR水平在20～40mmol/L·h，其他实验条件同实施例23，放罐后收集发酵液获得菌体。检测菌体干重15.0g/L，高效液相色谱法检测发酵液中维生素K2含量59mg/L。
对比例3：一种发酵制备维生素K2的方法，与实施例24的不同之处在于，在发酵培养过程中，发酵全程监测发酵液中ORP的数值，转速、通气量和罐压根据发酵液中ORP的数值变化而进行调整，发酵0～4h控制发酵液中ORP水平在90～120mV，发酵4～12h控制发酵液中ORP水平在-120～-90mV，发酵12～24h控制发酵液中ORP水平在-100～-70mV，发酵24～60h控制发酵液中ORP水平在-50～10mV，发酵60～140h控制发酵液中ORP水平在0～50mV，其他实验条件同实施例24，放罐后收集发酵液获得菌体。检测菌体干重15.5g/L，高效液相色谱法检测发酵液中维生素K2含量64mg/L。
对比例4：一种发酵制备维生素K2的方法，与实施例25的不同之处在于，在发酵培养过程中，发酵全程监测发酵液中乳酸浓度的数值，转速、通气量和罐压根据发酵液中乳酸浓度的数值变化而进行调整，发酵0～4h控制发酵液中乳酸浓度在2～20mg/L，发酵4～12h控制发酵液中乳酸浓度在55～75mg/L，发酵12～24h控制发酵液中乳酸浓度在100～120mg/L，发酵24～60h控制发酵液中乳酸浓度在150～170mg/L，发酵60～140h控制发酵液中乳酸浓度在120～150mg/L，其他实验条件同实施例25，放罐后收集发酵液获得菌体。检测菌体干重12.1g/L，高效液相色谱法检测发酵液中维生素K2含量42mg/L。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (8)
1.一种采用微生物发酵法制备维生素K2的方法，其特征在于，该方法包括在发酵培养阶段，分阶段将OUR、发酵液中ORP及乳酸浓度中的至少一者控制在预定范围内；和，在发酵培养5～20h后，往发酵液中加入辅料，所述辅料包括烟酰胺、维生素B12和甲硫氨酸；所述发酵所采用的菌种选自纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)、黄杆菌(Flavobacterium)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)和地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)中的至少一种；
分阶段控制OUR的方式如下：发酵0～4h OUR控制在20～80mmol/L·h，4～12h OUR控制在80～160mmol/L·h，12～24h OUR控制在60～140mmol/L·h，24～60h OUR控制在40～100mmol/L·h，60～140h OUR控制在20～90mmol/L·h；
分阶段控制发酵液中ORP的方式如下：发酵0～4h发酵液中ORP控制在60～150mV，4～12h发酵液中ORP控制在-80～100mV，12～24h发酵液中ORP控制在-50～120mV，24～60h发酵液中ORP控制在-20～160mV，60～140h发酵液中ORP控制在20～220mV；
分阶段控制发酵液中乳酸浓度的方式如下：发酵0～4h发酵液中乳酸浓度控制在1～20mg/L，4～12h发酵液中乳酸浓度控制在5～50mg/L，12～24h发酵液中乳酸浓度控制在10～100mg/L，24～60h发酵液中乳酸浓度控制在30～150mg/L，60～140h发酵液中乳酸浓度控制在50～100mg/L。
2.根据权利要求1所述的采用微生物发酵法制备维生素K2的方法，其特征在于，在发酵培养阶段，在线监测OUR、发酵液中ORP及乳酸浓度中的至少一者，并在发酵的不同阶段通过调整空气流量、转速及罐压中的至少一者而实现对OUR、发酵液中ORP及乳酸浓度中的至少一者进行分阶段调控。
3.根据权利要求1或2所述的采用微生物发酵法制备维生素K2的方法，其特征在于，所述烟酰胺的添加比例为0.01～0.1wt％。
4.根据权利要求1或2所述的采用微生物发酵法制备维生素K2的方法，其特征在于，所述维生素B12的添加比例为0.03～0.15wt％。
5.根据权利要求1或2所述的采用微生物发酵法制备维生素K2的方法，其特征在于，所述甲硫氨酸的添加比例为0.03～0.1wt％。
6.根据权利要求1或2所述的采用微生物发酵法制备维生素K2的方法，其特征在于，所述发酵培养的温度为28～40℃，pH值为6.0～7.5，种子液接种量为1～5％。
7.根据权利要求1或2所述的采用微生物发酵法制备维生素K2的方法，其特征在于，所述发酵培养所用发酵罐的容积为0.5L至500m3。
8.根据权利要求1或2所述的采用微生物发酵法制备维生素K2的方法，其特征在于，该方法还包括在发酵过程中补加甘油以将发酵体系中甘油浓度控制在1～10g/L。
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