CN113564071A - 一种生产甲萘醌-7的纳豆芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种生产甲萘醌‑7的纳豆芽孢杆菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.21799。该菌种营养物质需求少、产量高、代谢温和、易于调控、适合产业化放大。

Description

一种生产甲萘醌-7的纳豆芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种生产甲萘醌-7的纳豆芽孢杆菌及其应用。
背景技术
维生素K2(2-甲基-3-全反式-聚戊烯-1,4-萘醌)或甲萘醌类是一族异戊烯基衍生物。由5 个碳原子组成的异戊二烯残基的数量可用于区分甲萘醌系化合物。其命名规则是基于异戊二烯基的数量，例如“甲萘醌”或“MK”之后加上基团的数量。尽管甲萘醌侧链上已经被发现最多达到15个异戊二烯基，但在人类和动物组织中出现的只有含有2到13个异戊二烯基的甲萘醌。脱甲基化的甲萘醌，即在2号碳原子位点上未结合的甲萘醌也已经被发现。
维生素K2的一般性名称或常用名为甲萘醌(Menaquinone)，其基本成分为甲萘醌-4(MK-4) 和甲萘醌-7(MK-7)。已知MK-7是活性最强的维生素K2中的一种。
现有技术中生产MK-7的方法有：(1)化学合成法，该方法需要用到有机溶剂，不仅对环境、操作人员不够友好，而且所得产品中有有机溶剂残留，产品中顺反式结构的MK-7共存； (2)从固体发酵纳豆中提取，纳豆中MK-7含量极低，没有市场竞争力；(3)用天然纳豆菌液体发酵的方法获得，该方法周期长，产量低。
在利用纳豆芽孢杆菌发酵生产MK-7过程中，原始菌种生长代谢非常旺盛，非常容易形成大量芽孢导致产物合成停止，为了解决这一问题，必须提供大量的营养物质消耗，这使得对于生长和代谢的调控非常困难。并且这些被大量消耗的营养物质被大量转化为副产物导致发酵液粘稠，一方面不利于氧气进入发酵液，使得溶氧不易控制，另一面后续分离提纯困难。另外，发酵设备及培养条件(譬如溶氧)差异导致工艺重复性非常差。上述这些原因使得规模化生产难以实现。
发明内容
为了获得产量高、营养物质需求少、代谢温和、易于调控、适合产业化放大的纳豆芽孢杆菌，本发明提供了一种纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)HDCC00023，于2021年02月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.21799，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
一种所述纳豆芽孢杆菌的用途，用于制备甲萘醌-7；
或者，用于制备含甲萘醌-7的药品、保健品、食品、饮料、化妆品、添加剂、饲料中的一个或多个。
一种含有所述纳豆芽孢杆菌的发酵液。
一种所述发酵液的用途，用于制备甲萘醌-7；
或者，用于制备含甲萘醌-7的药品、保健品、食品、饮料、化妆品、添加剂、饲料中的一个或多个。
一种用所述纳豆芽孢杆菌生产甲萘醌-7的发酵方法。
优选地，包括在含有可同化的碳源和/或氮源的发酵培养基里，进行发酵。
优选地，所述可同化的碳源选自淀粉、麦芽糊精、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、工业糖蜜、甘油、豆油、山梨醇、甘露醇之一或者任意几种的组合；优选为甘油、淀粉。
优选地，所述可同化的氮源选自酵母抽提粉、酵母粉、酵母膏、大豆卵磷脂、黄豆饼粉、棉籽饼粉、花生饼粉、麸质粉、玉米浆干粉、豆粕、蛋白胨、尿素、铵盐之一或者任意几种的组合；优选为大豆蛋白胨。
优选地，所述发酵培养基还包括无机盐，所述无机盐选自柠檬酸三钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸铵、碳酸钙、硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸铜、氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸镁、氯化铁、硫酸锰之一或任意几种的组合；优选为磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钾、氯化钙。
优选地，取种子液在发酵培养基中发酵，控制发酵液的溶氧为不低于5％或者5～15％。
优选地，取种子液在发酵培养基中发酵，维持发酵液的总残糖浓度不低于1.0％或者 1.0～1.5％。
优选地，取种子液在发酵培养基中发酵，发酵温度不低于10℃，或者不低于20℃，或者为20～60℃，或者为20～50℃，或者为20～40℃，或者为30～50℃，或者为30～40℃，或者为 35～40℃，或者为37℃。
优选地，所述发酵时间不低于12h、或者不低于1天、或者不低于2天、或者不低于3天、或者不低于4天、或者不低于5天、或者不低于6天，更优选地为7天。
优选地，所述种子液为一级种子液或二级种子液。
优选地，所述一级种子的制备方法为，取活化好的单菌落，刮取菌落，然后接种到三角瓶中，摇床上振荡培养，控制OD值≥4.0；所述二级种子的制备方法为，取一级种子，接种到种子罐中，控制溶氧≥40％，控制OD值≥6.0。
优选地，所述一级种子的制备方法为，取活化好的单菌落，刮取菌落，然后接种到三角瓶中，摇床上振荡培养，控制OD值≥4.0，培养温度不低于10℃，或者不低于20℃，或者为20～60℃，或者为20～50℃，或者为20～40℃，或者为30～50℃，或者为30～40℃，或者为35～40℃，或者为37℃，培养时间不低于0.5h、或不低于1h、或不低于2h、或不低于3h、或不低于4h、或不低于5h、或不低于6h、或不低于7h、或为8h；
优选地，所述二级种子的制备方法为，取一级种子，接种到种子罐中，控制溶氧≥40％，控制OD值≥6.0，培养温度不低于10℃、或者不低于20℃、或者为20～60℃、或者为20～50℃、或者为20～40℃、或者为30～50℃、或者为25～45℃、或者为30～45℃、或者为30～40℃、或者为35～45℃、或者为35～40℃、或者为37℃，培养时间不低于0.5h、或不低于1h、或不低于2h、或不低于3h、或不低于4h、或不低于5h、或不低于6h、或为7h、或为8h。
优选地，所述二级种子的制备方法为，取一级种子，接种到种子罐中，罐压0.05Mpa，控制溶氧≥40％，控制OD值≥6.0。
优选地，所述二级种子的制备方法为，取一级种子，接种到种子罐中，罐压0.05Mpa，空气流量1vvm，控制溶氧≥40％，控制OD值≥6.0。
优选地，所述二级种子的制备方法为，取一级种子，以0.02～0.2％(V/W)的比例接种到种子罐中。更优选的比例为0.05％(V/W)。
优选地，所述发酵培养基，按照质量百分比，包括甘油2％，可溶性淀粉5％，大豆蛋白胨 2％。
优选地，所述发酵方法还包括加入补料培养基。
优选地，所述补料培养基，按照质量百分比，包括麦芽糊精30％，大豆蛋白胨10％。
优选地，当总糖下降到1.5％以下时，开始补料。
优选地，种子液以4％(V/W)的比例接种到液体发酵培养基的发酵罐中，设定温度37℃，罐压0.05Mpa，空气流量0.7vvm，待溶氧下降到15％以下，控制搅拌，使溶氧为5～15％。当总糖下降到1.5％以下时，开始补料，控制总糖浓度为1.0～1.5％。
有益效果：
1、通过诱变得到本发明的菌种，在消耗营养量极少的情况下，有效转化率显著提高，产出了更多的MK-7；
2、由于料液粘度降低，整个发酵过程溶氧可控，并且由于不需要经常高转速运行，使得机器损耗以及能耗也相应降低；
3、进一步地，由于发酵液的粘度降低，使得后续提纯的难度也相应降低。
4、菌种(HDCC00023)对营养物质消耗更加平和，发酵过程的控制更容易。
5、菌种(HDCC00023)的活力更强，可以实现持续发酵生产。
附图说明
图1为不同菌种50L罐发酵产量、底物消耗、副产物生成量(粘度表征)对比。
图2为不同菌种50L罐发酵过程参数对比。
具体实施方式
下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中采用的材料、试剂等如无特殊说明，皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面将通过实施例对本发明作进一步的描述，这些描述并不是对本发明内容作进一步的限定。本领域的技术人员应理解，对本发明内容所作的等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。
以下实施例所使用的培养基中，物料配比所用的百分数(％)计量单位，除特殊说明外均为质量百分比。
实施例1菌种诱变筛选
从常年食用纳豆的成人粪便中分离获得产MK-7的纯菌种(HDCC00001)。该菌种经16SRNA 测序鉴定为纳豆芽孢杆菌(序列详见SEQ ID NO:1)。以成人粪便为分离源，获得的菌种具有更高的安全性，更适合用于保健品的生产。
取分离获得的原始菌种(HDCC00001)甘油管解冻液0.1ml，接种到50ml LB液体培养基中， 37℃培养过夜，种子液用终浓度为0.2％的氯化锂诱变30s，用无菌生理盐水梯度稀释至 10-2～10-5后分离于LB固体平板培养基，于37℃恒温避光培养24小时，长出菌落后，用牙签转种到新鲜LB固体培养基上，37℃培养过夜，用接种针接种于装有3ml液体的初筛发酵培养基的试管(15ml)中，37℃，250rpm振摇96小时，加入等体积分析纯异丙醇浸泡，离心后取上清液测定效价，最终获得MK19283菌株，该菌株试管初筛发酵水平为112μg/ml。
取MK19283菌株甘油管，用无菌生理盐水梯度稀释至10-3～10-6后分离于LB固体平板培养基，于37℃恒温培养24小时，长出菌落后，随机挑选40颗菌落，用接种针分别接种一环于装有20ml液体LB培养基的种瓶，37℃、250rpm培养过夜，然后以4％的比例(v/v)接种到装有30ml液体复筛发酵培养基的250ml三角瓶中，37℃，250rpm振摇96小时。取发酵液1ml，加入等体积分析纯异丙醇浸泡，离心后取上清液测定效价。选取高产的菌株，采用上述方法，连续进行自然分离纯化，直到各个菌落发酵水平稳定。连续三轮纯化后，获得菌种(HDCC00003)，该菌株摇瓶最高发酵水平为228μg/ml，40颗单菌落摇瓶发酵水平分布范围为200±10μg/ml。
取HDCC00003菌种甘油管解冻液0.1ml，接种到50ml LB液体培养基中，37℃培养过夜，种子液离心后收集菌体，用生理盐水重悬，菌悬液于15W紫外灯下诱变10s，然后用终浓度为0.2％的氯化锂继续诱变10s。参照上述得到菌种(HDCC00003)的分离纯化方法，获得菌株 (HDCC00023)，该菌株摇瓶最高发酵水平为584μg/ml，40颗单菌落摇瓶发酵水平分布范围为 564±20μg/ml。该菌种已于2021年02月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.21799。
初筛发酵培养基：甘油1％，大豆蛋白胨0.5％，pH7.0，121℃消毒15min，3ml/15ml。
复筛发酵培养基：甘油4％，大豆蛋白胨1.5％，pH7.0，121℃消毒20min，30ml/250ml。
实施例2原始菌种(HDCC00001)50L罐发酵试验
1、菌种活化
取原始菌种(HDCC00001)甘油管，在室温下解冻，吸取0.1ml菌悬液接种到LB固体平板，涂布均匀，置于37℃培养箱内培养16h，得到活化好的单菌落。
2、一级种子制备
取活化好的单菌落，用接种环刮取一环菌落，然后接种到盛有100ml LB液体培养基的 500ml三角瓶中，包扎好置于37℃、250rpm的摇床上振荡培养8h，控制种子液OD值≥4.0。
LB液体培养基消毒前调pH至7.0，消毒条件为121～123℃、30min。
3、二级种子制备
取培养合格的一级种子，以0.05％(V/W)的比例接种到装有10L的LB液体培养基的种子罐中，设定温度37℃，罐压0.05Mpa，空气流量1vvm，初始搅拌100rpm，搅拌联动控制溶氧≥40％，培养周期7h，控制种子液OD值≥6.0。
LB液体培养基消毒前调pH至7.0，消毒条件为121～123℃、保压30min。
4、发酵培养
取培养合格的二级种子，以4％(V/W)的比例接种到装有30L液体发酵培养基的发酵罐中，设定温度37℃，罐压0.05Mpa，空气流量0.7vvm，初始搅拌150rpm，待溶氧下降到15％以下，开启搅拌联动，控制溶氧5～15％。维持总残糖浓度1.0～1.5％，发酵周期为7天。
液体发酵培养基配方组成为：甘油2％，可溶性淀粉5％，大豆蛋白胨2％，消毒前调pH至 8.0，消毒条件为121～123℃、保压30min。
5、发酵过程指标监测
自发酵开始，每12h取样测定总糖、氨基氮、效价，并完成补料量统计记录。
根据菌种的发酵过程和结果，以及参考图1和图2，菌种(HDCC00001)发酵3天时最高效价20.3μg/ml，之后溶氧快速回升，CER(指生物发酵过程中培养物的二氧化碳释放量)完全掉零，镜检发现形成大量芽孢，效价不再增长。通过大量补料，CER出现回升，溶氧下降，说明菌体活力得到恢复，但是效价仍无法有效增长，甚至出现倒跌。与此同时，副产物在持续积累，导致料液粘度随着发酵培养周期的延长持续增加，导致发酵液传质效果更差。
实施例3：诱变菌种(HDCC00003)50L罐发酵试验
除了菌种为诱变菌种(HDCC00003)外，其它同实施例2。
根据菌种的发酵过程和结果，以及参考图1和图2，菌种(HDCC00003)发酵周期可以延长至4天，此时最高效价124μg/ml。发酵中前期，碳氮源被迅速消耗，溶氧快速掉零，搅拌最大转速运行，补料量呈直线上升。镜检结果显示，补料量的增加有效避免了芽孢的形成，但是仍然无法维持效价增长的速度。此外，发酵过程搅拌、溶氧、CER曲线显示，84h后发酵参数出现反复波动，说明氯化锂诱变后得到的菌种虽然效价提高，但是菌种发酵过程稳定性差，难以进行等比例放大控制。
实施例4诱变菌种(HDCC00023)50L罐发酵试验
除了菌种为诱变菌种(HDCC00023)外，其它同同实施例2。
根据菌种的发酵过程和结果，以及参考图1和图2，菌种(HDCC00023)有效发酵周期可以持续7天，发酵效价可以维持持续增长，最高达到526μg/ml，成功表达出了该菌种在摇瓶上表现出的生产能力。通过效价与累积补料之间的对比发现，与菌种(HDCC00003)和菌种(HDCC00001)相比，菌种(HDCC00023)消耗最少的营养物质而产出最多的MK-7。而料液粘度维持在100cps左右水平，则表明副产物的形成得到有效控制。即菌种(HDCC00023)在消耗营养量极少的情况下，有效转化率显著提高，产出了更多的MK-7。
料液粘度降低导致氧气进入发酵液难度降低，使得通过搅拌来控制溶氧更加容易，不需要经常提高搅拌速度来维持溶氧，维持在400rpm左右就可以达到所需溶氧量，整个发酵过程溶氧可控。并且由于不需要经常高转速运行，使得机器损耗以及能耗也相应降低。进一步地，由于发酵液的粘度降低，使得后续提纯的难度也相应降低。
由于CER相对稳定，镜检整个过程也未形成大量芽孢，表明菌种(HDCC00023)的活力更强，可以实现持续发酵产。另外pH的波动幅度可以反映菌种代谢营养物质的稳定性，pH波动幅度小反映出菌种(HDCC00023)对营养物质消耗更加平和，因此与其它菌种相比，菌种(HDCC00023)发酵过程的控制更容易。
实施例5诱变菌种(HDCC00023)30吨(T)罐发酵试验
1、菌种活化
取生产菌种(HDCC00023)工作甘油管，在室温下解冻，吸取0.1ml菌悬液接种到LB固体平板，涂布均匀，置于37℃培养箱内培养16h，得到活化好的单菌落。
2、一级种子制备
取活化好的单菌落，用接种环刮取一环菌落，然后接种到盛有500ml LB液体培养基的 2800ml三角瓶中，包扎好置于37℃、220rpm的摇床上振荡培养8h，控制种子液OD值≥4.0。
LB液体培养基消毒前调pH至7.0，消毒条件为121～123℃、30min。
3、二级种子制备
取培养合格的一级种子，以0.05％(V/W)的比例接种到装有2吨LB液体培养基的种子罐中，设定温度37℃，罐压0.05Mpa，空气流量1vvm，初始搅拌100rpm，搅拌联动控制溶氧≥40％，培养周期7h，控制种子液OD值≥6.0。
LB液体培养基消毒前调pH至7.0，消毒条件为121～123℃、保压30min。
4、发酵培养
取培养合格的二级种子，以4％(V/W)的比例接种到装有20吨液体发酵培养基的发酵罐中，设定温度37℃，罐压0.05Mpa，空气流量0.7vvm，初始搅拌80rpm，待溶氧下降到15％以下，开启搅拌联动，控制溶氧5～15％。控制总糖浓度为1.0～1.5％，发酵周期为7天。
液体发酵培养基配方组成为：甘油2％，可溶性淀粉5％，大豆蛋白胨2％，消毒前调pH 至8.0，消毒条件为121～123℃、保压30min。
发酵培养结果显示，菌种(HDCC00023)在按照比例放大到30T规模后，工艺稳定可控，重现性好，有效发酵周期可以持续7天以上，发酵效价达到384μg/ml。
综上所述，菌种(HDCC00023)的效价远高于菌种(HDCC00003)和菌种(HDCC00001)，发酵效价可以维持持续增长，副产物的形成得到有效控制，生长代谢温和，整个发酵过程溶氧可控，对营养物质的投料控制更容易，工艺稳定性好，适合产业化放大。从根本上解决了MK-7产业化过程中放大困难(工艺调控重复性差)、底物有效转化率低、生产成本高的关键性难题，以及降低了发酵液的提纯难度。
现有技术中存在多种利用纳豆芽孢杆菌生产MK-7的发酵方法，以上的实施例仅用于示例性说明本发明提供的纳豆芽孢杆菌所采用的发酵方法。可以理解的是，获知本发明提供的纳豆芽孢杆菌后，本领域技术人员可以利用本发明提供的纳豆芽孢杆菌发酵生产MK-7和其它产物(如种子液、发酵液、发酵产物、菌渣)，以及利用本发明提供的纳豆芽孢杆菌或其生产的MK-7或其它产物生产其它产品，如制造药品、保健品、食品、饮料、化妆品、添加剂、饲料。
序列表
<110> 浙江珲达生物科技有限公司
<120> 一种生产甲萘醌-7的纳豆芽孢杆菌及其应用
<130> P0102021070558
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1398
<212> DNA
<213> Bacillus natto
<400> 1
tgcaagtcga gcggacagat gggagcttgc tccctgatgt tagcggcgga cgggtgagta 60
acacgtgggt aacctgcctg taagactggg ataactccgg gaaaccgggg ctaataccgg 120
atggttgttt gaaccgcatg gttcaaacat aaaaggtggc ttcggctacc acttacagat 180
ggacccgcgg cgcattagct agttggtgag gtaacggctc accaaggcaa cgatgcgtag 240
ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga 300
ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga cggagcaacg ccgcgtgagt 360
gatgaaggtt ttcggatcgt aaagctctgt tgttagggaa gaacaagtac cgttcgaata 420
gggcggtacc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc 480
ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg aattattggg cgtaaagggc tcgcaggcgg 540
tttcttaagt ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg agggtcattg gaaactgggg 600
aacttgagtg cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag cggtgaaatg cgtagagatg 660
tggaggaaca ccagtggcga aggcgactct ctggtctgta actgacgctg aggagcgaaa 720
gcgtggggag cgaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgagtgcta 780
agtgttaggg ggtttccgcc cctttagtgc tgcagctaac gcattaagca ctccgcctgg 840
ggagtacggt cgcaagactg aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga 900
gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag aaccttacca ggtcttgaca tcctctgaca 960
atcctagaga taggacgtcc ccttcggggg cagagtgaca ggtggtgcat ggttgtcgtc 1020
agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt gatcttagtt 1080
gccagcattc agttgggcac tctaaggtga ctgccggtga caaaccggag gaaggtgggg 1140
atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac ctgggctaca cacgtgctac aatggacaga 1200
acaaagggca gcgaaaccgc gaggttaagc caatcccaca aatctgttct cagttcggat 1260
cgcagtctgc aactcgactg cgtgaagctg gaatcgctag taatcgcgga tcagcatgcc 1320
gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acaccacgag agtttgtaac 1380
acccgaagtc ggtgaggt 1398

Claims (12)

1.一种纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)HDCC00023，于2021年02月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.21799。
2.一种如权利要求1所述纳豆芽孢杆菌的用途，其特征在于：
用于制备甲萘醌-7；
或者，用于制备含甲萘醌-7的药品、保健品、食品、饮料、化妆品、添加剂、饲料中的一个或多个。
3.一种含有如权利要求1所述纳豆芽孢杆菌的发酵液。
4.一种如权利要求3所述发酵液的用途，其特征在于：
用于制备甲萘醌-7；
或者，用于制备含甲萘醌-7的药品、保健品、食品、饮料、化妆品、添加剂、饲料中的一个或多个。
5.一种用如权利要求1所述纳豆芽孢杆菌生产甲萘醌-7的发酵方法。
6.如权利要求5所述的发酵方法，其特征在于：
包括在含有可同化的碳源和/或氮源的发酵培养基里，进行发酵。
7.如权利要求6所述的发酵方法，其特征在于：
所述可同化的碳源选自淀粉、麦芽糊精、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、工业糖蜜、甘油、豆油、山梨醇、甘露醇之一或者任意几种的组合；优选为甘油、淀粉。
8.如权利要求6所述的发酵方法，其特征在于：
所述可同化的氮源选自酵母抽提粉、酵母粉、酵母膏、大豆卵磷脂、黄豆饼粉、棉籽饼粉、花生饼粉、麸质粉、玉米浆干粉、豆粕、蛋白胨、尿素、铵盐之一或者任意几种的组合；优选为大豆蛋白胨。
9.如权利要求6所述的发酵方法，其特征在于：
所述发酵培养基还包括无机盐，所述无机盐选自柠檬酸三钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸铵、碳酸钙、硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸铜、氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸镁、氯化铁、硫酸锰之一或任意几种的组合；优选为磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钾、氯化钙。
10.如权利要求5～9所述的发酵方法，其特征在于：
取种子液在发酵培养基中发酵，控制发酵液的溶氧为不低于5％或者5～15％。
11.如权利要求5～9所述的发酵方法，其特征在于：
取种子液在发酵培养基中发酵，维持发酵液的总残糖浓度不低于1.0％或者1.0～1.5％。
12.如权利要求5～9所述的发酵方法，其特征在于：
取种子液在发酵培养基中发酵，发酵温度不低于10℃，或者不低于20℃，或者为20～60℃，或者为20～50℃，或者为20～40℃，或者为30～50℃，或者为30～40℃，或者为35～40℃，或
者为37℃。
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