CN114790468A - 一种mk-7的发酵生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)生产MK‑7的发酵工艺,属于微生物发酵领域。本发明在纳豆芽孢杆菌的发酵过程中采用分阶段补加液体脂类,分阶段控制发酵液pH值,分阶段控制残糖含量的工艺,其中补加的液体脂类既可作为碳源利用,又能将发酵液中的MK‑7萃取到油相中,降低反馈抑制从而提高MK‑7产量。利用该工艺进行纳豆芽孢杆菌发酵生产MK‑7产量高,发酵工艺简单可控,有利于MK‑7的工业化扩大生产。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵领域,具体涉及一种纳豆芽孢杆菌的液体深层发酵工艺,更具体涉及一种利用纳豆芽孢杆菌进行液体发酵生产MK-7的方法。
背景技术
维生素K2(Menaquinone,MK,VK2)是一类甲萘醌类化合物的统称,化学结构式为2-甲基-3-烯基-1,4-萘醌,根据C-3侧链上异戊二烯单元的个数,MK可分为14种,以MK-n表示(n=1-14),代表性的分子是MK-4和MK-7。已知MK-7是活性最强的维生素K2中的一种,其具备功能广泛、活性强大、半衰期长、安全等特点,主要对细胞的生长代谢及防止心脑血管和肾脏血管的钙化起着非常重要的作用。
维生素K2微生物发酵生产菌株主要包括革兰氏阳性菌中的纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)和革兰氏阴性菌中的黄杆菌属(Flavobacterium sp.)。其中纳豆芽孢杆菌主要产维生素K2,又因其菌体本身为益生菌,所产的维生素K2也具有较高的产量和较好的生物相容性,因此是发酵生产维生素K2的优良菌种。但是现有微生物发酵水平相对较低,从而导致成本过高,这是限制纳豆芽孢杆菌发酵生产维生素K2的一个主要原因。因此,研究发酵菌株特性及发酵行为对于提高发酵生产维生素K2的生产性能具有重要意义。
2016年,牟杰等以香菇菌渣复配蛋白胨为氮源(5%)、甘油为碳源(5%),采用高转速(600r/min)、高溶氧量(DO>20%)进行纳豆芽孢杆菌发酵时,VK2收率最高可达35.58mg/L(牟杰等.纳豆芽孢杆菌生产维生素K2的连续发酵工艺优化.《食品工业科技》.2016,第19期)。
2019年,汤贵祥等筛选得到一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens),使用优化后培养基(5%甘油、12%大豆蛋白胨、0.07%磷酸氢二钾、0.02%氯化钙、0.05%七水硫酸镁)进行发酵,VK2产量可达70mg/L以上(汤贵祥,《维生素K2高产菌株的筛选与发酵条件优化》.《食品工业科技》.2019,第24期)。
中国专利ZL201910822357.0:一种维生素k2(MK-7型)的发酵方法,在使用纳豆芽孢杆菌进行发酵的过程中发酵培养基配方为葡萄糖6.0%,甘油3.0%,酵母粉1.2%,大豆蛋白胨1.2%,NaCl 0.28%,KH2PO4 0.05%,MgSO4·7H2O 0.05%,溶剂为水,pH7.0-7.2。发酵过程中流加葡萄糖,补加磷酸、氨水,分阶段严格控制pH,通过调节转速、空气流量、罐压分阶段控制溶氧,发酵液总糖浓度控制在0.3-0.7%左右,发酵单位可达80mg/L。
中国专利申请CN111549079 A:一种采用微生物发酵法制备维生素K2的方法,在纳豆枯草芽孢杆菌发酵过程中,分阶段将OUR、发酵液中ORP及乳酸浓度中的至少一者控制在预定范围内;在发酵培养5~20h后,往发酵液中加入辅料,所述辅料选自烟酰胺、维生素B12和甲硫氨酸中的至少一种,发酵产量可达139mg/L。
虽然众多研究开展了微生物发酵生产VK2的研究,但发酵技术仍不成熟。针对发酵过程中生物量低、生产速率低等问题,本发明对纳豆芽孢杆菌深层液体发酵生产MK-7的发酵条件进行优化,达到提高最终菌体生物量和目标产物产率的目的,以期实现MK-7的大规模工业化生产。
发明内容
本发明的目的是为了克服采用现有的微生物发酵法制备MK-7存在发酵水平普遍偏低、所得发酵产物中MK-7含量较低的缺陷,提供一种能够有效提高发酵水平、所得发酵产物中MK-7含量较高的纳豆芽孢杆菌液体发酵工艺。
本发明发酵工艺利用本公司获得的MK-7高产纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)(原始编号为HDCC00023,该菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC NO.21799)
本发明提供一种MK-7的液体发酵方法,其在发酵过程中,分阶段补加液体脂类。
一种优选技术方案,分阶段补加液体脂类为棉籽油、菜籽油、橄榄油、花生油、玉米油、大豆油,优选大豆油。
更优选技术方案,分阶段补加大豆油为在MK-7发酵效价达到200mg/L以上,补加大豆油使培养基中大豆油浓度为0.5~2%;在发酵效价达到400mg/L以上,再次补加大豆油使培养基中大豆油浓度为0.5~2%。
一种优选技术方案,在发酵过程中,分阶段控制发酵液pH值。
优选技术方案,在发酵过程中,通过补入NaOH溶液,分阶段控制发酵液pH值。
更优选技术方案,在发酵过程中,补入NaOH溶液将发酵液pH值分阶段控制在以下范围,发酵0~2天,pH值6.6~7.1;发酵2~4天,pH值7.0~7.3;发酵4天~放罐前,pH值7.0~7.5。
一种优选技术方案,在发酵过程中,分阶段控制发酵液碳源浓度。
优选技术方案,在发酵过程中,通过补入蔗糖溶液,分阶段控制发酵液残糖浓度。
更优选技术方案,在发酵过程中,补入蔗糖溶液将发酵液蔗糖残糖分阶段控制在以下范围,发酵0~2天,残糖≥1.5%;发酵2~4天,残糖1.0±0.5%;发酵4~6天,残糖≤1.0%;发酵6天~放罐前,残糖≤0.5%。
一种优选技术方案,如前所述发酵方法为纳豆芽孢杆菌的发酵,纳豆芽孢杆菌优选HDCC00023。
本发明提供一种包含MK-7的发酵液,发酵液通过上述任一所述的发酵方法产生。
本发明提供一种制备MK-7的方法,通过得到前述所述的MK-7发酵液,随后进行纯化。
本发明提供一种制备包含MK-7的药品、保健品、食品、饮料、化妆品、添加剂、饲料的方法,制备MK-7的方法如前所述的制备方法。
本发明提供了一种利用纳豆芽孢杆菌液体深层发酵生产MK-7的生产工艺,其优点主要体现在:(1)发酵所产MK-7效价可达到500mg/L以上,相对于现有技术有了大幅度提高;(2)该纳豆芽孢杆菌发酵工艺简单可控,有利于工业化扩大生产。
附图说明
图1实施例1发酵效价增长趋势图
图2实施例1放罐发酵液HPLC图谱
具体实施方式
下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中采用的材料、试剂等如无特殊说明,皆为普通市售品,皆可于市场购得。
本发明发酵工艺利用本公司获得的MK-7高产纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)(原始编号为HDCC00023,该菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC NO.21799)
下面将通过实施例对本发明作进一步的描述,这些描述并不是对本发明内容作进一步的限定。本领域的技术人员应理解,对本发明内容所作的等同替换,或相应的改进,仍属于本发明的保护范围之内。
以下实施例所使用的培养基中,物料配比所用的百分数(%)计量单位,除特殊说明外均为质量体积百分比。
实施例1
按照本方案所述发酵方法,发酵罐容量为50升罐,发酵液运行装液量为30L。具体方法如下:
1、菌种复苏活化:
取工作菌种甘油管,在室温下解冻,吸取0.1ml菌悬液接种到LB固体平板,涂布均匀,置于37℃培养箱内培养16h,得到活化好的单菌落。
2、液体种子制备:
取活化好的单菌落,用接种环刮取一环菌落,然后接种到盛有500ml LB液体培养基的2800ml三角瓶中,包扎好置于37℃、220rpm的摇床上振荡培养8h,控制种子液OD值≥4.0。
LB液体培养基消毒前调pH至7.0,消毒条件为121~123℃、30min。
3、发酵罐种子液制备:
将种子液按照0.05~1.0%百分比接入盛有LB培养基的种子罐中,培养温度37℃,溶氧控制大于30%,空气流量1.0VVM,初始搅拌转速200rpm,培养5~15h,控制种子液OD600nm≥10。
LB液体培养基消毒前调pH至7.0,消毒条件为121~125℃、30min。
4、发酵罐培养:
取培养合格的液体种子,以10%(V/V)的比例移种到装有27L优化液体发酵培养基的50L罐中,培养温度37℃,提供高纯氧气,控制溶氧大于10%,初始空气流量1.0VVM,初始搅拌转速200rpm,培养6~9天。
液体发酵培养基配方组成为:蔗糖6%,胰蛋白胨2%,VE干粉0.5%,七水硫酸镁0.02%,磷酸氢二钾0.03%,碳酸钙0.3%,消毒前调pH至7.5,消毒条件为121~125℃、30min。
5、发酵罐补料工艺:
(1)培养过程中,通过补入50%蔗糖,控制发酵液中蔗糖浓度范围为:发酵0-2d,残糖≥1.5%;发酵2-4d,残糖1.0±0.5%;发酵4-6d,残糖≤1.0%;发酵6d-放罐前,残糖≤0.5%。
(2)培养过程中,通过补入NaOH溶液,控pH在以下范围:发酵0-2d,6.6-7.1;发酵2-4d,7.0-7.3;发酵4d-放罐前,7.0-7.5。
(3)培养过程中,在发酵效价达到200mg/L以上,补加大豆油使培养基中大豆油浓度为0.5~2%;在发酵效价达到400mg/L以上,再次补加大豆油使培养基中大豆油浓度为0.5~2%。
6、样品处理:取发酵液1ml,加入等体积分析纯异丙醇浸泡,离心后取上清液,进行液相色谱分析。
7、液相分析方法:
色谱柱:ZORBAX Eclipse Plus C8(4.6mm×50mm,1.8μm)
检测波长:270nm
流动相:0.05%三氟乙酸甲醇溶液
流速:1.0mL/min
柱温:60℃
进样体积:5μL
运行时间:3min
8、实验结果:
以已知浓度MK-7对照品作为标准,根据标准浓度、峰面积、样品峰面积进行计算得到样品浓度,结果确认该实施方案所得发酵液中MK-7含量为527mg/L。(效价增长趋势及HPLC图谱,见附图)
实施例2
1、种子液制备同实施例1。
2、发酵培养:
液体发酵培养基配方组成为:蔗糖6%,胰蛋白胨2%,VE干粉0.1%,七水硫酸镁0.02%,磷酸氢二钾0.03%,碳酸钙0.3%,消毒前调pH至7.5,消毒条件为121~125℃、30min。
取培养合格的液体种子,以10%(V/V)的比例移种到装有27L优化液体发酵培养基的50L罐中,培养温度37℃,溶氧控制大于10%,初始空气流量1.0VVM,初始搅拌转速200rpm。发酵过程中分阶段补加大豆油(补加方案同实施例1),流补蔗糖(控制方案同实施例1),并用氢氧化钠溶液控制发酵液pH值(控制方案同实施例1),培养6~9天。
发酵结束,发酵液中的MK-7含量为487mg/L。
实施例3
1、种子液制备同实施例1中的方式
2、发酵培养:
液体发酵培养基配方组成为:蔗糖6%,胰蛋白胨2%,VE干粉1%,七水硫酸镁0.02%,磷酸氢二钾0.03%,碳酸钙0.3%,消毒前调pH至7.5,消毒条件为121~125℃、30min。
取培养合格的液体种子,以10%(V/V)的比例移种到装有27L优化液体发酵培养基的50L罐中,培养温度37℃,溶氧控制大于10%,初始空气流量1.0VVM,初始搅拌转速200rpm。发酵过程中分阶段补加大豆油(补加方案同实施例1),流补蔗糖(控制方案同实施例1),并用氢氧化钠溶液控制发酵液pH值(控制方案同实施例1),培养6~9天。
发酵结束,发酵液中的MK-7含量为503mg/L。
实施例4
1、种子液制备同实施例1。
2、发酵培养:
液体发酵培养基配方组成为:蔗糖6%,胰蛋白胨2%,VE干粉0.5%,七水硫酸镁0.02%,磷酸氢二钾0.03%,碳酸钙0.3%,消毒前调pH至7.5,消毒条件为121~125℃、30min。
取培养合格的液体种子,以10%(V/V)的比例移种到装有27L优化液体发酵培养基的50L罐中,培养温度37℃,溶氧控制大于10%,初始空气流量1.0VVM,初始搅拌转速200rpm。发酵过程中流补蔗糖(控制方案同实施例1),并用氢氧化钠溶液控制发酵液pH值(控制方案同实施例1),培养4~7天。
发酵结束,发酵液中的MK-7含量为407mg/L。
综上所述,MK-7为脂溶性产物,目前市面上最常见的剂型之一即为油剂。在VK2发酵培养过程中适量补加大豆油,一方面豆油可作为C源利用,同时将发酵清液中的VK2萃取到油相中,降低反馈抑制作用,增加产量。利用本发明的液体深层发酵工艺对纳豆芽孢杆菌进行发酵,MK-7发酵效价可以维持持续增长,副产物的形成得到有效控制,生长代谢温和,工艺稳定性好,适合产业化放大。从根本上解决了MK-7产业化过程中放大困难(工艺调控重复性差)、底物有效转化率低、生产成本高的关键性难题,以及降低了发酵液的提纯难度。
可以理解的是,获知本发明提供的纳豆芽孢杆菌液体深层发酵工艺后,本领域技术人员可以利用本发明提供的工艺生产MK-7和其它产物(如种子液、发酵液、发酵产物、菌渣),以及利用本发明提供的发酵工艺生产的MK-7或其它产物生产其它产品,如制造药品、保健品、食品、饮料、化妆品、添加剂、饲料。
Claims (14)
1.一种MK-7的液体发酵方法,其特征在于:在发酵过程中,分阶段补加液体脂类。
2.如权利要求1所述的发酵方法,其特征在于:所述液体脂类为棉籽油、菜籽油、橄榄油、花生油、玉米油、大豆油,优选大豆油。
3.如权利要求2所述的发酵方法,其特征在于:在发酵过程中,分阶段补加大豆油为在MK-7发酵效价达到200mg/L以上,补加大豆油使培养基中大豆油浓度为0.5~2%;在发酵效价达到400mg/L以上,再次补加大豆油使培养基中大豆油浓度为0.5~2%。
4.如权利要求1至3任一所述的发酵方法,其特征在于:在发酵过程中,分阶段控制发酵液pH值。
5.如权利要求4所述的发酵方法,其特征在于:在发酵过程中,通过补入碱性溶液分阶段控制发酵液pH值,碱性溶液优选NaOH溶液。
6.如权利要求5所述的发酵方法,其特征在于:在发酵过程中,补入NaOH溶液将发酵液pH值分阶段控制在以下范围,发酵0~2天,pH值6.6~7.1;发酵2~4天,pH值7.0~7.3;发酵4天~放罐前,pH值7.0~7.5。
7.如权利要求1至3任一所述的发酵方法,其特征在于:在发酵过程中,分阶段控制发酵液碳源浓度。
8.如权利要求7所述的发酵方法,其特征在于:在发酵过程中,通过补入蔗糖溶液分阶段控制发酵液残糖浓度。
9.如权利要求8所述的发酵方法,其特征在于:在发酵过程中,补入蔗糖溶液将发酵液蔗糖残糖分阶段控制在以下范围,发酵0~2天,残糖≥1.5%;发酵2~4天,残糖1.0±0.5%;发酵4~6天,残糖≤1.0%;发酵6天~放罐前,残糖≤0.5%。
10.如权利要求1所述的发酵方法,其特征在于:所述发酵方法为纳豆芽孢杆菌的发酵。
11.如权利要求10所述的发酵方法,其特征在于:所述的纳豆芽孢杆菌为HDCC00023。
12.一种包含MK-7的发酵液,其特征在于:所述发酵液通过权利要求1至11任一项的发酵方法产生。
13.一种制备MK-7的方法,其特征在于:包括通过权利要求1至12任一项的发酵方法产生MK-7发酵液,随后进行纯化。
14.一种制备包含MK-7的药品、保健品、食品、饮料、化妆品、添加剂、饲料的方法,其特征在于:制备MK-7的方法如权利要求13所述。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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