FI71766B - Framstaellning av etanol genom hoegeffektiv bakteriejaesning - Google Patents

Description

1 71766

Etanolin valmistus suuritehoisen bakteerikäymisen avulla Framställning av etanol genom högeffektiv bakteriejäsning

Oheisen keksinnön kohteena on etanolin valmistaminen käymis-tietä. Erityisesti sen kohteena on etanolin valmistaminen bakteerikäymistä käyttävällä menetelmällä, jossa käymistehok-kuus ja tuotteen saanto on paremmat kuin aikaisemmissa alan menetelmissä.

Tavanomainen käymismenetelmä suoritetaan tavanomaisena panos-operaationa käyttämällä fermentoivana oganismina hiivaa. Tehokkuuden parantamiseksi käytetään silloin tällöin painosoperaation muunnelmaa, jossa kierrätetään hiivasoluja sedimentointi-, sentrifugointi- tai ultrasuodatusjärjestelyjen avulla. Tämä panosoperaatio suoritetaan tavallisesti kahdessa vaiheessa. Ensimmäisessä vaiheessa kasvatetaan hiivaa ja tätä kutsutaan kasvuvaiheeksi. Toisessa vaiheessa muodostuu etanolia anaerobi-sesti ja tähän liittyy hapen kuluminen loppuun. Hiiva lisääntyy edelleen anaerobisen etanolin muodostumistapahtuman aikana.

Hiivasiirroste valmistetaan tyypillisesti yhdessä vaiheessa. Hiivan maksimaaliseen lisääntymiseen vaaditaan riittävät määrät hiiltä, typpeä, mineraaliaineita ja happea, pH:n on oltava välillä 3,5 - 4,5 ja lämpötilan välillä 29 - 35°C. Aerobisissa kasvuolosuhteissa muodostuu hiivaa tehokkaammin, mutta näissä olosuhteissa ei muodostu etanolia.

Toinen vaihe on fermentointivaihe, jossa hiiva varsinaisesti tuottaa alkoholia fermentoituvista sokereista. Vaiheessa (1) muodostetulla hiivasiirrosteella siirrostetaan suuri fermentteri, joka on täytetty alustalla, joka voi olla melassi, maissi jne. ja joka on säädetty sopivaan pH-arvoon, lämpötilaan ja sokeri-konsentraatioon. Siirrostusmäärä voi olla 5-20 miljoonaa solua ml kohti. Käymisen aikana voi elävien solujen määrä nousta 150 - 200 miljoonaan soluun ml:ssa. Muodostunutta lämpöä sääde 2 71766 tään jäähdytyskierukoiden avulla. Näillä hiivamäärillä voidaan panoskäymisessä saavuttaa 30 - 70 tunnin kuluessa lopulliseksi etanolikonsentraatioksi noin 9 - 11 % (tilavuus/tilavuus). Hiiva-pitoisuutta nostamalla, kuten tapahtuu soluja kierrätettäessä, voidaan huomattavasti pienentää käymisen loppuun tapahtumiseen kuluvaa aikaa. Esimerkiksi, kun solutiheys on 800 - 1000 miljoonaa solua ml:ssa, on mahdollista pienentää käymisaika 4-10 tunti in.

Vaikka ehdottomat anaerobiset olosuhteet edistävät mahdollisimman suurta etanolin muodostumista hiivan kasvun tiedetään alentuneen. Tässä käymismenetelmässä liittyy kasvu luontaisesti alkoholin muodostumisnopeuteen. Etanolin muodostumisen optimoimiseksi on siten joko tarkasti säädettävä ilmastusta tai alustaan on lisättävä kasvua edistäviä lisäaineita (esimerkiksi ergosterolia tai tyydyttämättömiä rasvahappoja, kuten öljyhappoa).

Oheisessa keksinnössä kuvauksen kohteena on siten etanolin tuotto bakteerikäymisen avulla eikä hiivakäymisen avulla. Menetelmässä käytetään organismia, joka kykenee tuottamaan etanolia, esimerkiksi fermentoivana organismina käytetään Zynomonas-bakteereita. Monia erilaisia Zynomonas mobilis-kantoja voidaan käyttää. Esimerkiksi ATCC 29191, ATCC 10988 jne. Menetelmä käsittää kaksi vaihetta, so. ensimmäisen vaiheen, jossa muodostuu biomassaa, ja toisen vaiheen, jossa muodostuu etanolia. Vastoin alan aikaisempia menetelmiä tapahtuu kasvuvaihe tässä menetelmässä anaero-bisesti ja siihen liittyy etanolin muodostuminen. Z. mobilis-menetelmän käymisvaihe muistuttaa alan aikaisempaa menetelmää siinä suhteessa, että kummatkin tapahtuvat ananerobisissa olosuhteissa. Oheisen menetelmän mukaisessa bakteerimenetelmässä etanolin muodostuminen on kuitenkin oleellisesti kytkeytynyt irti kasvusta (so. biomassan muodostumisesta). Tällaisesta "lepovi1jelmästä" tapahtuvan etanolin muodostumisen aikana vain pieni osa alustasta muuntuu biomassaksi ja etanolia muodostuu maksimaalisesti. Tästä johtuu, että bakteerimene- 3 71766 telmässä voidaan päästä etanolin muodostumiseen ilman kasvua yksinkertaisesti siten, että lisätään fermentoituvaa sokeria. Tämä systeemi kykenee siten tuottamaan korkeammat alkoholipitoisuudet kuin alan aikaisempi menetelmä. Tässä alan aikaisemmassa menetelmässä korkeat alkoholipitoisuudet estävät kasvua ja sen vuoksi alkoholin muodostumista, koska tätä tapahtuu vain rajoitetusti ilman kasvua.

Oheinen keksintö käsittää siten menetelmän valmistaa etanolia käymisen avulla, tunnettu siitä, että mikro-organismia, joka kykenee tuottamaan etanolia, kasvatetaan kahdessa vaiheessa, joissa (i) muodostetaan bakteerisolususpensio yhdessä etanolin kanssa sellaisella etanolin konsentraatioalueella, että se ei oleellisesti estä mikrobisolujen muodostumista mediumissa, joka sisältää typpilähdettä ja hiililähdettä, ja (ii) muodostetaan etanolia ilman bakteerisolujen muodostumista lisäämällä fermentoituvaa sokeria vaiheessa (i) muodostettuun bakteerisolususpensioon.

VAIHE (i)

Zymomonas mobilis'in kasvu tapahtuu vesipitoisessa ravintoalustassa. Medium voi olla joko luonnon ravintoalusta, synteettinen kasvatusalusta tai puolisynteettinen kasvatusalusta, kun vain mukana on mikro-organismien kasvulle sopivaa hiilihyd-raattilähdettä ja välttämättömiä ravinteita. Vaikkakin menetelmän kasvuvaihetta käytetään tavallisesti muodostamaan riittävä määrä biomassaa käymisvaihetta varten, biomassaa voidaan myös kierrättää, mihin samalla liittyy se, että menetelmä vaatii vähemmän välttämättömiä ravinteita.

Olosuhteet, joita voidaan käyttää edistämään Z.mobilis 1 in kasvua, ovat yleisesti: Riittävä hiililähde, riittävä typpi-lähde, kyseeseen tulevat orgaaniset kasvutekijät, riittävä 4 71766 kivennäisainelähde, oleellisesti anaerobiset olosuhteet, viljelmän sekoittaminen, lämpötila välillä 20 - 40°C ja pH välillä 4 - 8.

Sekä menetelmän kasvu- että käymisvaiheiden hiililähteenä voidaan käyttää erilaisia hiilihydraatteja. Näihin hiili-hydraatteihin kuuluvat esimerkiksi sokerit, kuten glukoosi, fruktoosi, sakkaroosi; melassit; tärkkelyshydrolysaatti; selluloosahydrolysaatti jne. Näitä aineita voidaan käyttää joko yksinään tai kahden tai useamman seoksina.

Typpilähteenä voidaan käyttää erilaisia epäorgaanisia tai orgaanisia suoloja tai yhdisteitä, esimerkiksi ammoniumsuoloja, kuten ammoniumkloridia, ammoniumsu1 faattia jne., tai typpeä sisältäviä luonnonaineita, kuten hiivauutetta, kaseiinihydro-lysaattia, maissin liotusvettä jne. tai aminohappoja, kuten glutamiinihappoa. Näitä aineita voidaan myös käyttää joko yksinään tai kahden tai useamman yhdistelminä.

Epäorgaanisiin yhdisteisiin, joita voidaan lisätä kasvatus-alustaan, kuuluvat magnesiumsulfaatti, kaliummonovetyfosfaatti, kaliumdivetyfosfaatti, natriumkloridi , magnesiumsulfaatti, kalsiumkloridi, rautakloridi, magnesiumkloridi, sinkkisulfaatti, kobolttikloridi, kuparikloridi , boraatit, molybdaatit jne .

Orgaanisiin yhdisteisiin, jotka voivat olla menetelmän käytön kannalta toivottavia, kuuluvat esimerkiksi vitamiinit, kuten biotiini, kalsiumpantotenaatti ja vastaavat, tai orgaaniset hapot, kuten sitruunahappo tai aminohapot, kuten glutamiinihappo.

Mikro-organismeja voidaan kasvattaa joko panosviljelmän tai jatkuvatoimisen viljelmän yleisesti tunnetuissa käyttö-olosuhteissa, jolloin kummassakin tapauksessa voidaan käyttää solujen kierrätystä tai olla sitä käyttämättä. Kasvatus tai fermentointi suoritetaan oleellisesti anaerobisissa 5 71766 olosuhteissa sekoittamalla pinnanalaisviljelmää lämpötilassa, esimerkiksi 20 - 40°C ja pH-arvossa esimerkiksi 4,0 - 8,0. Suositeltuja olosuhteita ovat noin 30°C lämpötila ja pH-arvo noin 5,5. Kasvatuksen fermentoinnin aikana voi olla toivottavaa lisätä alustaan eräitä pH:n säätöaineita, kuten natriumhydroksi-dia, suolahappoa tai vastaavaa.

VAIHE (ii)

Menetelmän toisessa vaiheessa muodostetaan fermentoimalla kasvatusliuos, jossa etanolipitoisuus on korkea. Bakteribio-massaa sisältävään kasvatusliuokseen lisätään sellainen määrä lisää hiiltä, että lopullinen etanolikonsentraatio saavuttaa halutun tason. Hiili voidaan lisätä joko erittäin tai jatkuvasti väkevänä liuoksena, mutta sen määrä ei milloinkaan saa olla yli 6 (paino/tilavuus). Menetelmäva iheen (i) yhteydessä on kuvattu vaihtoehdot, joita voidaan käyttää käymisen mahdollisena hiililähteenä.

Fermentointi voi tapahtua nk. fed-batch-menetelmän tai jatkuvatoimisen menetelmän olosuhteissa, jolloin kummassakin tapauksessa on mahdollista kierrättää soluja tai olla kierrättämättä. Hyvälle etanolituotolle sopivia prosessiparametrejä ovat lämpötilat välillä 20 - 40°C, pH välillä 4-8, käymis-liuoksen sekoittaminen ja oleellisesti anaerobiset olosuhteet. Suositeltu lämpötila on noin 28 - 33°C ja suositeltu pH noin 5,5. Vaiheessa (i) kuvattujen pH-säätöaineiden lisääminen voi olla tarvittavaa tai toivottavaa. Anaerobiset olosuhteet voidaan säilyttää kuplittamalla kasvatusliuoksen läpi hidas typpivirta. Fermenttoriin voi olla joskus edullista lisätä vaiheessa (i) kuvattuja lisäravinteita.

Seuraavien keksintöä havainnollistavien esimerkkien avulla on helpompi ymmärtää keksintö.

6 71766

Esimerkki 1 1200 ml käymisalustaa, jolla oli seuraava koostumus, laitettiin 2 litran fermenttoriastiaan:

Glukoosi 10%(paino/tilavuus)

Hiivauute(Difco) 1,5 % KH2P04 0,375 % NH4C1 0,24 %

MgS04 0,15 %

Sitruunahappo 1,5 mM

CaCl2.2HH20 150 jjM

FeCl3.6H20 135 pM

MnCl2.4H20 75 μΜ

ZnS04.7H20 38 jjM

CoC12.6H20 15 μΜ

CuC12.2H20 8 pM

H3B03 8 pM

Mo03 15 μΜ

Biotiini 1,5 mg/L

Ca-pantotenaatti 2,25 mg/L

Tähän käymisalustaan lisättiin 10 ml Zymomonas mobilis ATCC 29191bakteerin siirrosteviljelmää, joka oli kasvatettu koostumukseltaan edellisenlaisessa mediumissa. Kasvatus suoritettiin lämpötilassa 30°C johtamalla viljelmään 0,014 standardi-m^/h suuruinen typpivirta ja sekoittamalla 3000 kierr./min. pH pidettiin arvossa 5,5 2N kaliumhydroksidilla.

15 tunnin kuluttua kasvu oli päättynyt. Bakteerisolujen konsentraatio oli tällöin 4 g/L (kuivapaino) ja etanolin konsentraatio 4,65 % (paino/tilavuus ).

Kasvun päättymisen jälkeen aloitettiin menetelmän toinen vaihe pumppaamalla käymisastiaan 8,5 tunnin aikana vielä 340 g glukoosia liuotettuna 600 ml:aan vettä. Sokeri kului kokonaan 9,5 tunnin kuluessa. Toisen vaiheen lopussa oli 7 71 766 etanolin konsentraatio 11,6 %.

Esimerkki 2 14 litran käymisastiaan laitettiin 12 litraa käymis1iuosta, jonka koostumus oli seuraava:

Glukoosi 10 % (paino/tilavuus)

Hiivauute (Difco) 1,0 % KH2P0^ 0,25 % NH.C1 0,16 %

MgS04 0,1 %

Sitruunahappo 1,0 mM

CaCl2.2H20 100 pM

EeCl3.6H20 90 /jM

MnCl2.4H20 50 pM

ZnS04.7H20 25 μΜ

CoCl2.6H20 10 /uM

CuCl2.2H20 5 μΜ

H3B03 5 /jM

Mo03 10 μΜ

Biotiini 1,0 mg/L

Ca-Pantotenaatti 1,5 mg/L

Edellä mainittuun käymisliuokseen lisättiin 50 ml Zymomonas mobilis ATCC 29191 bakteerin siirrostevi1jelmää, joka oli kasvatettu koostumukseltaan edellä mainitunlaisessa alustassa. Kasvatus suoritettiin lämpötilassa 30°C johtamalla fermentto-riin typpivirta ja sekoittamalla 300 kierr./min. pH pidettiin arvossa 5,5 8N kaliumhydroksidilla.

Kasvun loputtua bakteerisolut otettiin talteen sentrifugoimalla ja suspendoitiin uudelleen uuteen, koostumukseltaan edellä mainitunlaiseen mediumiin, jolloin bakteerisolujen konsentraa-tioksi saatiin 20 g/L.

1200 ml väkevöityä bakteerisolususpensiota laitettiin 2 β 71766 litran käymisastiaan. Menetelmävaihe (ii) aloitettiin lisäämällä fermenttoriin 32 ml 75-prosenttista glukoosiliuosta.

2 tunnin aikana pumpattiin tämän jälkeen käymisastiaan vielä 450 ml 75-prosenttista glukoosia. Sokeri oli käytetty loppuun 2,5 tunnin kuluttua, jolloin etanolikonsentraatio oli 10,1 S.

Menetelmän vaihe (ii) toistettiin vielä neljä kertaa käyttämällä menetelmän vaiheessa (i) tuotettuja bakteerisoluja.

Joka kerta bakteerisolujen käytyä vaiheen (ii) läpi ne otettiin talteen sentrifugoimalla ja suspendoitiin uudelleen 1200 ml:aan uutta, koostumukseltaan edellä mainitunlaista mediumia. Glukoosi lisättiin samalla tavoin kuin edellä on kuvattu solujen kulkiessa ensimmäisen kerran vaiheen (ii) läpi. Kaikissa neljässä samaa biomassaa käyttävässä jaksossa kului glukoosi kokonaan loppuun 2,5 tunnin kuluttua ja kussakin tapauksessa saatiin etanolin konsentraatioksi noin 10 %.

Esimerkki 3

Menetelmävaiheessa (i) suoritettiin 740 ml:n fermenttorissa, joka sisälsi 320 ml esimerkissä 2 kuvattua käymisalustaa, ja vaihe (ii) suoritettiin 2 litran fermenttorissa, joka sisälsi 1740 ml samaa alustaa.

Vaiheen (i) fermenttori siirrostettiin 7 ml:11a Zymomonas mobilis ATCC 29191 bakteerin siirrosteviljelmää, joka oli kasvatettu mediumissa, jonka koostumus on kuvattu esimerkissä 2; vaihe (ii) siirrostettiin 12 ml:lla samaa siirrostevil-jelmää. Kasvatus suoritettiin 30°C:ssa johtamalla fermentto-reihin typpivirta ja sekoittamalla 300 kierr./min. Kummankin fermenttorin pH pidettiin arvossa 5,5 2N kaiiumhydroksidilla.

Kasvun loputtua systeemi tehtiin jatkuvatoimiseksi kahden pumpun avulla. Ensimmäinen pumppu syötti steriiliä mediumia, joka sisälsi 12,6 % glukoosia (muut komponentit kuin esimer- 11 9 71766 kissa 2) 78 ml/tunti. Näissä olosuhteissa oli bakteerisolujen konsentraatio vaiheen (i) fermenttorissa 4,5 g/L, etanoli-konsentraatio oli 5,3 % ja glukoosin jMännöskonsentraatio 0,6 %. Vaiheen (i) fermenttorin tilavuus pidettiin 320 ml:na siirtämällä jatkuvasti kasvatus liuosta vaiheen (ii) fermenttoriin virtausnopeudella 78 ml/tunti. Toinen pumppu syötti vaitieen (ii) fermenttoriin steriiliä 70-p rosent t ist a glukoosiliuosta 24 ml/tunti, jolloin kokonaissyöttö fermenttoriin ja siitä ulos oli 102 ml/tunti. Näissä olosuhteissa oli bakteerisolujen konsentraatio vaiheen (ii) fermenttorissa 4,4 g/L, etanolin konsentraatio 9,9 % ja glukoosin jäännöskon-sentaatio 1,2 %.

Esimerkki 4 Tässä esimerkissä kasvatettiin Zymomonas mobilis ATCC 29191 bakteeria kahdessa fermenttorissa, joita käytettiin sarjassa esimerkissä 3 kuvatulla tavalla. Tässä esimerkissä otettiin kuitenkin talteen toisen fermenttorin poistovirran biomassa ja palautettiin se toiseen fermenttoriin. Biomassa kierrätettiin toiseen fermenttoriin käsittelemällä poistovirta jatkuvatoimisesti Pellicon ultrasuodatuskasetilla U (Millipore Corp.), joka sisälsi 0,58 m HA-tyyppisiä Mi 11ipore-suo da11i-mia. Tässä esimerkiksi käytetty kasvatusliuos oli koostumukseltaan sama kuin esimerkeissä 2 ja 3 paitsi, että hiivauutetta oli 0,5 % (paino/tilavuus). Ensimmäisen fermenttorin (vaihe (i)) vakiotilavuus oli 1600 ml. Siihen syötettiin vakionopeudella 414 ml/h kasvatusliuosta, joka sisälsi glukoosia (131 g/L). Lämpötila ja pH pidettiin vastaavasti arvoissa 30°C ja 5,5. Biomassaan steady-state-konsentraatio ensimäisessä fermenttorissa oli 4,2 g kuiva-ainetta/L ja etanolin konsentraatio oli 5,1 % (paino/tilavuus).

Ensimmäisen fermenttorin poistovirta syötettiin jatkuvatoimi-sesti ja suoraan toiseen fermenttoriin, jota käytettiin vakiotilavuudella 760 ml. Toiseen fermenttoriin syötettiin vakionopeudella 120 ml/h liuos, joka sisälsi 60 paino/tilavuus ίο 717 6 6 glukoosia. Toisen fermenttorin poistovirta käsiteltiin suodatussysteemillä ja solut palautettiin toiseen ferment-toriin. Biomassan määrä toisessa fermenttorissa oli 48 g kuiva-ainetta/litra ja tämä määrä pidettiin jokseenkin vakiona poistamalla biomassaa noin 27 ml/h. Etanolin kon-sentraatio systeemistä poistuvassa soluttomassa suodoksessa oli 10,4 % (paino/tilavuus) ja jäännössokerin määrä oli 1,7 %. Kun kaksivaiheista systeemiä käytettiin siten, että toisessa fermenttorissa biomassan määrä oli suurempi poisto-virran suodattamisen ja biomassan kierrättämisen ansiosta, toisen fermenttorin etanolin tuottokyky kasvoi (muodostunut tuotteen määrä/yksikkötilavuus/yksikköaika).

Claims (18)

1. Fermentointimenetelmä etanolin tuottamiseksi viljelmällä vesipitoisessa väliaineessa Zymomonas-suvun bakteeria, joka kykenee tuottamaan etanolia, kahdessa vaiheessa, jolloin etanolipitoisuus kohotetaan fermentointiväliaineessa pitoisuuteen, joka ylittää yksivaiheisessa bakteerifermentoinnissa saavutetun tason, tunnettu siitä, että (i) ensimmäisessä vaiheessa tuotetaan anaerobisissa olosuhteissa bakteerista Zymomonas-biomassaa, jolloin samalla tuotetaan etanolia pitoisuutena, joka ei oleellisesti inhiboi Zymomonas-solujen muodostusta, väliaineessa joka sisältää typpi- ja hiililähteitä; ja (ii) toisessa vaiheessa tuotetaan anaerobisissa olosuhteissa etanolia oleellisesti muodostamatta Zymomonas-soluja lisäämällä fermentoitavaa sokeria edellisessä kohdassa (i) tuotettuun bakteerisolususpensioon, jolloin sokerin pitoisuus toisessa vaiheessa ei ylitä 6 % tilavuus/volyymi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että bakteerisoluja tuotetaan mineraalisuolaväli-aineessa, joka sisältää NH4+-ioneja ainoana typpilähteenä tai tällaisessa väliaineessa jota on täydennetty orgaanisella typpi lähteellä.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hiililähde bakteerisoluja ja etanolin valmistusta varten on glukoosi, fruktoosi tai sakkaroosi, niiden seos tai polysakkaridihydrolysaatti, joka sisältää yhtä tai useampaa näistä sokereista.

4. Patenttivaatimuksen 1, 2 tai 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että bakteerisolujen ja etanolin muodostus suoritetaan pH-alueella 4 - 8 ja lämpötilassa 20 - 40°C. 12 71 766

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että menetelmän kaksi vaihetta suoritetaan samassa fermenttorissa lisäämällä jatkuvasti fermentoitavaa sokeria bakteerisolujen muodostuksen päätyttyä.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että menetelmän kaksi vaihetta suoritetaan samassa fermenttorissa lisäämällä jaksottain fermentoitavaa sokeria bakteerisolumuodostuksen päätyttyä.

7. Patenttivaatimuksen 5 tai 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että bakteerisoluja otetaan talteen toisen vaiheen jälkeen ja uudelleen suspendoidaan fermentoitavaan sokeriliuokseen ja uudelleen suspendoidut bakteerisolut johdetaan takaisin vaiheeseen (ii).

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että menetelmän kaksi vaihetta suoritetaan kahdessa fermenttorissa, jolloin ensimmäisessä fermenttorissa jatkuvalla viljelyllä tuotetut bakteerisolut jatkuvasti siirretään toiseen vakiotilavuuksiseen fermenttoriin joka mahdollistaa prosessin toisen vaiheen vaatiman fermentoitavan sokerin jatkuvan syötön täydellisen hyväksikäytön.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vakiotilavuusfermenttorista poistetaan osa bakteerisoluista suodattamalla tai sedimentoimalla ja palautetaan tämän jälkeen vaiheeseen (ii).

10. Patenttivaatimuksen 1 tai 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että etanoli saavuttaa pitoisuuden noin 10 - 11 % paino/tilavuus vaiheessa (ii).

11. Patenttivaatimuksen 1 tai 4 mukainen menetelmä, t u n - 13 71 766 n e t t u siitä, että mikro-organismikanta on Zymomonas mobi1is ATCC 29191.

11 71766

12. Patenttivaatimuksen 1 tai 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mikro-organismikanta on Zymomonas mobilis ATCC 10988.

13. Patenttivaatimuksen 1 tai 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että bakteerisolujen ja etanolin tuotanto suoritetaan pH:ssa 5,5 ja lämpötilassa 28 - 33°C.

14. Patenttivaatimuksen 8 tai 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että bakteerisoluja tuotetaan mineraali-suolaväliaineessa, joka sisältää NH4+-ioneja ainoana typpi-lähteenä tai tällaisessa väliaineessa, joka on täydennetty orgaanisella typpilähteellä.

15. Patenttivaatimuksen 8 tai 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hiililähde bakteerisolujen ja etanolin tuotantoon on glukoosi, fruktoosi tai sakkaroosi, niiden seos tai polysakkaridihydrolysaatti, joka sisältää yhden tai useamman näistä sokereista.

16. Patenttivaatimuksen 8 tai 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että bakteerisolujen ja etanolin tuotanto suoritetaan pH-alueella 4 - 8 ja lämpötilassa 20 - 40°C.

17. Patenttivaatimuksen 8 tai 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että etanoli saavuttaa pitoisuuden noin 10 - 11 % paino/tilavuus vaiheessa (ii).

18. Patenttivaatimuksen 8 tai 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mikro-organismikanta on Zymomonas mobi1is ATCC 29191. 71 766