NO161811B - Fremgangsmaate til fremstilling av etanol ved hjelp av fermentering i to trinn. - Google Patents

Abstract

I en fremgangsmåte til fremstilling av etanol. ved help av bakteriefermentering anvendes det en mikroorganisme som er i stand til å fremstille etanol, og fremgangsmåten utfares i to trinn. I det første trinn fremstilles det en bakteriecellesuspensjon sammen med etanol i et etanolkonsentrasjonsområde som ikke vesentlig inhiberer dannelse av mikrobecellene i et medium som inneholder en nitrogen- og en karbonkilde. Etanol fremstilles deretter uten vesentlig bakteriecelle-dannelse ved tilsetning av fermenterbart sukker til bakteriecellesuspensjonen som er fremstilt i det første trinn. Den foretrukne mikroorganisme er et medlem av slekten Zymomonas.

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte

til fremstilling av etanol ved hjelp av fermentering, i et vandig medium, hvor en bakterie av slekten Zymomonas, som er i stand til å danne etanol, dyrkes i to trinn for derved å øke etanolkonsentrasjonen i fermenteringsmediet over etanolkonsentrasjonen i et fermenteringsmedium frembrakt ved dyrking av bakterien i ett trinn.

Den tradisjonelle fremgangsmåte til fermentering utføres

i en konvensjonell satsvis prosess hvor det anvendes gjær som fermenteringsorganisme. For å øke effektiviteten omfatter en variasjon av den satsvise prosess iblant resirkulering av gjærcellene ved hjelp av systemer som sedimentering, sentrifugering eller ultrafiltrering. Vanligvis utføres denne satsvise prosess i to trinn. Det første trinn omfatter formering av gjæren og benevnes veksttrinnet. Det andre trinn omfatter den anaerobiske etanolfremstillingsprosess, som ledsages av minskning av oksygen. Ytterligere formering av gjæren foregår under den anaerobiske etanolfremstillingsprosess.

Typisk fremstilles det et gjærpodestoff i det første trinn. Betingelsene for maksimal gjærereproduksjon er tilstrekkelige mengder, karbon, nitrogen, mineraler og oksygen,

en pH i området 3,5-4,5, samt en temperatur i området 29-35°C. Aerobiske vekstbetingelser danner et system for mer effektiv dannelse av gjær, men det dannes ingen etanol.

Trinn to er fermenteringstrinnet hvor alkoholen dannes

av fermenterbare sukker ved hjelp av gjæren. Gjærpodestoffet som er fremstilt i det første trinn anvendes for å pode en stor fermenteringsbeholder som på forhånd er fylt med mediet,

som kan være melasse, mais etc. regulert til riktig pH, temperatur og sukkerkonsentrasjon. Podestoffmengden kan være 5-10

millioner celler pr. ml, og under fermenteringen kan antallet levedyktige celler øke til 150-200 millioner celler pr. ml. Varme som dannes reguleres ved anvendelse av kjølespiraler. Med disse gjærnivåer kan det oppnås en etanolsluttkonsentra-sjon på 9-11 volumprosent i løpet av 30-70 timer med satsvis fermentering. Økning av gjærinnholdet, som er tilfellet ved celleresirkulering, kan minske tiden som er nødvendig for å fullføre fermenteringen betydelig. F.eks. er det med en celle-tetthet på 800-1000 millioner celler pr. ml mulig å minske fermenteringstiden til 4-10 timer.

Det er fastslått at selv om betingelser med streng anaerobisk tilstand fremmer størst produksjon av etanol, under-trykkes gjærvekst. Forbundet med denne fermenteringsprosess er koplingen av vekst med alkoholfremstillingshastigheten. For å optimalisere etanolfremstilling må følgelig enten graden av lufttilførsel styres nøyaktig eller mediet må tilføres vekst-fremmende tillegg, f.eks. ergosterol eller umettede fettsyrer som oleinsyre.

Den foreliggende oppfinnelse kjennetegnes ved

i) at det under anaerobiske betingelser og i et pH om-råde på 4-8 og et temperaturområde på 20-40°C i et første trinn dannes en biomasse inneholdende bakterien Zymomonas sam-tidig som det dannes etanol i en konsentrasjon som ikke inhiberer vesentlig dannelsen av Zymomonas-celler i et medium som inneholder en nitrogenkilde og en karbonkilde, og

ii) i et andre trinn og stort sett uten dannelse av Zymomonas-celler dannes etanol ved tilsetning av fermenterbart sukker til bakteriecellesuspensjonen som er dannet i trinn i), hvorved sukkerkonsentrasjonen i trinn ii) holdes på høyst 6% vekt/volum.

Et antall forskjellige stammer av Zymomonas kan anvendes, f.eks. ATCC 29191, ATCC 10988 etc. Til forskjell fra kjente fremgangsmåter foregår veksttrinnet ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen anaerobisk og ledsages av fremstillingen av etanol. Fermenteringstrinnet i Zymomonas mobilis-prosessen likner dette trinn i den kjente fremgangsmåte ved at begge foregår under anaerobiske betingelser. Men ved den bakterielle fremgangsmåte ifølge den foreliggende oppfinnelse er dannelsen av etanol stort sett uavhengig av vekst (dvs. dannelse av biomasse). Således omdannes ved fremstillingen av etanol fra en slik "hvilende kultur" bare en liten del av mediet til biomasse, og etanolfremstilling blir størst mulig. Det følger at dannelsen av etanol uten vekst ved bakterieprosessen kan oppnås på enkel måte ved tilsetningen av fermenterbart sukker, og dette system er derved i stand til å gi høyere alkoholnivåer enn den kjente fremgangsmåte. I den kjente fremgangsmåte hindrer høyere alkoholnivåer vekst og derved alkoholfremstil-ling idet denne foregår bare i en begrenset grad uten vekst.

Det vandige medium kan være enten et naturlig nærings-medium, et syntetisk kulturmedium eller et halvsyntetisk kulturmedium så lenge en egnet karbohydratkilde og de essensielle næringsstoffer for veksten av mikroorganismen er til stede. Selv om veksttrinnet i fremgangsmåten vanligvis anvendes for å danne tilstrekkelige mengder biomasse for driften av fermenteringstrinnet, kan biomassen også resirkuleres med ledsagende nedsettelse av de essensielle næringsstoffer som er nødvendige i prosessen.

Som karbonkilde for både vekst- og fermenteringstrinnene i fremgangsmåten kan det anvendes forskjellige karbohydrater. Karbohydratene omfatter f.eks. sukker som glukose, fruktose, sukrose, melasse, stivelseshydrolysat, cellulosehydrolysat etc. Disse substanser kan anvendes enten enkeltvis eller i blandinger av to eller flere.

Som nitrogenkilde kan det anvendes forskjellige typer uorganiske eller organiske salter eller forbindelser, f.eks. ammoniumsalter som ammoniumklorid, ammoniumsulfat, etc, eller naturlige stoffer som inneholder nitrogen, såsom gjærekstrakt, caseinhydrolysat, maisstøpevæske etc, eller aminosyrer som glytaminsyre. Disse substanser kan også anvendes enten enkeltvis eller i kombinasjoner av to eller flere.

Uorganiske forbindelser som kan tilsettes til kulturmediet omfatter magnesiumsulfat, kaliummonohydrogenfosfat, kaliumdihydrogenfosfat, natriumklorid, kalsiumklorid, jern-klorid, magnesiumklorid, sinksulfat, koboltklorid, kobber-klorid, borater, molybdater etc.

Organiske forbindelser som kan være ønskelige for anvendelse i fremgangsmåten omfatter f.eks. vitaminer som bio-tin, kalsiumpantotenat og liknende, eller organiske syrer som sitronsyre, eller aminosyrer som glutaminsyre.

Mikroorganismene kan dyrkes under de vanlig benevnte betingelser av enten satsvis eller kontinuerlig dyrking, med eller uten celleresirkulering i begge tilfeller. De foretrukne betingelser under dannelsen av biomassen er en temperatur på ca. 30°C og en pH på ca. 5,5. Det kan være ønskelig å tilsette visse pH-regulerende midler til mediet i løpet av fermenteringen av kulturen, såsom natriumhydroksyd, saltsyre eller liknende.

I det andre trinn, trinnt ii), fremstilles det ved fermentering et medium med høyt etanolinnhold. Ytterligere karbon i mengder slik at etanolsluttkonsentrasjonen når det ønskete nivå tilsettes til mediet som inneholder bakteriebiomassen. Karbonet kan tilsettes enten trinnvis eller kontinuerlig som en konsentrert løsning men må aldri overskride ca. 6%

(vekt/volum). De valg som er tilgjengelige som mulige karbon-kilder for fermentering er beskrevet under trinn i).

Fermenteringen kan utføres under satsvise eller konti-nuerlige prosessbetingelser, med eller uten cellesirkulering i begge tilfeller. Prosessparametre for god produksjon av etanol omfatter temperatur i området 20-40°C, pH i området 4-8, blanding av fermenteringsmediet og stort sett anaerobiske betingelser. Den foretrukne temperatur er 28-33°C, og den foretrukne pH er ca. 5,5. Det kan være nødvendig eller ønskelig å tilsette pH-regulerende midler som beskrevet under trinn i). Anaerobiske betingelser kan opprettholdes ved å boble en lang-som strøm av nitrogen gjennom mediet. Til sine tider kan ytterligere næringsstoffer som beskrevet under trinn i) tilsettes til fermenteringsbeholderen.

Oppfinnelsen vil bli ytterligere beskrevet i de etter-følgende eksempler.

Eksempel 1

1200 ml fermenteringsmedium, som hadde følgende sammen-

setning, ble anbrakt i en 2 liter fermenteringsbeholder:

10 ml podekultur av Zymomonas mobilis ATCC 29191 dyrket

i et medium av den ovenfor angitte sammensetning ble tilsatt til ovennevnte fermenteringsmedium. Dyrking ble utført ved en temperatur på 30°C med en nitrogenstrøm på ca. 14 liter per time inn i kulturen og under omrøring ved en hastighet på 300 omdr/min.

pH ble holdt på 5,5 med 2N KOH.

Etter 15 timer var veksten avsluttet med en konsentra-

sjon av bakterieceller på 4 g/l (tørrvekt) og etanolkonsentrasjonen på 4,65% (vekt/volum).

Etter at veksten var avsluttet, ble andre trinn i pro-

sessen påbegynt ved å pumpe ytterligere 340 g glukose løst i 600 ml vann inn i fermenteringsbeholderen over et tidsrom på 8,5 timer. Fullstendig anvendelse av sukkeret hadde inn-

truffet etter 9,5 timer. Etanolkonsentrasjonen ved slutten av det andre trinn var 11,6%.

Eksempel 2

12 liter av et fermenteringsmedium som hadde følgende sammensetning ble anbrakt i en 14 liter fermenteringsbeholder: Gl¥k'ose/in9vn n?h åa ^rtBafLio^ (vekt/volum) 50 ml podekultur av Zymomonas mobilis ATCC 29191 som var dyrket i et medium av den ovenfor angitte sammensetning ble tilsatt til ovennevnte fermenteringsmedium. Dyrking ble utført ved en temperatur på 30°C med en nitrogenstrøm inn i fermenteringsbeholderen og under omrøring ved en hastighet på 300 omdr/min. pH ble holdt på 5,5 med 8N KOH.

Etter at veksten var avsluttet ble bakteriecellene oppsamlet ved sentrifugering og resuspendert i friskt medium av den ovenfor angitte sammensetning, hvorved det ble oppnådd en bakteriecellekonsentrasjon på 20 g/l.

1200 ml av den konsentrerte bakteriecellesuspensjon ble anbrakt i en 2 liter fermenteringsbeholder. Trinn ii) i prosessen ble startet ved tilsetning av 32 ml av en 75 prosentig glukoseløsning til fermenteringsbeholderen. Ytterligere 450

ml av 75 prosentig glukose ble deretter pumpet inn i ferraen-teringsbeholderen i løpet av 2 timer. Utnyttelsen av sukkeret var fullstendig etter 2,5 timer, noe som ga en etanolkonsentrasjon på 10,1%.

Trinn ii) i prosessen ble gjentatt ytterligere fire ganger under anvendelse av bakterieceller som var dannet i et eneste trinn i) av prosessen. Hver gang de hadde passert gjennom trinn ii) ble bakteriecellene oppsamlet ved sentrifugering og resuspendert i 1200 ml friskt medium av den ovenfor angitte sammensetning. Glukose bleotilsatt på den ovenfor, beskrevne måte første gang cellene passerte gjennom trinn ii). I hver av de fire sykluser hvor samme biomasse ble anvendt var glukosen fullstendig oppbrukt etter 2,5 timer, hvorved det ble oppnådd en etanolkonsentrasjon på ca. 10% i hvert tilfelle.

Eksempel 3

Trinn i) i prosessen ble utført i en 740 ml fermenteringsbeholder som inneholdt 320 ml av fermenteringsmediet som er beskrevet i eksempel 2, og trinn ii) ble utført i en 2 liters fermenteringsbeholder som inneholdt 1740 ml av samme medium.

Fermenteringsmediet i trinn i) ble podet med 7 ml podekultur av Zymomonas mobilis ATCC 2 9191 dyrket i et medium av den sammensetning som er beskrevet i eksempel 2. Trinn ii)

ble podet med 12 ml av samme podekultur. Dyrking ble utført ved 30°C med en nitrogenstrøm inn i fermenteringsbeholderne og med en omrøringshastighet på 300 omdr/min. pH i hver fermenteringsbeholder ble holdt på 5,5 med 2N KOH.

Etter at veksten var avsluttet ble det anvendt to pumper for å gjøre systemet kontinuerlig. Den første pumpe tilførte sterilt medium som inneholdt 12,6% glukose (andre bestanddeler som i eksempel 2) med en strømningshastighet på 78 ml/h. Under disse betingelser var bakteriecellekonsentrasjonen i fermenteringsbeholderen i trinn i) 4,5 g/l, etanolkonsentrasjonen var 5,3%, og glukoserestkonsentrasjonen var 0,6%. Volumet av fermenteringsmediet i trinn i) ble holdt på 320 ml ved stadig å overføre kulturen til fermenteringsbeholderen for trinn ii) med en strømningshastighet på 78 ml/h. Den andre pumpe tilførte en steril 70 prosentig glukoseløsning til fermenteringsbeholderen for trinn ii) med en strømningshastighet på 24 ml/h, noe som ga en total strømning inn i og ut av fermenteringsbeholderen på 120 ml/h. Under disse betingelser var bakteriecellekonsen-tras jonen i fermenteringsmediet i trinn ii) 4,4 g/l, etanol-konsentras jonen var 9,9%, og glukoserestkonsentrasjonen var 1,2%..

Eksempel 4

I dette eksempeL ble Zymomonas mobilis ATCC 29191 dyrket

i to fermenteringsbeholdere som ble drevet anbrakt etter hver-andre på tilsvarende måte som beskrevet i eksempel 3. I dette

eksempel ble imidlertid biomassen i mediet fra den andre fermenteringsbeholder beholdt og ført tilbake til den andre fermenteringsbeholder. Biomasseresirkulering til den andre fermenteringsbeholder ble oppnådd ved å kontinuerlig føre innholdene gjennom en "Pellicon Ultrafilter Cassette" som inneholdt ca. 0,56 m 2 Millipore-filtre av type HA. Kulturmediet som ble anvendt i dette eksempel hadde samme sammensetning som i eksempel 2 og 3 med unntagelse av at gjærekstrakten var 0,5% (vekt/volum). Det konstante volum i den første fermenteringsbeholder (trinn i)) var 1600 ml. Det ble tilført kulturmedium som inneholdt glukose (131 g/l) med en konstant hastighet på 414 ml/h. Temperatur og pH ble holdt på henholdsvis 30<C>C og 5,5. Den konstante konsentrasjon av biomasse i den- første fermenteringsbeholder var 4,4 g tørrvekt/1, og etanolkonsentrasjonen var 5,1% (vekt/volum).

Mediet fra den første fermenteringsbeholder ble matet kontinuerlig og direkte til en andre fermenteringsbeholder som ble drevet ved et konstant volum på 760 ml. En løsning av 60% vekt/ volum glukose ble pumpet inn i den andre fermenteringsbeholder med en konstant hastighet på 120 ml/h. Mediet fra den andre fermenteringsbeholder ble ledet gjennom et filtreringssystem, og cellene ble ført tilbake til den andre fermenteringsbeholder. Biomassekonsentrasjonen i den andre fermenteringsbeholder var 48 g tørrvekt/1 og ble holdt forholdsvis konstant ved fjerning av biomasse med en hastighet på ca. 27 ml/h. Etanolkonsentrasjonen i det cellefrie filtrat som forlot systemet var 10,4% vekt/volum, og sukkerrestkonsentrasjonen var 1,7%. Drift av totrinnssystemet ved et høyere biomassenivå i den andre fermenteringsbeholder som en følge av filtrering av mediet og biomasseresirkulering resulterte i en økt etanolproduktivitet i den andre fermenteringsbeholder (produkt produsert pr. volum-enhet og tidsenhet).

Claims (11)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av etanol ved hjelp av fermentering, i et vandig medium, hvor en bakterie av slekten Zymomonas, som er i stand til å danne etanol, dyrkes i to trinn for derved å øke etanolkonsentrasjonen i fermenteringsmediet over etanolkonsentrasjonen i et fermenteringsmedium frembrakt ved dyrking av bakterien i ett trinn, karakterisert vedi) at det under anaerobiske betingelser og i et pH om-råde på 4-8 og et temperaturområde på 20-40°C i et første trinn dannes en biomasse inneholdende bakterien Zymomonas sam-tidig som det dannes etanol i en konsentrasjon som ikke inhiberer vesentlig dannelsen av Zymomonas-celler i et medium som inneholder en nitrogenkilde og en karbonkilde, og ii) i et andre trinn og stort sett uten dannelse av Zymomonas-celler dannes etanol ved tilsetning av fermenterbart sukker til bakteriecellesuspensjonen som er dannet i trinn i), hvorved sukkerkonsentrasjonen i trinn ii) holdes på høyst 6% vekt/volum.

2. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1, karakterisert ved at bakteriecellene fremstilles i et mineralsaltmedium som inneholder NH^<+->ioner som eneste nitrogenkilde, eller i et slikt medium supplementert med en organisk nitrogenkilde.

3. Fremgangsmåte i samsvar med krav 2, karakterisert ved at karbonkilden for bakteriecelle-og etanolfremstillingen er glukose, fruktose eller sukrose, en blanding av disse sukker eller flere av disse sukker.

4. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1, karakterisert ved at de to trinn av fremgangsmåten utføres i samme fermenteringsbeholder ved kontinuerlig tilsetning av det fermenterbare sukker etter avslutning av bakteriecelledannel-sen.

5. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1, karakterisert ved at de to trinn i fremgangsmåten utføres i samme fermenteringsbeholder ved intermitterende tilsetning av det fermenterbare sukker etter avslutning av bakteriecelle-dannelsen.

6. Fremgangsmåte i samsvar med krav 4 eller 5, karakterisert ved at bakteriecellene oppsamles ved slutten av det andre trinn av fremgangsmåten og resuspenderes i en løsning av fermenterbart sukker, og at bakteriecellene føres tilbake til trinn ii).

7. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1, karakterisert ved at de to trinn i fremgangsmåten utføres i to fermenteringsbeholdere hvor bakteriecellene som fremstilles ved kontinuerlig dyrking i den første fermenteringsbeholder overføres kontinuerlig til den andre fermenteringsbeholder med konstant volum, noe som muliggjør fullstendig anvendelse av en kontinuerlig tilførsel av det fermenterbare sukker som er nød-vendig for det andre trinn i fremgangsmåten.

8. Fremgangsmåte i samsvar med krav 7, karakterisert ved at en del av bakteriecellene fra den andre fermenteringsbeholder fjernes ved kontinuerlig filtrering eller sedimentasjon og føres tilbake til trinn ii).

9. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1, karakterisert ved at Zymomonas mobilis ATCC 29191 anvendes som mikroorganismestamme.

10. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1, karakterisert ved at Zymomonas mobilis ATCC 10988 anvendes som mikroorganismestamme.

11. Fremgangsmåte i samsvar med et av de foregående krav, karakterisert ved at bakteriecelle- og etanolfremstillingen utføres ved en pH på ca. 5,5 og i et temperaturområde på 28-33°C.