JPH10316702A

JPH10316702A - 微生物由来のキトサンおよびその製造方法

Info

Publication number: JPH10316702A
Application number: JP13227197A
Authority: JP
Inventors: Sukeji Ono; 典司大野; Akio Tomomatsu; 昭雄友松; Junichi Suzuki; 順一鈴木
Original assignee: Rengo Co Ltd
Current assignee: Rengo Co Ltd
Priority date: 1997-05-22
Filing date: 1997-05-22
Publication date: 1998-12-02

Abstract

(57)【要約】【解決手段】ユミケカビ属糸状菌を培地中で培養し、
得られる培養菌体を熱苛性処理してキトサンを採取する
ことを含むキトサンの製造方法であって、本培養中の培
養液中溶存酸素濃度が１〜６ｐｐｍであることを特徴と
する方法。また、１００ｃＰ以上の粘度を有するユミケ
カビ属糸状菌由来キトサン。【効果】本発明の方法によれば、微生物から高分子量
のキトサンを高い生産効率で製造することができ、高品
質のキトサンを安価に且つ安定に供給することが可能と
なる点で有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、微生物培養による
キトサンの製造方法およびそれによって得ることができ
る高分子量の微生物由来キトサンに関する。

【０００２】

【従来の技術】キトサンは、カニ、エビなどの甲殻類や
昆虫類の外骨格を構成するセルロース様高分子化合物で
あるキチンのＮ−脱アセチル化物である。現在、地球上
で毎年１０００億ｔものキチンおよびキトサンが生産さ
れており、セルロースに次ぐ巨大なバイオマスとして注
目されている。キトサンはアミノ基を持つため、イオン
交換体、固定化酵素やクロマトグラフィーの担体、重金
属吸着剤、核酸やエンドトキシン等の各種酸性物質の除
去剤として、また、生分解性であるため、カチオン系汚
泥凝集剤として用いられている。さらに、近年、高付加
価値の新たな用途が拓けてきている。すなわち、キトサ
ンは反応性に富んだアミノ基を持つので化学修飾による
分子設計が行いやすく、各種誘導体への出発物質として
重要視されており、また、生体適合性がよく毒性もない
ので手術用縫合糸や人工皮膚の素材として利用されてい
る。

【０００３】一方、最近はキトサンの食物繊維としての
有用性が注目されてきており、その多くの生理機能（例
えば、血中コレステロール改善作用、腸内代謝改善作
用、血圧上昇抑制作用、免疫増強作用等）を活用した機
能性食品の開発が進められている。この場合の食品用機
能性素材としてのキトサンは、その分子量（一般には一
定濃度のキトサン溶液の粘度を指標とする）、並びに脱
アセチル化度等がきわめて重要な因子となる。これらに
関して、（財）日本健康・栄養食品協会によりキトサン
食品の規格基準が定められている。

【０００４】従来、キトサンの工業的生産は、カニやエ
ビ等の甲殻類の外骨格を希酸で脱灰およびアルカリで除
タンパクして、単離したキチンを濃アルカリ中で熱処理
して脱アセチル化することにより行われてきた。しかし
ながら、この方法では、原料の供給が年度や季節に左右
されやすく、また、濫獲による生物資源の枯渇を招く恐
れもある。さらに、漁獲の時期等によって原料の品質が
大きく変動するため、一定品質の原料を安定に供給する
ことはきわめて困難である。また、キチンを脱アセチル
化する工程等で大量に生じるアルカリ性の廃水は、生化
学的酸素要求量（Biochemical Oxygen Demand; BOD）が
高く、周辺環境を汚染する原因となり好ましくない。そ
のために、多大な廃水処理工程が必要となり、結果とし
て生産コストが高くなるといった問題がある。したがっ
て、品質の安定したキトサンを常時効率良く生産するこ
とができ、しかも周辺環境への悪影響の少ないキトサン
の製造方法の開発が望まれていた。

【０００５】かかる要望に対する一つの答えとして、微
生物によるキトサンの発酵生産が試みられている。ある
種の微生物や菌類の中には、細胞壁中にキチンとともに
相当量のキトサンを含むものがある。例えば、ケカビ科
（Mucoraceae）に属する糸状菌の細胞壁にキトサンが多
量に含まれていることは、Bartnicki-Garcia, Ann. Re
v. Microbiol., 22: 87 (1968) に既に記載されてい
る。朴らは、この性質に着目して、ケカビ科に属するア
ブシディア・コエルレア（Absidia coerulea）を培養
し、得られる培養菌体からキトサンを単離精製する方法
を開発した（特開平５−１９９８９２号公報）。

【０００６】しかしながら、これまでに報告されている
微生物培養によるキトサンの製造方法は、いずれも生産
効率が低いために、除タンパク工程で激しい熱苛性処理
を行うことによりできるだけ収率の向上を図る必要があ
った。そのため、結果として得られるキトサンは、粘度
がせいぜい１０〜２０ｃＰ程度であり、「（財）日本健
康・栄養食品協会の定めるキトサン食品規格基準」であ
る１００ｃＰ以上の粘度を有する高分子量のキトサン
は、発酵法によっては未だに得られていないのが現状で
ある。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的は、生産効率が高く且つ高分子量のキトサンを得る
ことができる、微生物由来のキトサンの製造方法を提供
することである。また、本発明のもう一つの目的は、前
記キトサン食品規格基準に見合う高分子量の微生物由来
キトサンの提供である。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の目
的を達成すべくアブシディア・コエルレアを種々の培養
条件で培養し、キトサン生産に好適な条件を検討した。
一般に、糸状菌の通気攪拌培養では、胞子または菌糸核
の接種量が多いとパルプ状の菌糸体を形成するために培
養液の粘度が上がり、結果的に増殖速度の低下を招くと
いわれている。また、アブシディア・コエルレアの通気
攪拌培養において、攪拌速度を高くすると高い剪断力が
生じて菌糸の増殖に悪影響を与えるために、キトサン収
量が減少するとの報告がある。したがって、キトサンの
生産性を増大させるには、比較的穏和な通気攪拌条件で
培養するのが好ましいと一般に考えられていた。

【０００９】これに対し、本発明者らは、比較的高密度
となるようにアブシディア・コエルレアの胞子または菌
糸核を接種しても、高攪拌速度条件下で培養することに
より、菌糸は一定の大きさのペレット状の凝集体を形成
し、その結果、意外にも従来法よりも高いキトサン生産
効率が得られることを見出した。さらに、除タンパク工
程で穏和な熱苛性処理を行うことにより、従来法よりも
なお数倍高い生産性を維持したまま、微生物由来として
は初めて１００ｃＰ以上の粘度を有する高分子量キトサ
ンを製造することに成功して本発明を完成するに至っ
た。

【００１０】すなわち、本発明は以下に示す通りのもの
である。（１）ユミケカビ属（Absidia ）に属する糸状菌を培地
中で培養し、得られる培養菌体を熱苛性処理してキトサ
ンを採取することを含むキトサンの製造方法であって、
本培養中、菌体の対数増殖期における培養液中の最少溶
存酸素量が１〜６ｐｐｍであることを特徴とする方法。（２）本培養開始時に、該糸状菌の胞子または菌糸核を
培地１００ｍｌあたり５×１０⁵〜５×１０⁷個となる
ように接種することを特徴とする上記（１）のキトサン
の製造方法。（３）培養菌体を、０．８〜１．５ｗ／ｖ％のＮａＯＨ
で、９０〜１０５℃、３０〜９０分間熱苛性処理するこ
とを特徴とする上記（１）または（２）のキトサンの製
造方法。（４）１００ｃＰ以上の粘度を有することを特徴とする
ユミケカビ属糸状菌由来キトサン。

【００１１】

【発明の実施の形態】本発明で用いられるキトサン生産
菌は、細胞壁構成成分として相当量のキトサンを含むも
のであれば特に限定されず、天然から分離されるものだ
けでなく、人為的にキトサン生産性を高めるように操作
された変異体もしくは組換え体をも包含する。好ましく
は、ユミケカビ属（Absidia ）やクモノスカビ属（Rhiz
opus）に属する糸状菌、より好ましくは、ユミケカビ属
糸状菌、就中アブシディア・コエルレアが例示される。
アブシディア・コエルレアに属する幾つかの菌株は、財
団法人発酵研究所（大阪市淀川区十三本町２−１７−８
５）より一般に入手することができる（例えば、Absidi
a coerulea IFO 5301 およびAbsidia coerulea IFO 443
5 ）。

【００１２】本発明のキトサンは、同化し得る炭素源お
よび窒素源を含む培地に、上記糸状菌の胞子、胞子を発
芽させて得た菌糸または菌糸をワーリングブレンダー等
で物理的に切断して調製される菌糸核を接種し、好まし
くは、例えば通気攪拌培養等の好気条件下に培養するこ
とにより産生することができる。

【００１３】培地中の好ましい炭素源は、グルコース、
フルクトース、グリセロール、デンプン等であり、これ
らは単独で、または複数を組み合わせて使用することが
できる。その他にラクトース、アラビノース、キシロー
ス、デキストリン、糖蜜等が含まれていてもよい。

【００１４】窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、
麦芽エキス、コーンスティープリカー（ＣＳＬ）、グル
テン粉、綿実粉、大豆粉、乾燥酵母、尿素、アミノ酸等
の有機窒素化合物、およびアンモニウム塩（硫酸アンモ
ニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなど）
等の無機窒素化合物が例示される。これらは単独でも、
複数を組み合わせて使用してもよい。経済性およびキト
サン生産性を考慮すると、安価なＣＳＬおよび無機窒素
化合物等を主要窒素源として、高価な酵母エキス、ペプ
トン等を含まない培地がより好ましい。

【００１５】上に例示した炭素源および窒素源は、純粋
な形で使用する必要はない。むしろ純度の低い物質に
は、微量の成長因子や相当量の無機栄養素が含まれてお
り、使用に適している場合が多い。

【００１６】さらに、所望により、炭酸カルシウム、リ
ン酸カリウムまたはリン酸ナトリウム、ヨウ化カリウム
またはヨウ化ナトリウム、塩化カリウムまたは塩化ナト
リウム、硫酸マグネシウム、塩化コバルト等の無機塩類
を添加することもできる。また、培養液が発泡する場合
には、必要に応じて液体パラフィン、高級アルコール、
植物油、ミネラル油またはシリコン等の消泡剤を添加し
てもよい。

【００１７】大型発酵タンク内で大量生産させる場合に
は、キトサン生産工程における生育遅延を回避するため
に、また、必要胞子数を低減させるために、胞子を発芽
させて菌糸シード調製し、これを発酵タンク中に接種す
ることが好ましい。すなわち、まず比較的少量の培地に
胞子または菌糸核を接種して培養（前培養）し、対数増
殖期にある前培養体（菌糸がパルプ状に増殖している場
合にはワーリングブレンダー等で物理的に切断して菌糸
核として）の全部または一部を無菌的に発酵タンク中に
接種して培養（本培養）するのがより効率的である。前
培養は１回または徐々にスケールアップしながら複数回
行うことができる。フラスコ培養等の少量生産の場合
は、前培養を行わずに直接本培養を行ってもよい。

【００１８】前培養に用いる培地と本培養に用いる培地
は、炭素源、窒素源および他の培地成分の混合比が実質
的に同一であるか、あるいは若干異なってもよいが、本
培養培地の基質濃度は、培養液単位容積あたりのキトサ
ン生産量を増大させるために、前培養培地の基質濃度よ
りも高いことが好ましい。より好ましくは、前培養培地
の基質濃度の約５〜１０倍程度であり、具体的には、炭
素源が約５〜１０％程度である。必要以上に培地の基質
濃度を高めると、基質阻害により逆にキトサン生産量の
低下を引き起こすので望ましくない。

【００１９】前培養培地および本培養培地のｐＨは、通
常ｐＨ約４〜７、好ましくはｐＨ約５〜６．５の範囲で
ある。前培養および本培養は、通常２０〜３３℃、好ま
しくは２５〜３０℃程度の温度条件で、１〜３日間行わ
れるが、これらは培養条件および培養の規模に応じて適
宜変化させてもよい。

【００２０】培養液の攪拌および通気は種々の方法によ
り行うことができる。攪拌はプロペラまたはそれに類似
した機械的攪拌装置、培養器の回転、振盪、種々のポン
プ装置または滅菌空気の培養液中の通過により行えばよ
い。また、通気は滅菌空気を培養液中を通過させること
により行えばよい。本発明の方法においては、本培養
中、菌体の対数増殖期において、培養液中のＤＯ値を常
時１〜６ｐｐｍ、好ましくは２〜５ｐｐｍの範囲で維持
することにより、高いキトサン生産効率が得られる。Ｄ
Ｏの調整は、通常、通気量および／または攪拌速度を変
化させることにより行われるが、上記の好ましいＤＯ値
は、培養中、例えば５ｌ容ジャーファーメンターを用い
た培養では、通気量を０．５〜１．５ｖｖｍ、攪拌速度
を５００〜１０００ｒｐｍ、好ましくは６００〜９００
ｒｐｍに保つことにより達成することができる。もし、
培養液中のＤＯ値が１ｐｐｍ未満となるような通気攪拌
条件とした場合には、菌糸は繊維状（パルプ状）に増殖
し、培養液の粘度が高くなり、その結果糖消費が著しく
遅延してキトサン生産効率は大幅に低下する。また仮
に、培養液中のＤＯ値が６ｐｐｍを超えるような通気攪
拌条件とした場合には、高い剪断力により菌糸の増殖は
抑制され、キトサン生産性は低下する。

【００２１】本培養は、回分培養に限らず、培養中に制
限基質である炭素源や窒素源または新鮮な培地を追加す
る半回分培養、反復回分培養、反復半回分培養または連
続培養等を用いることもできる。

【００２２】本培養終了後、得られた培養液を濾過およ
び／または遠心分離して菌体を回収した後、強アルカ
リ、特にＮａＯＨを加えて熱苛性処理することにより夾
雑タンパク質が変性除去される。アルカリとしてＮａＯ
Ｈを使用する場合、菌体を０．５〜２ｗ／ｖ％、好まし
くは０．８〜１．５ｗ／ｖ％のＮａＯＨ溶液中、８５〜
１１５℃、好ましくは９０〜１０５℃で３０〜９０分間
処理すればよい。具体的には、例えば１ｗ／ｖ％のＮａ
ＯＨ溶液中、１００℃で６０分間の熱処理、等である。
熱苛性処理後、０．５〜５ｗ／ｖ％の酢酸で抽出し、不
溶性成分を遠心分離および／または濾過により除去した
後、上清をＮａＯＨ等のアルカリ溶液を用いて弱アルカ
リ性にすることによりキトサンを析出させる。析出した
キトサンは遠心分離および／または濾過により回収され
る。

【００２３】本発明の糸状菌由来キトサン、特にユミケ
カビ属由来のキトサンは、１００ｃＰ以上の粘度および
８５％以上の脱アセチル化度を有することを特徴とす
る。従来得られている微生物由来キトサンの粘度はせい
ぜい１０〜２０ｃＰ程度であり、本発明のキトサンは従
来の微生物由来キトサンに比して分子量が非常に高い極
めて高品質のキトサンである。本発明のキトサンは上記
の製造方法により得ることができるが、製法はそれに限
定されるものではない。

【００２４】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明
するが、これらは単なる例示であって本発明を何ら限定
するものではない。

【００２５】実施例１キトサン生産効率に及ぼす培養
液中溶存酸素濃度の効果５００ｍｌ容三角フラスコ２本に、それぞれ前培養培地
（１ｗ／ｖ％グルコース，０．０５ｗ／ｖ％酵母エキ
ス，０．５％ペプトン，０．２５％硫酸アンモニウム，
０．０５％リン酸水素二カリウム，０．０５％塩化ナト
リウム，０．０５％硫酸マグネシウム７水和物，０．０
０１％塩化カルシウム２水和物）１００ｍｌを入れ、加
熱滅菌後、アブシディア・コエルレアＩＦＯ４４３５株
の胞子５×１０⁷個を接種した。これらを回転振盪器を
用いて２５℃、２５０ｒｐｍで２４時間培養して前培養
体２００ｍｌを得た。一方、本培養培地（１０ｗ／ｖ％
グルコース，６％ＣＳＬ，２％硫酸アンモニウム，０．
５％リン酸水素二カリウム，０．２５％硫酸カリウム，
０．２％硫酸マグネシウム７水和物，０．００２５％塩
化カルシウム２水和物）３ｌを、５ｌ容ジャーファーメ
ンター（ミツワ理化学工業社製，ＫＭＪ−５Ｂ型；攪拌
羽根：１／２Ｄ６枚平羽根タービン型攪拌羽根２段，邪
魔板４枚付）に入れ、高圧滅菌した。該本培養培地に上
記前培養体２００ｍｌを接種し、下記の４種の通気攪拌
条件下、培地ｐＨを５．５に自動制御しながら２９℃で
３３〜５０時間培養した（残存糖濃度が０％になり、ｐ
Ｈが上昇し始めた時点で培養を終了した）。条件１：通気量３ｌ／分，攪拌速度５００ｐｐｍ条件２：通気量１．５ｌ／分，攪拌速度６００ｐｐｍ条件３：通気量３ｌ／分，攪拌速度７５０ｐｐｍ条件４：通気量３ｌ／分，攪拌速度１０００ｐｐｍ培養液中のＤＯ値は、本培養中連続的にモニタリングし
た。本培養終了後、菌体を回収し、２ｗ／ｖ％ＮａＯＨ
を加えて１１５℃で１時間熱苛性処理を行った後、２ｗ
／ｖ％酢酸で抽出した。不溶性成分を遠心分離および濾
過により除去した後、上清にＮａＯＨを加えて弱アルカ
リ性にすることによりキトサンを析出させた。遠心分離
により析出したキトサンを回収し、水洗後凍結乾燥して
収量を測定した。その結果を表１に示す。

【００２６】

【表１】

【００２７】通気量１．５ｌ／分、攪拌速度６００ｒｐ
ｍの場合、培養開始４０時間後に残存糖濃度が０％とな
り、この時点で培養を終了した。一方、ＤＯ値は、菌糸
が増殖し、糖消費が始まる培養開始約６時間後以降徐々
に低下し始め、糖濃度が初濃度の約半分になる培養開始
２７時間後に最低の２．２４ｐｐｍを示した。しかし、
その後菌糸がペレット状の凝集体を形成すると、おそら
くペレット内部での酸素消費が低下するためにＤＯ値は
徐々に上昇し、培養終了時には４ｐｐｍにまで回復し
た。他の通気攪拌条件においてもＤＯ値は同様に推移
し、最小ＤＯ値は攪拌速度にほぼ比例的に変化した。最
小ＤＯ値が１．５９〜５．５ｐｐｍの範囲でキトサン生
産速度は０．１７８〜０．２６１ｇ／ｌ・時間であり、
従来報告されているより数倍高い生産効率を示した。

【００２８】さらに、各通気攪拌条件で得られたキトサ
ンの粘度および脱アセチル化度を測定した。０．５ｗ／
ｖ％酢酸にキトサンを０．５ｗ／ｖ％となるように溶
解、攪拌後、２０℃でＢ型粘度計（東京計器製，ＢＬ
型）を用いて回転粘度を測定した。同じ溶液を用いてコ
ロイド滴定法により脱アセチル化度を測定した。その結
果を表２に示す。

【００２９】

【表２】

【００３０】いずれの条件においても得られたキトサン
は８５％以上の脱アセチル化度を有していた。また、キ
トサンの粘度は攪拌速度が小さいほど高値を示したが、
５００ｒｐｍでも６８ｃＰの粘度に留まった。

【００３１】比較例１従来の通気攪拌条件での培養に
おける培養液中溶存酸素濃度の変化本培養時の通気量を３ｌ／分、攪拌速度を３００ｒｐｍ
とする以外は、すべて実施例１と同一の条件で培養を行
った。その結果、菌糸はパルプ状に増殖して培養液中の
ＤＯ値は徐々に低下し、培養開始１８時間後には０ｐｐ
ｍとなり、その後も再上昇はみられなかった。培養開始
７０時間後に残存糖濃度を測定したところ８％を示し、
糖消費がほとんど進行していないことがわかったので、
この時点で培養を中止した。

【００３２】実施例２キトサン生産効率およびキトサ
ン粘度に及ぼす熱苛性処理の効果本培養培地のＣＳＬ濃度を８％、本培養培地への前培養
体の接種量を１５０ｍｌ、培養時間を５１時間とした以
外は、すべて実施例１の条件２と同一の条件で培養を行
った。本培養終了後培養菌体を回収し、表３に記載の処
理１〜１７の各条件でそれぞれ熱苛性処理を行った後、
実施例１と同様の抽出および析出工程を経てキトサン凍
結乾燥品を得た。収量測定後、実施例１と同様の方法に
より各キトサンの粘度および脱アセチル化度を測定し
た。その結果を同じく表３に示す。２％ＮａＯＨで１１
５℃、１時間処理した時（処理１）、キトサン収量は最
大となるが、逆にキトサンの粘度は３４ｃＰで最低であ
った。一方、１％ＮａＯＨで１００℃、１時間処理した
時（処理９）、キトサン収量は前者に比して１５％減少
したものの、なお従来報告されているよりも１．５倍〜
数倍高い生産効率を示し、しかも１２３ｃＰの粘度を有
するより高分子量のキトサンが得られた。

【００３３】

【表３】

【００３４】実施例３実施例１の条件２および条件３での培養により得られた
それぞれの培養菌体を、熱苛性処理を実施例２の処理９
の条件に変えて行う以外は、すべて実施例１と同様に処
理してキトサン凍結乾燥品を得た。収量を測定した後、
実施例１と同様の方法で各キトサンの粘度および脱アセ
チル化度を測定した。その結果を表４に示す。実施例１
での結果と比較すると、キトサン生産効率は約９〜１４
％減少するが、キトサンの粘度は約２〜３倍となり、１
００ｃＰ以上の高分子量キトサンが得られた。

【００３５】

【表４】

【００３６】実施例４キトサン生産効率に及ぼす菌体
接種量の効果５００ｍｌ容三角フラスコに培地（２ｗ／ｖ％グルコー
ス，０．１％酵母エキス，１％ペプトン，０．５％硫酸
アンモニウム，０．１％リン酸水素二カリウム，０．１
％塩化ナトリウム，０．１％硫酸マグネシウム７水和
物，０．０１％塩化カルシウム２水和物）１００ｍｌを
入れ、加熱滅菌後、アブシディア・コエルレアＩＦＯ４
４３５株の胞子を１×１０⁶〜１×１０⁹個の範囲で変
化させて接種し（Ｓ１）、それぞれ回転振盪器中２５
℃、２５０ｒｐｍで２４時間培養した。各培養液（一次
培養体）の一部をそれぞれ同じ培地１００ｍｌの入った
別の５００ｍｌ容三角フラスコに植え継ぎ（Ｓ２）、２
５℃、２５０ｒｐｍで７２時間培養して二次培養体を得
た。それぞれについて菌糸の増殖を観察したところ、接
種量が多くなるにしたがって菌糸はより小さなペレット
状の凝集体を形成して増殖し、Ｓ２における培地１００
ｍｌあたりの接種量が５×１０⁵〜５×１０⁷個の時、
菌糸は直径１ｍｍ以下のペレットとなった。しかし、接
種量が５×１０⁷個を超えると菌糸はパルプ状に増殖し
た。二次培養体を、実施例１と同様の熱苛性処理、抽出
および析出工程を経てキトサン凍結乾燥品を得、収量を
測定した。その結果、Ｓ２における培地１００ｍｌあた
りの接種量が５×１０⁵〜５×１０ ⁷個の時に最大のキ
トサン生産速度が得られた（図１）。

【００３７】実施例５２段階前培養法５００ｍｌ容三角フラスコに実施例１と同一の前培養培
地１００ｍｌを入れ、加熱滅菌後、アブシディア・コエ
ルレアＩＦＯ４４３５株の胞子を２×１０⁸個接種し、
回転振盪器中２５℃、２５０ｒｐｍの条件で２４時間培
養した。得られた前培養体（一次前培養体）の一部を同
じ前培養培地１００ｍｌの入った別の５００ｍｌ容三角
フラスコ２本にそれぞれ植え継ぎ、２５℃、２５０ｒｐ
ｍの条件で２４時間培養して二次前培養体２００ｍｌを
得た。このうち１５０ｍｌを実施例１と同一の本培養培
地３ｌに接種し、２９℃、ｐＨ５．５、通気量１．５ｌ
／分、攪拌速度６００ｒｐｍの条件で５２時間培養し
た。培養液中のＤＯ値は、本培養中３．０４ｐｐｍまで
低下し、その後上昇した。本培養終了後、培養液を２分
し、それぞれ実施例１および実施例３と同様に熱苛性処
理、抽出および析出工程を行ってキトサンを得た。収量
測定後、それぞれについて実施例１と同様の方法により
キトサンの粘度および脱アセチル化度を測定した。その
結果を表５に示す。キトサン生産速度、キトサン粘度、
脱アセチル化度のいずれについても前培養１回の場合と
同様の傾向を示した。

【００３８】

【表５】

【００３９】実施例６多段階前培養法５００ｍｌ容三角フラスコに実施例１と同一の前培養培
地１００ｍｌを入れ、加熱滅菌後、アブシディア・コエ
ルレアＩＦＯ４４３５株の胞子を５×１０⁷個接種し、
回転振盪器中２５℃、２５０ｒｐｍの条件で７２時間培
養したところ、菌糸はパルプ状に増殖した。得られた一
次前培養体をワーリングブレンダーを用いて切断、菌糸
核を調製し、その一部を同じ前培養培地の入った別の５
００ｍｌ容三角フラスコに植え継ぎ、同じ条件で７２時
間培養した。この操作をさらに２回繰り返して四次前培
養体を得た。この中に含まれる菌糸核数を計測したとこ
ろ、１００ｍｌあたり約１×１０⁸個であった。四次前
培養体２００ｍｌを、実施例１と同一の本培養培地３ｌ
に接種し（本培養開始時の菌糸核密度が約６×１０ ⁶個
／１００ｍｌとなる）、２９℃、ｐＨ５．５、通気量３
ｌ／分、攪拌速度７５０ｒｐｍの条件で２９時間培養し
た。培養液中のＤＯ値は、本培養中３．７８ｐｐｍまで
低下し、その後上昇した。本培養終了後、菌体を回収し
て実施例１と同様に熱苛性処理、抽出および析出工程を
行ってキトサンを得た。その結果、培養液１ｌあたりの
キトサン収量は１０．１ｇであり、これは乾燥菌体量の
２５．２％に相当した。キトサン生産速度は０．３４８
ｇ／ｌ・時間で、前培養１回の場合に比べて３割程度生
産効率が向上した。収量測定後、実施例１と同様の方法
によりキトサンの粘度および脱アセチル化度を測定し
た。その結果、キトサンの粘度は５４ｃＰ、脱アセチル
化度は８８．７％であった。

【００４０】

【発明の効果】本発明の方法によれば、従来よりも数倍
高い効率で、しかも１００ｃＰ以上の粘度を有する高分
子量のキトサンを微生物から製造することができる。し
たがって、本発明の方法は、高品質のキトサンを安価に
且つ安定に供給する手段を提供する点で極めて有用であ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】アブシディア・コエルレアＩＦＯ４４３５株菌
糸核接種量とキトサン生産速度との相関を示す図であ
る。

フロントページの続き (72)発明者鈴木順一福井県坂井郡金津町自由ヶ丘１丁目８番10 号レンゴー株式会社金津化学品バイオ工場内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ユミケカビ属（Absidia ）に属する糸状
菌を培地中で培養し、得られる培養菌体を熱苛性処理し
てキトサンを採取することを含むキトサンの製造方法で
あって、本培養中、菌体の対数増殖期における培養液中
の最少溶存酸素量が１〜６ｐｐｍであることを特徴とす
る方法。
【請求項２】本培養開始時に、ユミケカビ属に属する
糸状菌の胞子または菌糸核を培地１００ｍｌあたり５×
１０⁵〜５×１０⁷個となるように接種することを特徴
とする請求項１記載のキトサンの製造方法。
【請求項３】培養菌体を、０．８〜１．５ｗ／ｖ％の
ＮａＯＨで、９０〜１０５℃、３０〜９０分間熱苛性処
理することを特徴とする請求項１または２記載のキトサ
ンの製造方法。
【請求項４】１００ｃＰ以上の粘度を有することを特
徴とするユミケカビ属糸状菌由来キトサン。